复方丹参滴丸对缺血预适应大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响(1)
摘 要
目的：复方丹参滴丸模拟和加强缺血预适应(IPC)的机制，是否通过促进蛋白激酶C(PKC)蛋白、mRNA水平表达发挥作用。方法：采用结扎大鼠冠脉缺血5 min、再灌注5 min反复循环3次的缺血预适应方案和缺血30 min，再灌注2h的缺血再灌模型，通过免疫组化、RT-PCR的方法观察PKC蛋白、mRNA表达以及复方丹参滴丸对其影响。 结果：PKC在正常对照组中主要存在胞浆，但经过IPC和使用复方丹参滴丸后，在胞膜和胞核也可见；不论早期IPC组，还是晚期IPC组PKC表达均高于假性预处理组，以早期IPC组明显，P< 0.01；经复方丹参滴丸预处理后，PKC的表达均高于再灌注组、早期IPC组、晚期IPC组，以药物预处理+ 缺血预处理组(DIPC)为优，显著高于早期IPC组，P< 0.01。PKC mRNA在正常心肌组织、再灌注组、假性预处理组间无明显差异，但IPC后不论早期，还是晚期PKC mRNA表达均高于假性预处理组，晚期IPC 组表现更加明显；经复方丹参预处理后，可明显促进早、晚期IPC及再灌注组PKC mRNA的表达，P< 0.05。结论：复方丹参滴丸可激活PKC，使其发生转位，促进其蛋白、mRNA表达水平增高。这可能是复方丹参滴丸模拟和加强IPC的主要机制之一。
, 百拇医药
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一个在组织中广泛分布的磷酸化酶，静息状态下定位于细胞胞浆中，受到刺激后，它可以转位至细胞膜、细胞核，PKC活化后在细胞分泌、增生、分化等功能中发挥着重要作用。PKC的激活在缺血预适应(IPC)跨膜信号传递过程中具有举足轻重地位,它是一类Ca2+、磷酯依赖性的蛋白激酶。IPC时，机体内源性保护物质释放增加，作用于相应的受体，经受体和G蛋白偶联激活磷酯酶C(PLC)，后者使膜上的磷酯酰丝氨酸水解为三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)，DAG是PKC激活剂，PKC通过移位，将信息传递于细胞核和细胞的外周，通过催化多种蛋白质磷酸化，进而对细胞产生保护作用。
我们的研究已证实，复方丹参滴丸对缺血再灌注的心肌损伤具有保护作用，它可加强IPC的保护效应，减轻缺血再灌注心肌坏死区重量，但其是否可以激活IPC级联反应中的关键物质PKC，促进其表达从而发挥对心肌缺血的保护作用，本实验从蛋白及mRNA表达水平进行了探讨。
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材料和方法
一、实验动物
SPF级雄性Sprage-Dawley大鼠180只，体重(443.65±36.13)g，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供；复方丹参滴丸浸膏由天津天士力集团有限公司研究院提供，批号20001010，经高压液相分析复方丹参滴丸中主要含丹参水溶性成分和三七总皂甙以及冰片。
二、动物模型的复制
用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉大鼠。行气管插管连接小动物呼吸机，频率80～90次/min，潮气量3～4 ml。持续记录心电图变化。开胸暴露心脏，用穿有5-0缝合线的3/8弯针钩绕左冠状动脉前降支主干。线两端共穿过一根聚乙烯小管以形成闭环。 拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生再灌注。结扎前1 min给予肝素(250 U/kg)。缺血性适应(IPC)模型制作，即缺血5 min、再灌注5 min，反复循环3次。间隔10 min后，再进行缺血30 min，再灌注2h。
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缺血的标志为ST段抬高和R波增高；左室发绀。
再灌注的标志为抬高的ST段和R波恢复；发绀区变红。
三、退出实验的标准
有下列情况之一的大鼠将退出实验：当灌注染色后，缺血重量(AAR)不足心脏重的15%；结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者；过度出血并致血压下降者；呼吸心跳停止超过30s者。
四、实验分组
将100只大鼠随机分为9组。其中90只大鼠完成了本实验。实验中有10只大鼠未满足本实验的入选标准而退出研究。退出的大鼠按最初的随机分组原则重新补上。除给药组外，其余各组均灌服公斤体重相符的生理盐水，各组处理的详细方案如下：
1、对照组(control)：不做任何处理。
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2、再灌注组(IR)：缺血30 min，再灌2h。
3、假性缺血预处理组(SIPC): 3个IPC时只穿线，不结扎；10 min后，缺血30 min，再灌2h。
4、缺血预处理组(IPC)：首先3个IPC，10 min后，缺血30 min，再灌2h。
5、药物预处理+ 缺血预处理组(DIPC)：灌药2h后，再进行IPC组过程。
6、药物预处理组(DIR)：灌药2h后，再进行再灌注组过程。
7、晚期假性缺血预处理组(SIPC/SWOP)：3个IPC时只穿线，恢复24h后，再进行再灌注组过程。
8、晚期缺血预处理组(IPC/SWOP)：3个IPC后，恢复24h再进行再灌注组过程。
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9、晚期药物预处理+缺血预处理组(DIPC/SWOP)：灌药2h后，进行3个IPC，恢复24h后进行再灌注组过程。
五、主要试剂与仪器
主要试剂：PKC小鼠抗大鼠单克隆抗体(Santa Gruz),生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)，辣根酶标记链亲合素(三抗)，DAB、封闭用山羊血清(博士德试剂公司)，DEPC、琼脂糖(sigmag),TRIZOL Reagent(LTI)，一步法反转录PCR试剂盒(TakaRa BIOTECH公司)，大鼠PKC、β-actin引物由北京赛百盛生物工程公司合成。PKC引物序列：上游5'-CCGCCTCTACTTTGTGAT-3'，下游5'-CCTTGCGTTCGAGTTTCT-3'，长度563 bp。β-actin的序列：上游5'-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3'，下游5'-CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT-3',长度762bp。
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六、采用免疫组化方法检测PKC蛋白的表达
于实验结束时各组分别选10只大鼠，在结扎线以下取2cm厚的全心组织，放入福尔马林磷酸盐缓冲液中固定48h，石蜡包埋，切片， PKC一抗稀释倍数(1:100)，染色步骤如下：
1、切片脱蜡。
2、3%H2O2室温孵育10 min(以灭活内源性酶)，蒸溜水洗3次。
3、将切片浸入TAB(0.05 mol,pH 7.4)中，电炉加热至100℃，持续30 min后冷却。
4、滴加抗原修复液，室温孵育10 min，蒸溜水洗3次。
5、滴加正常5%兔血清封闭液，室温孵育10 min，甩去多余液体。
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6、滴加稀释的一抗，4℃湿盒内过夜。
7、TAB洗涤3次，3×5 min，滴加二抗室温孵育30 min。
8、TAB洗涤3次，3×5 min，滴加三抗(HIGH-SABC)室温孵育30 min。
9、TAB洗涤3次，3×5 min，DAB显色。
10、自来水冲洗，苏木复染，封片。
观察方法及判断标准：心肌组织中出现黄染为阳性。每张切片由2位观察者独立计数，随机取染色区域4个高倍视野(×400)阳性细胞平均数，用半定量计分，染色强度用0～3级计分：0为无染色；1为轻度阳性染色；2为中度阳性染色；3为强阳性染色。染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级；0级为无染色；1级为< 25%细胞染色；2级为25%～50%细胞染色；3级为50%～75%细胞染色;4级为> 75%细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。
(未完待续，下见本报7月25日第11版), 百拇医药(高秀梅张伯礼商洪才 王怡郭利平张萌史)
目的：复方丹参滴丸模拟和加强缺血预适应(IPC)的机制，是否通过促进蛋白激酶C(PKC)蛋白、mRNA水平表达发挥作用。方法：采用结扎大鼠冠脉缺血5 min、再灌注5 min反复循环3次的缺血预适应方案和缺血30 min，再灌注2h的缺血再灌模型，通过免疫组化、RT-PCR的方法观察PKC蛋白、mRNA表达以及复方丹参滴丸对其影响。 结果：PKC在正常对照组中主要存在胞浆，但经过IPC和使用复方丹参滴丸后，在胞膜和胞核也可见；不论早期IPC组，还是晚期IPC组PKC表达均高于假性预处理组，以早期IPC组明显，P< 0.01；经复方丹参滴丸预处理后，PKC的表达均高于再灌注组、早期IPC组、晚期IPC组，以药物预处理+ 缺血预处理组(DIPC)为优，显著高于早期IPC组，P< 0.01。PKC mRNA在正常心肌组织、再灌注组、假性预处理组间无明显差异，但IPC后不论早期，还是晚期PKC mRNA表达均高于假性预处理组，晚期IPC 组表现更加明显；经复方丹参预处理后，可明显促进早、晚期IPC及再灌注组PKC mRNA的表达，P< 0.05。结论：复方丹参滴丸可激活PKC，使其发生转位，促进其蛋白、mRNA表达水平增高。这可能是复方丹参滴丸模拟和加强IPC的主要机制之一。
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蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一个在组织中广泛分布的磷酸化酶，静息状态下定位于细胞胞浆中，受到刺激后，它可以转位至细胞膜、细胞核，PKC活化后在细胞分泌、增生、分化等功能中发挥着重要作用。PKC的激活在缺血预适应(IPC)跨膜信号传递过程中具有举足轻重地位,它是一类Ca2+、磷酯依赖性的蛋白激酶。IPC时，机体内源性保护物质释放增加，作用于相应的受体，经受体和G蛋白偶联激活磷酯酶C(PLC)，后者使膜上的磷酯酰丝氨酸水解为三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)，DAG是PKC激活剂，PKC通过移位，将信息传递于细胞核和细胞的外周，通过催化多种蛋白质磷酸化，进而对细胞产生保护作用。
我们的研究已证实，复方丹参滴丸对缺血再灌注的心肌损伤具有保护作用，它可加强IPC的保护效应，减轻缺血再灌注心肌坏死区重量，但其是否可以激活IPC级联反应中的关键物质PKC，促进其表达从而发挥对心肌缺血的保护作用，本实验从蛋白及mRNA表达水平进行了探讨。
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材料和方法
一、实验动物
SPF级雄性Sprage-Dawley大鼠180只，体重(443.65±36.13)g，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供；复方丹参滴丸浸膏由天津天士力集团有限公司研究院提供，批号20001010，经高压液相分析复方丹参滴丸中主要含丹参水溶性成分和三七总皂甙以及冰片。
二、动物模型的复制
用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉大鼠。行气管插管连接小动物呼吸机，频率80～90次/min，潮气量3～4 ml。持续记录心电图变化。开胸暴露心脏，用穿有5-0缝合线的3/8弯针钩绕左冠状动脉前降支主干。线两端共穿过一根聚乙烯小管以形成闭环。 拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生再灌注。结扎前1 min给予肝素(250 U/kg)。缺血性适应(IPC)模型制作，即缺血5 min、再灌注5 min，反复循环3次。间隔10 min后，再进行缺血30 min，再灌注2h。
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缺血的标志为ST段抬高和R波增高；左室发绀。
再灌注的标志为抬高的ST段和R波恢复；发绀区变红。
三、退出实验的标准
有下列情况之一的大鼠将退出实验：当灌注染色后，缺血重量(AAR)不足心脏重的15%；结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者；过度出血并致血压下降者；呼吸心跳停止超过30s者。
四、实验分组
将100只大鼠随机分为9组。其中90只大鼠完成了本实验。实验中有10只大鼠未满足本实验的入选标准而退出研究。退出的大鼠按最初的随机分组原则重新补上。除给药组外，其余各组均灌服公斤体重相符的生理盐水，各组处理的详细方案如下：
1、对照组(control)：不做任何处理。
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2、再灌注组(IR)：缺血30 min，再灌2h。
3、假性缺血预处理组(SIPC): 3个IPC时只穿线，不结扎；10 min后，缺血30 min，再灌2h。
4、缺血预处理组(IPC)：首先3个IPC，10 min后，缺血30 min，再灌2h。
5、药物预处理+ 缺血预处理组(DIPC)：灌药2h后，再进行IPC组过程。
6、药物预处理组(DIR)：灌药2h后，再进行再灌注组过程。
7、晚期假性缺血预处理组(SIPC/SWOP)：3个IPC时只穿线，恢复24h后，再进行再灌注组过程。
8、晚期缺血预处理组(IPC/SWOP)：3个IPC后，恢复24h再进行再灌注组过程。
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9、晚期药物预处理+缺血预处理组(DIPC/SWOP)：灌药2h后，进行3个IPC，恢复24h后进行再灌注组过程。
五、主要试剂与仪器
主要试剂：PKC小鼠抗大鼠单克隆抗体(Santa Gruz),生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)，辣根酶标记链亲合素(三抗)，DAB、封闭用山羊血清(博士德试剂公司)，DEPC、琼脂糖(sigmag),TRIZOL Reagent(LTI)，一步法反转录PCR试剂盒(TakaRa BIOTECH公司)，大鼠PKC、β-actin引物由北京赛百盛生物工程公司合成。PKC引物序列：上游5'-CCGCCTCTACTTTGTGAT-3'，下游5'-CCTTGCGTTCGAGTTTCT-3'，长度563 bp。β-actin的序列：上游5'-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3'，下游5'-CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT-3',长度762bp。
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六、采用免疫组化方法检测PKC蛋白的表达
于实验结束时各组分别选10只大鼠，在结扎线以下取2cm厚的全心组织，放入福尔马林磷酸盐缓冲液中固定48h，石蜡包埋，切片， PKC一抗稀释倍数(1:100)，染色步骤如下：
1、切片脱蜡。
2、3%H2O2室温孵育10 min(以灭活内源性酶)，蒸溜水洗3次。
3、将切片浸入TAB(0.05 mol,pH 7.4)中，电炉加热至100℃，持续30 min后冷却。
4、滴加抗原修复液，室温孵育10 min，蒸溜水洗3次。
5、滴加正常5%兔血清封闭液，室温孵育10 min，甩去多余液体。
, http://www.100md.com
6、滴加稀释的一抗，4℃湿盒内过夜。
7、TAB洗涤3次，3×5 min，滴加二抗室温孵育30 min。
8、TAB洗涤3次，3×5 min，滴加三抗(HIGH-SABC)室温孵育30 min。
9、TAB洗涤3次，3×5 min，DAB显色。
10、自来水冲洗，苏木复染，封片。
观察方法及判断标准：心肌组织中出现黄染为阳性。每张切片由2位观察者独立计数，随机取染色区域4个高倍视野(×400)阳性细胞平均数，用半定量计分，染色强度用0～3级计分：0为无染色；1为轻度阳性染色；2为中度阳性染色；3为强阳性染色。染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级；0级为无染色；1级为< 25%细胞染色；2级为25%～50%细胞染色；3级为50%～75%细胞染色;4级为> 75%细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。
(未完待续，下见本报7月25日第11版), 百拇医药(高秀梅张伯礼商洪才 王怡郭利平张萌史)