溶栓治疗对急性心肌梗死患者中性粒细胞表面补体含量的影响
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2001年10月4日
免疫组织化学方法证实在梗死的心肌组织有膜攻击复合物C5b-9沉积[1]。急性心肌梗死患者血清中激活的补体片段浓度升高[2]。这些研究表明，急性心肌梗死伴随着补体系统的激活。近年来又发现溶栓治疗可以进一步激活急性心肌梗死患者的补体系统[3～6]。激活的补体系统至少通过两条途径损害心肌细胞[7]：一是复合物C5b-9结合并攻击心肌细胞膜；二是激活中性粒细胞和损伤血管内皮细胞引起再灌注损伤。但是，目前仍不清楚溶栓后补体系统的活化能否增加循环系统中性粒细胞表面的补体含量而引起中性粒细胞的激活。因此，我们应用免疫荧光技术和流式细胞术，测定急性心肌梗死患者静脉溶栓后沉积于中性粒细胞表面的补体片段C3c含量的动态变化。
方 法
一、病例选择
16例无明显心衰和心源性休克的急性心肌梗死患者(AMI组)，男14例，女2例，年龄(61±5)岁，胸痛至入院的时间为2～24 h(7 h±5 h)。急性心肌梗死的诊断依据是典型的临床表现，心电图出现新的异常Q波或ST段抬高以及心肌酶升高(CK大于正常上限2倍)。无溶栓禁忌证者在胸痛6 h内入院，或超过6 h但仍有明显胸痛或ST段显著抬高且相关导联有明显A波者给予溶栓治疗。6例用链激酶(SK 150万U/60 min)，4例用重组型纤溶酶原激活剂(r-TPA 50 mg/60 min)，6例用尿激酶(UK 100万～150万U/60 min)静脉溶栓。其他治疗包括阿司匹林、β阻滞剂、硝酸酯类和血管紧张素转化酶抑制剂等。三组患者均无感染、恶性肿瘤或自身免疫性疾病的证据。18例(男15例，女3例，年龄58岁±6岁)无器质性疾病的健康受试者作为对照组。急性心肌梗死患者在溶栓前，溶栓后30 min、60 min及120 min采静脉血2 mL。血标本置入EDTA抗凝管，30 min内用抗人C3c荧光抗体标记。
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二、免疫荧光标记
用免疫荧光抗体标记中性粒细胞表面补体片段C3c的沉积。具体操作步骤如下：每次取抗凝全血30μL和等量NaN3-PBS加入三支玻璃试管，4℃红细胞裂解液5 mL溶解红细胞，低速离心，弃上清，NaN3-PBS冲洗细胞两次。细胞复悬于50μL NaN3-PBS，第一管加入FITC标记的兔抗人C3c单克隆抗体5μL(Dako)，第二管加入FITC/PE双色标记的鼠抗人CD45+CD14抗体5μL(Becton Dikinson)，第三管加入NaN3-PBS 5μL作空白对照。室温下暗室中孵育30 min，再用NaN3-PBS冲洗细胞两次，加1%多聚甲醛0.5 mL固定后置4℃冰箱保存，24 h内用流式细胞仪测定。
三、流式细胞术
Becton Dikinson FACS Calibur流式细胞仪测定中性粒细胞表面C3c的荧光强度。用空白对照和阴性对照消除自发荧光和非特异荧光的影响。根据细胞大小，细胞内颗粒密度，前散射(forward light scatter, FSC)和侧散射(side light scatter, SSC)将白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群，依CD45、CD14的荧光强度进一步证实三种白细胞亚群的纯度。圈出拟测定的细胞亚群，分析5000～10000个细胞。荧光信号以直方图或二维dot-plot散点图储存于电子计算机，自动分析每个细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。
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四、统计学处理
计量资料用Mean±SD表示。两样本均数比较采用t检验。多个样本均数比较方差齐时采用方差分析。P<0.05认为有统计学意义。所有数据输入电子计算机，用SPSS for Windows 7.5软件包进行分析。
结 果
溶栓前，AMI组与对照组间中性粒细胞表面C3c的平均荧光强度无差异[分别为(360.82±112.77)U/cell和(323.95±47.90)U/cell]。
溶栓后30 min、60 min和120 min，中性粒细胞C3c平均荧光强度分别是溶栓前的306.83%±161.32%\,150.39%±54.70%和127.34%±29.29%。溶栓后30 min升高3倍(P<0.01)，溶栓后60 min和120 min恢复近溶栓前的水平(P>0.05)。
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讨 论
溶栓是目前治疗急性心肌梗死的主要措施，但各种溶栓剂如SK、r-TPA和UK激活纤溶酶而启动补体系统的经典途径，从而使补体系统活化[3～6]。由于人群普遍感染过链球菌而存在抗SK抗体，使用SK后可在体内迅速形成SK-SK抗体免疫复合物，再次启动经典的补体活化途径。因此，SK活化补体的作用强于其他溶栓剂。
本研究发现在溶栓之前，急性心肌梗死患者循环中中性粒细胞表面补体含量不升高，但溶栓后迅速升高，在溶栓后30 min升高3倍。结果提示溶栓治疗可以激活急性心肌梗死患者的补体系统。补体系统活化后，产生一系列具有生物活性的补体片段。其中最重要的是过敏毒素C3a、C4a\,C5a和膜攻击复合物C5b-9。先前已有研究发现溶栓后心肌梗死患者血液中C3a\,C4a和可溶性膜攻击复合物C5b-9浓度升高[3～6]。它们至少通过以下两条途径损害心肌细胞[7]。
首先，复合物C5b-9结合并攻击心肌细胞膜。心肌梗死后，血液中可溶性膜攻击复合物C5b-9浓度升高[2]，溶栓治疗更使其浓度进一步升高[3～6]。梗死心肌组织中可见膜攻击复合物C5b-9的沉积[1]，提示C5b-9在心肌细胞的损伤中起一定的作用。C5b-9作用于靶细胞，使水、小分子物质、电解质尤其是钙离子进入细胞内，导致细胞肿胀和溶解。细胞内钙离子超负荷，使细胞发生不可逆损伤。
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其次，各种具有生物活性的补体片段激活中性粒细胞和损伤血管内皮细胞引起再灌注损伤。过敏毒素和膜攻击复合物C5b-9激活中性粒细胞，使中性粒细胞产生氧自由基、释放细胞内的蛋白水解酶和细胞因子，增强中性粒细胞趋化和粘附能力[1]。过敏毒素C3a\,C4a\,C5a直接作用于血管平滑肌细胞，或激活肥大细胞和嗜碱性细胞而释放组织胺，导致血管通透性增加，促进中性粒细胞向梗死心肌迁移[7]。在心肌缺血再灌注过程中，中性粒细胞在缺血区域内C5a等趋化因子的作用下向心肌内浸润。它们释放氧自由基和蛋白水解酶等毒性物质，引起剧烈的炎症反应，使缺血心肌发生不可逆损伤[8]。补体活化片段iC3b沉积在内皮细胞表面，它与中性粒细胞的补体受体结合，介导中性粒细胞与内皮细胞粘附[9]。粘附于内皮的中性粒细胞释放毒性物质损伤血管内皮细胞，并阻塞毛细血管引起"无再流(no-reflow)"现象，促进心肌缺血再灌注损伤。
本研究发现急性心肌梗死患者在溶栓30 min后，中性粒细胞表面补体片段C3c含量升高3倍。结果提示溶栓治疗后，活化的补体片段与中性粒细胞的补体受体结合，激活中性粒细胞。
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有研究人员观察到急性心肌梗死患者使用SK后，它在补体被激活的同时伴随一过性中性粒细胞减少，15 min中性粒细胞减少30%，但随后中性粒细胞数量迅速升高，60 min中性粒细胞升高40%[3]。他们认为SK引起中性粒细胞的变化是由于补体系统被激活所致。C5a等使中性粒细胞粘附于血管内皮，即被"隔离(sequestration)"于边缘池，结果循环中的中性粒细胞数量减少。同时C5a又刺激骨髓释放大量的中性粒细胞，使随后外周循环的中性粒细胞数量迅速升高。r-TPA不引起中性粒细胞数量的改变，可能是r-TPA激活补体系统的能力较弱之故。
由于补体系统在心肌缺血再灌注损伤过程中起重要作用，现已有动物研究，通过干扰补体系统治疗心肌梗死。在心肌梗死之前用眼镜蛇因子(cobra venom factor)耗竭补体，结果心肌梗死的面积缩小，浸润至缺血区域的中性粒细胞数量减少[10]。可溶性Ⅰ型补体受体通过抑制补体活化的经典和替代途径，使心肌梗死的面积缩小44%，中性粒细胞浸润减少57%，梗死心肌无膜攻击复合物C5b-9的沉积[11]。因此，随着补体系统在心肌缺血再灌注损伤过程的作用的进一步认识，干扰补体系统可能会成为今后治疗心肌梗死的策略之一。
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参考文献
1 J Immunol, 1986,137:1945～1949
2 Circulation, 1990, 81:156～163
3 Circulation, 1994,89:76～80
4 Circulation, 1994, 90:2666～2670
5 Coron Artery Dis, 1997,8:9～18
6 J Am Coll Cardiol, 1987,10:627～632
7 Cardiovasc Res, 1994,28:437～444.
8 Circulation, 1995,91:1872～1885
9 Nature, 1989,339:314～317
10 Circulation, 1988,78:1449～1458
11 Science, 1990,249:146～151, http://www.100md.com
方 法
一、病例选择
16例无明显心衰和心源性休克的急性心肌梗死患者(AMI组)，男14例，女2例，年龄(61±5)岁，胸痛至入院的时间为2～24 h(7 h±5 h)。急性心肌梗死的诊断依据是典型的临床表现，心电图出现新的异常Q波或ST段抬高以及心肌酶升高(CK大于正常上限2倍)。无溶栓禁忌证者在胸痛6 h内入院，或超过6 h但仍有明显胸痛或ST段显著抬高且相关导联有明显A波者给予溶栓治疗。6例用链激酶(SK 150万U/60 min)，4例用重组型纤溶酶原激活剂(r-TPA 50 mg/60 min)，6例用尿激酶(UK 100万～150万U/60 min)静脉溶栓。其他治疗包括阿司匹林、β阻滞剂、硝酸酯类和血管紧张素转化酶抑制剂等。三组患者均无感染、恶性肿瘤或自身免疫性疾病的证据。18例(男15例，女3例，年龄58岁±6岁)无器质性疾病的健康受试者作为对照组。急性心肌梗死患者在溶栓前，溶栓后30 min、60 min及120 min采静脉血2 mL。血标本置入EDTA抗凝管，30 min内用抗人C3c荧光抗体标记。
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二、免疫荧光标记
用免疫荧光抗体标记中性粒细胞表面补体片段C3c的沉积。具体操作步骤如下：每次取抗凝全血30μL和等量NaN3-PBS加入三支玻璃试管，4℃红细胞裂解液5 mL溶解红细胞，低速离心，弃上清，NaN3-PBS冲洗细胞两次。细胞复悬于50μL NaN3-PBS，第一管加入FITC标记的兔抗人C3c单克隆抗体5μL(Dako)，第二管加入FITC/PE双色标记的鼠抗人CD45+CD14抗体5μL(Becton Dikinson)，第三管加入NaN3-PBS 5μL作空白对照。室温下暗室中孵育30 min，再用NaN3-PBS冲洗细胞两次，加1%多聚甲醛0.5 mL固定后置4℃冰箱保存，24 h内用流式细胞仪测定。
三、流式细胞术
Becton Dikinson FACS Calibur流式细胞仪测定中性粒细胞表面C3c的荧光强度。用空白对照和阴性对照消除自发荧光和非特异荧光的影响。根据细胞大小，细胞内颗粒密度，前散射(forward light scatter, FSC)和侧散射(side light scatter, SSC)将白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群，依CD45、CD14的荧光强度进一步证实三种白细胞亚群的纯度。圈出拟测定的细胞亚群，分析5000～10000个细胞。荧光信号以直方图或二维dot-plot散点图储存于电子计算机，自动分析每个细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。
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四、统计学处理
计量资料用Mean±SD表示。两样本均数比较采用t检验。多个样本均数比较方差齐时采用方差分析。P<0.05认为有统计学意义。所有数据输入电子计算机，用SPSS for Windows 7.5软件包进行分析。
结 果
溶栓前，AMI组与对照组间中性粒细胞表面C3c的平均荧光强度无差异[分别为(360.82±112.77)U/cell和(323.95±47.90)U/cell]。
溶栓后30 min、60 min和120 min，中性粒细胞C3c平均荧光强度分别是溶栓前的306.83%±161.32%\,150.39%±54.70%和127.34%±29.29%。溶栓后30 min升高3倍(P<0.01)，溶栓后60 min和120 min恢复近溶栓前的水平(P>0.05)。
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讨 论
溶栓是目前治疗急性心肌梗死的主要措施，但各种溶栓剂如SK、r-TPA和UK激活纤溶酶而启动补体系统的经典途径，从而使补体系统活化[3～6]。由于人群普遍感染过链球菌而存在抗SK抗体，使用SK后可在体内迅速形成SK-SK抗体免疫复合物，再次启动经典的补体活化途径。因此，SK活化补体的作用强于其他溶栓剂。
本研究发现在溶栓之前，急性心肌梗死患者循环中中性粒细胞表面补体含量不升高，但溶栓后迅速升高，在溶栓后30 min升高3倍。结果提示溶栓治疗可以激活急性心肌梗死患者的补体系统。补体系统活化后，产生一系列具有生物活性的补体片段。其中最重要的是过敏毒素C3a、C4a\,C5a和膜攻击复合物C5b-9。先前已有研究发现溶栓后心肌梗死患者血液中C3a\,C4a和可溶性膜攻击复合物C5b-9浓度升高[3～6]。它们至少通过以下两条途径损害心肌细胞[7]。
首先，复合物C5b-9结合并攻击心肌细胞膜。心肌梗死后，血液中可溶性膜攻击复合物C5b-9浓度升高[2]，溶栓治疗更使其浓度进一步升高[3～6]。梗死心肌组织中可见膜攻击复合物C5b-9的沉积[1]，提示C5b-9在心肌细胞的损伤中起一定的作用。C5b-9作用于靶细胞，使水、小分子物质、电解质尤其是钙离子进入细胞内，导致细胞肿胀和溶解。细胞内钙离子超负荷，使细胞发生不可逆损伤。
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其次，各种具有生物活性的补体片段激活中性粒细胞和损伤血管内皮细胞引起再灌注损伤。过敏毒素和膜攻击复合物C5b-9激活中性粒细胞，使中性粒细胞产生氧自由基、释放细胞内的蛋白水解酶和细胞因子，增强中性粒细胞趋化和粘附能力[1]。过敏毒素C3a\,C4a\,C5a直接作用于血管平滑肌细胞，或激活肥大细胞和嗜碱性细胞而释放组织胺，导致血管通透性增加，促进中性粒细胞向梗死心肌迁移[7]。在心肌缺血再灌注过程中，中性粒细胞在缺血区域内C5a等趋化因子的作用下向心肌内浸润。它们释放氧自由基和蛋白水解酶等毒性物质，引起剧烈的炎症反应，使缺血心肌发生不可逆损伤[8]。补体活化片段iC3b沉积在内皮细胞表面，它与中性粒细胞的补体受体结合，介导中性粒细胞与内皮细胞粘附[9]。粘附于内皮的中性粒细胞释放毒性物质损伤血管内皮细胞，并阻塞毛细血管引起"无再流(no-reflow)"现象，促进心肌缺血再灌注损伤。
本研究发现急性心肌梗死患者在溶栓30 min后，中性粒细胞表面补体片段C3c含量升高3倍。结果提示溶栓治疗后，活化的补体片段与中性粒细胞的补体受体结合，激活中性粒细胞。
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有研究人员观察到急性心肌梗死患者使用SK后，它在补体被激活的同时伴随一过性中性粒细胞减少，15 min中性粒细胞减少30%，但随后中性粒细胞数量迅速升高，60 min中性粒细胞升高40%[3]。他们认为SK引起中性粒细胞的变化是由于补体系统被激活所致。C5a等使中性粒细胞粘附于血管内皮，即被"隔离(sequestration)"于边缘池，结果循环中的中性粒细胞数量减少。同时C5a又刺激骨髓释放大量的中性粒细胞，使随后外周循环的中性粒细胞数量迅速升高。r-TPA不引起中性粒细胞数量的改变，可能是r-TPA激活补体系统的能力较弱之故。
由于补体系统在心肌缺血再灌注损伤过程中起重要作用，现已有动物研究，通过干扰补体系统治疗心肌梗死。在心肌梗死之前用眼镜蛇因子(cobra venom factor)耗竭补体，结果心肌梗死的面积缩小，浸润至缺血区域的中性粒细胞数量减少[10]。可溶性Ⅰ型补体受体通过抑制补体活化的经典和替代途径，使心肌梗死的面积缩小44%，中性粒细胞浸润减少57%，梗死心肌无膜攻击复合物C5b-9的沉积[11]。因此，随着补体系统在心肌缺血再灌注损伤过程的作用的进一步认识，干扰补体系统可能会成为今后治疗心肌梗死的策略之一。
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参考文献
1 J Immunol, 1986,137:1945～1949
2 Circulation, 1990, 81:156～163
3 Circulation, 1994,89:76～80
4 Circulation, 1994, 90:2666～2670
5 Coron Artery Dis, 1997,8:9～18
6 J Am Coll Cardiol, 1987,10:627～632
7 Cardiovasc Res, 1994,28:437～444.
8 Circulation, 1995,91:1872～1885
9 Nature, 1989,339:314～317
10 Circulation, 1988,78:1449～1458
11 Science, 1990,249:146～151, http://www.100md.com