从中药复方开发研制二类新药的探索
中国药科大学 严永清 朱丹妮 汤明辉
从中药审批办法颁布后，10年(1987～1997年)中批准临床和生产的中药新药有668个，绝大多数为三、四类药，共603个，占90 3%。一、二类药分别有28个和31个。二类药大多数是单味药的有效部位，还有少数几个注射剂。至今尚未有来源于复方的有效部位或有效组分研制的口服二类新药。近几年来，国家已高度重视加强中药复方的研究，采取许多重大举措，目的是要加速中药现代化进程，研制高水平的中药新药，进入国际医药主流市场，发扬中医药学。我们近年来在对中药复方生脉散较系统研究的基础上，正在进行对生脉散开发研究二类药的工作。
生脉散是我国传统著名古方，一般认为出自《内外伤群或论》(1213年)。经考证，生脉散最早出自1186年的《医学启源》，至今已813年。由人参Panax ginseng C.A Mey，麦冬 Ophipogon japonicus(L.f.)Ker-Gawl，五味子 Schisandra chinensis(Turcz.)Baill三药组成。具有益气生津、敛阴止汗的功能。主治热伤元气、阴液亏耗的气阴两虚，证见汗多、口渴、咽干、喘急欲脱、形体倦惰、脉虚无力、舌干红无律，或久病心肺两虚、气阴不足、咳呛少痰、短气自汗、口干舌燥和脉象虚软。本方经长期临床实践疗效确切，至今仍广为应用。从70年代初开始至今医药界对此方进行了大量研究，临床应用范围不断扩大，已用于治疗心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血等方面病症；药理研究也已有百余篇报道。笔者等曾在80年代即主持了由全国8个科研、教学、临床、生产单位的百余人参加的协作研究的国家攻关项目，对生脉散进行了文献、药材品种、组方原理、药理、毒理、化学质量标准、制剂工艺、临床等系统研究，并开发研制了生脉散口服液、颗粒剂、粉针剂等新制剂。口服液作为生脉钦二方早已被卫生部批报(1989年)生产。经临床观察498例患者，证实对冠心病心绞痛、扩张型心肌病、改善老年衰老症候等有较好疗效。目前国内生脉散已有注射剂、冲剂、袋泡剂、口服液等多种剂型。
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我们在研究中发现三药合煎液在临床和药理实验中某些效果比单味分煎混合液好，其原因当时未予深入研究，为了更好地发掘这一名方，述中医药理论，为了开发有独特疗效的科学性更强的新药，使中药制剂走向世界，促进中药现代化的进程，我们近几年又对这一名方开展了深入研究。目的是了解本方对心血管系统作用的有效部位和主要有效成分，从物质基础阐明复方优于单味药的原因，开发优于西药治疗病毒性心肌炎的二类新药。
我们在以前的研究中已经证明了生脉散三味药全方药效优于任何一味药或两两配伍。所以我们首先重点研究了生脉散复方合煎液的有效部位、在合煎过程中化学成分的动态变化及与分煎混合液中主要化学成分的区别。
1.复方的化学研究
1.1生脉散有效部位的研究
先将生脉散(人参：麦冬：五味子=1：3：1.5)制成合煎液，以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和水液4个提取部位对氯访诱发小鼠室颤的实验结果，选择了用水饱和正丁醇直接萃取生脉散合煎液，分为正丁醇部位和水液部位，然后以抗心肌缺血、抗心律失常、抗休克3项指标对合煎液(SH)正丁醇提取物(SHBu)和水液部位(SHAq)的心血管作用进行研究。3项药理指标共做了5项实验：小鼠常压耐缺氧、垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血、氯仿诱发小鼠室颤、氯化钙诱发大鼠心律失常和内毒素诱发的小鼠休克。5项实验结果表明：正丁醇部位除对氯化钙诱发的大鼠心律失常的作用比合煎液稍逊外，其它结果与合煎液都有明显效果，可以确定为有效部位；水液部位对抗心肌缺血也有明显作用，说明水液部位中也含有抗。已肌缺血的有效成分。
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1.2有效部位SHBu中人参皂甙的变化
以生脉散全方、各单味药及两两配伍、各药分煎后的混合物(SF)，分别以水饱和正丁醇苹取部位进行薄层层析。结果表明：SHBu中人参皂甙
Rb、Re、Rd、Re消失，仅有Rg、Rh1 、Rh2。另外，在其上端发现有一较大斑点，暂称为WX物质。
1.3生脉散中人参皂甙的动态变化。
1.3.1合煎液中人参总皂音含量无明显变化。
1.3.2合煎液中人参皂甙
Rb1、 Rb2、RC、Rd、 Re、Rg1消失，Rg3、Rh1含量明显增加，合煎液中人参皂甙主要为Rg2、Rg3 、Rh1、Rf。
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1.3.3人参与麦冬配伍，随着麦冬用量的增加，人参皂甙Rb1、Rb2、RC1、RC、Rd、Re、Rg1含量逐渐降低，而Rg2
、Rg3 、Rh1含量则逐步升高，这种变化趋势的转折处在人参：麦冬一1：4。
1.3.4人参与五味子配伍，随着五味子用量的加大，人参皂甙Rb1、Rb2、RC、Rd、Re消失，Rf含量降低，Rg2 、Rg3 、Rh1含量升高，这种含量变化趋势的转折处在人参。五味子=1：2。
1.4生脉散复方合煎过程新成分5-HMF的发现、鉴定和动态变化研究在生脉散会煎液的薄层层析中发现的一个大斑点，经分析3个原药材中均无此斑点，对此斑点进一步制备分离，经UV、IR、NMR、MS等鉴定，确定为合煎过程中产生的新成分 5一羟甲基一 2一糠醛( 5-HMF)。
我们又进一步研究了5-HMF产生的机制及对含量多少的影响因素(如不同配伍组成、麦冬用量不同、煎煮时间等)，并对5-HMF进行了初步药效试验，发现5-HMF有较强的抗氧化作用，此作用对生脉散抗心肌缺血作用是有利的。
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1.5麦冬与五味子配伍后，麦冬黄酮成分中甲基麦冬黄烷酮A、B的含量明显降低，而人参则能对抗这种作用。
1.6五味子与人参、麦冬配伍后，五味子总木脂素及五味子酸甲含量均有显是增高。
1.7生脉散组方三药配伍的最佳比例
根据对本方复方化学成分动态变化的研究结果，如以Rg3、Rhl的含量最高及结合5-HMF含量中麦冬与五妹子的用量比例，推定人参与麦冬的比例以1：3～4，人参与五味子的比例以1：1.5～2，麦冬与五味子之比以2：1为佳，这也证明了我们所用生脉散中人参。麦冬：五味子= 1：3：1.5是属于最佳配伍比例范围，是科学、合理的。
2.生脉散及其有效组分对病毒性心肌炎动物模型药效的初步研究
病毒性心肌炎是心血管系统常见病之一，至今西药尚无特效良药。生脉散在临床已有多篇应用报道，但尚未见实验报道。
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我们在对“生脉散复方化学成分动态变化与药效关系的研究”的启示下，尝试从复方合煎液提取有效组分研制二类新药。
目前已经从复方合煎液中提取了3个有效组分，分别对3个组分及其混合物对病毒性心肌炎模型观察实验疗效，取得了较满意的初步结果，现简介如下；
2.1对病毒性心肌炎动物模型的药效
以柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3 )，对BALB/C小鼠复制成病毒性心肌炎模型，给药组于首次ip病毒的同时ig生脉散合煎剂(SMS)相当药材22g/kg·d的有效组分 A、B、C及其混合物(A+B+C)(mixture)，连续 10天。
当 A、B、C及三者混合物剂量为相当药材 22g/kg时，混合物能明显改善病毒小鼠体重减轻的情况，显著降低血清中心肌酶谱CK、LDH、AST的升高；生脉散水煎剂相当药材11g/kg能显著升高病毒小鼠的生存率；降低血清 LDH的含量，但对CK、AST无明显影响；混合物对小鼠心肌组织病变如坏死、钙化、浸润有明显改善，生脉散水煎剂则有所改善，但不明显。3个有效组分中，任何一种有效组分单独使用无明显作用。
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由光镜结果可知：混合物相当药材22g/kg剂量能明显改善病毒引起的心肌病变。并由电镜结果可知，对照组心肌横纹肌原纤维各部分和线粒体形态完整；模型组线粒体肿胀后挤压而扭曲，横纹肌闰盘解离。而混合物和生脉散水煎剂线粒体形态均匀，呈凝聚状，外膜和脊膜系统清晰可见、完整肌原纤维分布均匀，清晰可辨，受损最轻。
2.2对病毒性心肌炎小鼠免疫系统的影响
对病毒性心肌炎小鼠igSMS、Mixture相当药材 22g/kg，连续 7天。结果表明：SMS、Mixture均能明显改善感染病毒后第七天小鼠的体重变化和心脏指数。与对照组相比，感染病毒后第七天的模型组小鼠极度显著地降低小鼠脾脏NK细胞的活性和血浆白介素一2(IL-2)的含量。而r干扰素(IFN-r)含量极大地升高。SMSMixture相当药材 22g/kg剂量组能显著升高IL-2的含量，SMS组能升高小鼠脾脏NK细胞的活性，Mixture组对NK细胞治力有一定的升高趋势。此外，SMS Mixture组均对血浆中过高的IFN-r有降低的趋势。
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本研究结果以心脏指数、心肌酶谱、心肌病变学考察等结果说明SMS(相当药材11g/kg 剂量)和3种有效组分A、B、C的混合物(相当药材22g/kg)对病毒性心肌炎模型动物的药效相当，且在降低升高的心脏指数及保护受损心肌组织方面，混合物还优于水煎剂。但3种有效组分单独给药时，疗效均不显著，这结果也说明生脉散治疗病毒性心肌炎是多种成分的综合作用，也体现了复方的特色。
我们曾做过对心肌组织病毒的检测及体外抗病毒试验，结果说明，生脉散体外无直接抗病毒作用，而对感染病毒小鼠的心肌组织病毒基因阳性率有一定的降低趋势，这说明生脉散及其有效组分混合物主要是通过保护心肌，调节整体机能而达到治疗病毒性心肌炎的目的。
我们还做了肝脏体外淋巴细胞转化实验。发现生脉散水煎剂只对T淋巴细胞增殖有促进作用，而三种有效组分作用方向有所不同。其中A组分主要对T淋巴细胞增殖有显著促进作用，并于
25ug/mL达到峰值，而对 B淋巴细胞则无明显作用。B组分则正好相反，对B淋巴细胞有显著促进作用，对T淋巴细胞则无明显作用；C组分对T淋巴细胞增殖有一定促进作用，但对B淋巴细胞的增殖在
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6.25、12.5ug/mL的浓渡下有抑制作用。这些结果提示了各有效组分作用的多靶性，而且相互不同方向作用的结果表明了其既有相互协同，又有相互持抗而达综合作用的效果。
上述结果表明，由生脉散合煎液提取分离的3个有效组分的混合物，有可能成为治疗病毒性心肌炎的二类中药新药，其它药理试验正在进行中，有些已得的结果与生脉散水煎剂均一致。
但从复方开发研制二类药最大的难点还在于如何制定更科学的质量标准。虽然已经可以肯定3种组分均为有效组分，但不同于单味药的是，每种组分中的成分必须考虑到来源于3种药材的可能，因此必须是多指标的测定，我们已经探索了方法并取得了成效。我们相信，从中药复方制剂是能够研制二类药的，一旦成功，质量标准能更科学合理，也更利于研制新的剂型，用药剂量可大为减少。既有西药的优点，又保持中药复方多成分综合作用而疗效好、毒副作用小的特点。, 百拇医药
从中药审批办法颁布后，10年(1987～1997年)中批准临床和生产的中药新药有668个，绝大多数为三、四类药，共603个，占90 3%。一、二类药分别有28个和31个。二类药大多数是单味药的有效部位，还有少数几个注射剂。至今尚未有来源于复方的有效部位或有效组分研制的口服二类新药。近几年来，国家已高度重视加强中药复方的研究，采取许多重大举措，目的是要加速中药现代化进程，研制高水平的中药新药，进入国际医药主流市场，发扬中医药学。我们近年来在对中药复方生脉散较系统研究的基础上，正在进行对生脉散开发研究二类药的工作。
生脉散是我国传统著名古方，一般认为出自《内外伤群或论》(1213年)。经考证，生脉散最早出自1186年的《医学启源》，至今已813年。由人参Panax ginseng C.A Mey，麦冬 Ophipogon japonicus(L.f.)Ker-Gawl，五味子 Schisandra chinensis(Turcz.)Baill三药组成。具有益气生津、敛阴止汗的功能。主治热伤元气、阴液亏耗的气阴两虚，证见汗多、口渴、咽干、喘急欲脱、形体倦惰、脉虚无力、舌干红无律，或久病心肺两虚、气阴不足、咳呛少痰、短气自汗、口干舌燥和脉象虚软。本方经长期临床实践疗效确切，至今仍广为应用。从70年代初开始至今医药界对此方进行了大量研究，临床应用范围不断扩大，已用于治疗心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血等方面病症；药理研究也已有百余篇报道。笔者等曾在80年代即主持了由全国8个科研、教学、临床、生产单位的百余人参加的协作研究的国家攻关项目，对生脉散进行了文献、药材品种、组方原理、药理、毒理、化学质量标准、制剂工艺、临床等系统研究，并开发研制了生脉散口服液、颗粒剂、粉针剂等新制剂。口服液作为生脉钦二方早已被卫生部批报(1989年)生产。经临床观察498例患者，证实对冠心病心绞痛、扩张型心肌病、改善老年衰老症候等有较好疗效。目前国内生脉散已有注射剂、冲剂、袋泡剂、口服液等多种剂型。
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我们在研究中发现三药合煎液在临床和药理实验中某些效果比单味分煎混合液好，其原因当时未予深入研究，为了更好地发掘这一名方，述中医药理论，为了开发有独特疗效的科学性更强的新药，使中药制剂走向世界，促进中药现代化的进程，我们近几年又对这一名方开展了深入研究。目的是了解本方对心血管系统作用的有效部位和主要有效成分，从物质基础阐明复方优于单味药的原因，开发优于西药治疗病毒性心肌炎的二类新药。
我们在以前的研究中已经证明了生脉散三味药全方药效优于任何一味药或两两配伍。所以我们首先重点研究了生脉散复方合煎液的有效部位、在合煎过程中化学成分的动态变化及与分煎混合液中主要化学成分的区别。
1.复方的化学研究
1.1生脉散有效部位的研究
先将生脉散(人参：麦冬：五味子=1：3：1.5)制成合煎液，以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和水液4个提取部位对氯访诱发小鼠室颤的实验结果，选择了用水饱和正丁醇直接萃取生脉散合煎液，分为正丁醇部位和水液部位，然后以抗心肌缺血、抗心律失常、抗休克3项指标对合煎液(SH)正丁醇提取物(SHBu)和水液部位(SHAq)的心血管作用进行研究。3项药理指标共做了5项实验：小鼠常压耐缺氧、垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血、氯仿诱发小鼠室颤、氯化钙诱发大鼠心律失常和内毒素诱发的小鼠休克。5项实验结果表明：正丁醇部位除对氯化钙诱发的大鼠心律失常的作用比合煎液稍逊外，其它结果与合煎液都有明显效果，可以确定为有效部位；水液部位对抗心肌缺血也有明显作用，说明水液部位中也含有抗。已肌缺血的有效成分。
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1.2有效部位SHBu中人参皂甙的变化
以生脉散全方、各单味药及两两配伍、各药分煎后的混合物(SF)，分别以水饱和正丁醇苹取部位进行薄层层析。结果表明：SHBu中人参皂甙
Rb、Re、Rd、Re消失，仅有Rg、Rh1 、Rh2。另外，在其上端发现有一较大斑点，暂称为WX物质。
1.3生脉散中人参皂甙的动态变化。
1.3.1合煎液中人参总皂音含量无明显变化。
1.3.2合煎液中人参皂甙
Rb1、 Rb2、RC、Rd、 Re、Rg1消失，Rg3、Rh1含量明显增加，合煎液中人参皂甙主要为Rg2、Rg3 、Rh1、Rf。
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1.3.3人参与麦冬配伍，随着麦冬用量的增加，人参皂甙Rb1、Rb2、RC1、RC、Rd、Re、Rg1含量逐渐降低，而Rg2
、Rg3 、Rh1含量则逐步升高，这种变化趋势的转折处在人参：麦冬一1：4。
1.3.4人参与五味子配伍，随着五味子用量的加大，人参皂甙Rb1、Rb2、RC、Rd、Re消失，Rf含量降低，Rg2 、Rg3 、Rh1含量升高，这种含量变化趋势的转折处在人参。五味子=1：2。
1.4生脉散复方合煎过程新成分5-HMF的发现、鉴定和动态变化研究在生脉散会煎液的薄层层析中发现的一个大斑点，经分析3个原药材中均无此斑点，对此斑点进一步制备分离，经UV、IR、NMR、MS等鉴定，确定为合煎过程中产生的新成分 5一羟甲基一 2一糠醛( 5-HMF)。
我们又进一步研究了5-HMF产生的机制及对含量多少的影响因素(如不同配伍组成、麦冬用量不同、煎煮时间等)，并对5-HMF进行了初步药效试验，发现5-HMF有较强的抗氧化作用，此作用对生脉散抗心肌缺血作用是有利的。
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1.5麦冬与五味子配伍后，麦冬黄酮成分中甲基麦冬黄烷酮A、B的含量明显降低，而人参则能对抗这种作用。
1.6五味子与人参、麦冬配伍后，五味子总木脂素及五味子酸甲含量均有显是增高。
1.7生脉散组方三药配伍的最佳比例
根据对本方复方化学成分动态变化的研究结果，如以Rg3、Rhl的含量最高及结合5-HMF含量中麦冬与五妹子的用量比例，推定人参与麦冬的比例以1：3～4，人参与五味子的比例以1：1.5～2，麦冬与五味子之比以2：1为佳，这也证明了我们所用生脉散中人参。麦冬：五味子= 1：3：1.5是属于最佳配伍比例范围，是科学、合理的。
2.生脉散及其有效组分对病毒性心肌炎动物模型药效的初步研究
病毒性心肌炎是心血管系统常见病之一，至今西药尚无特效良药。生脉散在临床已有多篇应用报道，但尚未见实验报道。
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我们在对“生脉散复方化学成分动态变化与药效关系的研究”的启示下，尝试从复方合煎液提取有效组分研制二类新药。
目前已经从复方合煎液中提取了3个有效组分，分别对3个组分及其混合物对病毒性心肌炎模型观察实验疗效，取得了较满意的初步结果，现简介如下；
2.1对病毒性心肌炎动物模型的药效
以柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3 )，对BALB/C小鼠复制成病毒性心肌炎模型，给药组于首次ip病毒的同时ig生脉散合煎剂(SMS)相当药材22g/kg·d的有效组分 A、B、C及其混合物(A+B+C)(mixture)，连续 10天。
当 A、B、C及三者混合物剂量为相当药材 22g/kg时，混合物能明显改善病毒小鼠体重减轻的情况，显著降低血清中心肌酶谱CK、LDH、AST的升高；生脉散水煎剂相当药材11g/kg能显著升高病毒小鼠的生存率；降低血清 LDH的含量，但对CK、AST无明显影响；混合物对小鼠心肌组织病变如坏死、钙化、浸润有明显改善，生脉散水煎剂则有所改善，但不明显。3个有效组分中，任何一种有效组分单独使用无明显作用。
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由光镜结果可知：混合物相当药材22g/kg剂量能明显改善病毒引起的心肌病变。并由电镜结果可知，对照组心肌横纹肌原纤维各部分和线粒体形态完整；模型组线粒体肿胀后挤压而扭曲，横纹肌闰盘解离。而混合物和生脉散水煎剂线粒体形态均匀，呈凝聚状，外膜和脊膜系统清晰可见、完整肌原纤维分布均匀，清晰可辨，受损最轻。
2.2对病毒性心肌炎小鼠免疫系统的影响
对病毒性心肌炎小鼠igSMS、Mixture相当药材 22g/kg，连续 7天。结果表明：SMS、Mixture均能明显改善感染病毒后第七天小鼠的体重变化和心脏指数。与对照组相比，感染病毒后第七天的模型组小鼠极度显著地降低小鼠脾脏NK细胞的活性和血浆白介素一2(IL-2)的含量。而r干扰素(IFN-r)含量极大地升高。SMSMixture相当药材 22g/kg剂量组能显著升高IL-2的含量，SMS组能升高小鼠脾脏NK细胞的活性，Mixture组对NK细胞治力有一定的升高趋势。此外，SMS Mixture组均对血浆中过高的IFN-r有降低的趋势。
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我们曾做过对心肌组织病毒的检测及体外抗病毒试验，结果说明，生脉散体外无直接抗病毒作用，而对感染病毒小鼠的心肌组织病毒基因阳性率有一定的降低趋势，这说明生脉散及其有效组分混合物主要是通过保护心肌，调节整体机能而达到治疗病毒性心肌炎的目的。
我们还做了肝脏体外淋巴细胞转化实验。发现生脉散水煎剂只对T淋巴细胞增殖有促进作用，而三种有效组分作用方向有所不同。其中A组分主要对T淋巴细胞增殖有显著促进作用，并于
25ug/mL达到峰值，而对 B淋巴细胞则无明显作用。B组分则正好相反，对B淋巴细胞有显著促进作用，对T淋巴细胞则无明显作用；C组分对T淋巴细胞增殖有一定促进作用，但对B淋巴细胞的增殖在
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6.25、12.5ug/mL的浓渡下有抑制作用。这些结果提示了各有效组分作用的多靶性，而且相互不同方向作用的结果表明了其既有相互协同，又有相互持抗而达综合作用的效果。
上述结果表明，由生脉散合煎液提取分离的3个有效组分的混合物，有可能成为治疗病毒性心肌炎的二类中药新药，其它药理试验正在进行中，有些已得的结果与生脉散水煎剂均一致。
但从复方开发研制二类药最大的难点还在于如何制定更科学的质量标准。虽然已经可以肯定3种组分均为有效组分，但不同于单味药的是，每种组分中的成分必须考虑到来源于3种药材的可能，因此必须是多指标的测定，我们已经探索了方法并取得了成效。我们相信，从中药复方制剂是能够研制二类药的，一旦成功，质量标准能更科学合理，也更利于研制新的剂型，用药剂量可大为减少。既有西药的优点，又保持中药复方多成分综合作用而疗效好、毒副作用小的特点。, 百拇医药