复方丹参滴丸预处理加强心肌缺血预适应保护作用研究
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摘 要
目的：观察复方丹参滴丸是否具有模拟或加强缺血预适应、减少缺血再灌注损伤的作用。
方法：采用经典大鼠冠脉结扎，缺血5 min，再灌5 min，反复循环3次的缺血性预适应模型；以及缺血30 min，再灌2h的单纯缺血再灌模型。以坏死区占缺血区的百分比、恶性心律失常的发生率、心肌酶、自由基为评价指标，观察复方丹参滴丸模拟或加强缺血预适应早、晚期的效应。
结果：再灌注组，早、晚期假性预适应组坏死重量占缺血重量(IS/ AAR)分别高达45%、47%、45%；心律失常的发生率也分别高达76.46%、55.56%、73.33%；血清中乳酸脱氢酶(LDH)含量也显著高于对照组，P< 0.01。 缺血预处理后，早期组IS/AAR与早期假性预适应组相比降低了17%，晚期组IS/AAR与晚期假性预适应组相比仅降低4%；早期缺血预处理组和晚期缺血预处理组心律失常发生率分别为11.76%和43.75%，显著低于再灌注和早、晚期假性预适应组，P< 0.01；缺血预处理之后LDH释放也减少。说明缺血预处理可缩小缺血范围，减少心律失常的发生率。复方丹参滴丸预处理后，在再灌注、心肌缺血预适应基础上IS/AAR进一步缩小约10%～17%，LDH释放也减少，LDH含量以晚期药物+心肌缺血预适应组最低，与晚期假性预适应组相比P< 0.05。复方丹参滴丸使再灌注组心律失常发生率下降。另外，复方丹参滴丸预处理后，还可以使血清中MDA下降，超氧化物歧化酶活性增强。
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结论：复方丹参滴丸可模拟和加强心肌缺血预适应的效应，但对早期心肌缺血预适应的效应不及缺血预处理组，而晚期心肌缺血预适应效应缺血预处理组不及复方丹参滴丸预处理组。
1986年Murry等首次在犬心实验中提出心肌缺血预适应现象(ischemic preconditioning，IPC)，即短暂结扎冠脉可缩小随后更长时间缺血导致的心肌梗死面积，并减少严重并发症。临床心绞痛患者也存在预适应，手术而致的缺血性预适应难以在临床重现，所以提出了一种新的概念“药物性预适应”,即用药物替代缺血刺激产生缺血预适应样的保护作用,现已发现多种药物可通过促进内源性活性物质释放而产生缺血预适应样心脏保护作用，如：钾通道开放剂、蛋白激酶C激活剂、拟肾上腺素类药物、前列腺素等，但体外给予这些药物保护作用强度和持续时间都不及缺血预适应。
复方丹参滴丸是临床最常用的活血化瘀方剂，主要用于治疗心肌缺血。本实验旨在探讨复方丹参滴丸是否具有促进内源性心肌保护物质释放，减少梗死面积，模拟或加强IPC的保护作用,减轻心肌缺血性再灌注时的损伤。
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材料和方法
一、材料
SPF级雄性Sprage-Dawley大鼠180只，体重(443.65±36.13)g，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供；复方丹参滴丸浸膏由天津天士力集团有限公司研究院提供，批号20001010。经高压液相分析证实，此药丸中主要含丹参水溶性成分和三七总皂甙以及冰片。
二、动物模型的复制
用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉大鼠。行气管插管连接小动物呼吸机，频率80～90次/min，潮气量3～4 ml。持续记录心电图变化。开胸暴露心脏，用穿有5-0缝合线的3/8弯针钩绕左冠状动脉前降支主干。线两端共穿过一根聚乙烯小管以形成闭环。 拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生再灌注。结扎前1 min给予肝素(250 U/kg)。缺血性预适应为IPC缺血5 min，再灌5 min，反复循环3次。间隔10 min后，再进行缺血30 min，再灌2h。
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缺血的标志：(1)ST段抬高和R波增高(见图1)。
图1
心电图显示缺血时ST段抬高和R波增高
(2)左室发绀。
再灌注的标志：(1)抬高的ST段和R波恢复。
(2)发绀区变红。
三、退出实验的标准：
有下列情况之一的大鼠将退出实验：(1)当灌注染色后，缺血重量(AAR)不足心脏重量的15%；(2)结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者；(3) 过度出血并致血压下降者；(4)呼吸、心跳停止超过30s者。
四、实验分组：
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将180只大鼠随机分为9组。其中141只大鼠完成了本实验。实验中有39只大鼠未满足本实验的入选标准而退出研究。退出的大鼠空额按最初的随机分组原则重新补上。除给药组外，其余各组均灌服公斤体重相符的生理盐水，各组处理的详细方案如下：
1、对照组(control)：不做任何处理。
2、再灌注组(IR)：缺血30 min，再灌2h。
3、假性缺血预处理组(SIPC): 3个IPC时只穿线，不结扎，10 min后缺血30 min，再灌2h。
4、缺血预处理组(IPC)：首先3个IPC，10 min后缺血30 min，再灌2h。
5、药物预处理+ 缺血预处理组(DIPC)：灌药2h后，再进行IPC组的过程。
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6、药物预处理组(DIR)：灌药2h后，再进行IR组过程。
7、晚期假性缺血预处理组(SIPC/SWOP)：3个IPC时只穿线，恢复24h时，再进行IR组过程。
8、晚期缺血预处理组(IPC/SWOP)：3个IPC后，恢复24h，再进行IR组过程。
9、晚期药物预处理+缺血预处理组(DIPC/SWOP)：灌药2h后，进行3个IPC，恢复24h后进行IR组过程。
详细设计流程见下图：
四、梗塞组织重量测定：
用Evans Blue+TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)双重染色，用称重法测量梗死范围。再灌注2 h后，重新拉紧闭环使冠脉阻塞。从颈静脉注入5%Evans Blue 1ml，待大鼠眼球变蓝后，处死大鼠。切取心脏，放置-20 ℃冰箱30 min后取出。从心尖向心底方向将心脏均匀切为7～8片，灌注区染为蓝色，非灌注区不染色。小心将蓝色区与未染色区分离。将未染色区置于pH 7.4、1%的TTC溶液中，并于37 ℃ 水箱孵化20 min，则坏死区不染色，未坏死区染为红色 ，小心将染色区与未染色区分离。将蓝色区、红色区和未染色区分别称重。红色区和未染色区之和为危险区 (area at risk, AAR)，未染色区为坏死区(infarct size, IS)，梗塞大小用IS在AAR中所占的百分比表示。
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五、生化指标测定：实验结束时，取血测定LDH、SOD、 MDA。血清LDH采用比浊法。MDA采用硫代巴比妥酸法。SOD采用黄嘌呤氧化酶法。
六、心律失常的记录和分析：记录持续缺血和再灌注时的心电图，统计心动过速(ventricular tachycardia,VT)和(或)心室纤维性颤动的发生率(ventricular fibrillation,VF)。
七、统计处理：使用stada软件进行分析,计量资料用x±s表示，用随机设计的方差分析和q检验。计数资料采用χ2。P< 0.05为统计学有差异。
(未完待续，下见本报7月11日第24版), 百拇医药(高秀梅张伯礼商洪才王怡郭利平张萌史红 )