脑缺血损伤机制和治疗策略研究进展
[摘要] 缺血性中风是目前严重威胁人类健康的几种疾病之一，对其损伤机制的研究正逐步深入，除兴奋性毒性、钙超载外，还包括细胞凋亡、炎症、自由基、一氧化氮以及线粒体的损伤，同时，机体亦有内在的保护机制。尽管临床治疗仍以溶栓为主，谷氨酸受体拮抗剂、钙拮抗剂、自由基清除剂和半胱天冬酶抑制剂的保护作用的研究已取得了进展。
[关键词] 缺血性中风；谷氨酸；凋亡；炎症；自由基；线粒体；腺苷
缺血性中风(ischemic stroke)是由于某动脉供血区的血流因栓塞或出血而暂时或永久地减少所致，其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应。从近年关于脑缺血的文献中可以发现，一方面对其机制的了解越来越深入；另一方面，有效的治疗手段仍然缺乏，尽管在动物模型上已取得多种有希望的治疗方法，临床试验的结果却令人失望。目前临床还是以溶栓为主，但应用中存在出血的危险和其他限制。本文将对目前脑缺血研究中几个令人关注的方面作一综述。
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1 谷氨酸(Glu)
Glu受体的过度激活是引起缺血神经元死亡的主要因素，兴奋性毒性不仅引起急性坏死，也启动延迟性细胞死亡，还与缺血后的炎症反应有关。由于恢复血供后，细胞内钙([Ca2+]i)可回到正常水平，积累的Glu在九分钟内也可被Giu运载体摄取。Szatkowski等提出一种假设：缺血时短暂的过量Glu释放和[Ca2+]i超载将产生长时程的突触传递增强，即使缺血后正常水平的Glu的释放也会高度刺激神经网络，产生异常兴奋，引起能量需求加大和脑内Ca2+堆积，最终导致神经元死亡。
抑制兴奋性毒性是治疗中风的首要目标，动物实验也取得了一定的效果，但临床试验结果却不理想，这主要是因为与动物模型相比，中风患者具有极度的异质性和治疗时间有所延误。同时，产生神经保护作用的药物浓度过高，会阻断正常脑组织的Glu受体，产生不良反应，如高/低血压、拟精神病症状等。目前的策略是找出导致损伤而对正常脑组织功能影响很小的受体亚型或只阻断缺血部位的受体。已发现某些ifenprodil类似物在类似缺血组织的酸性环境中作用增强，是否可以设计一种药物在正常pH无活性而在低pH时产生强大作用，或者采用低亲和力的非竞争性拮抗剂，发挥强的阻滞作用后很快恢复，不影响正常突触传递。此外，α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂在几种啮齿类动物模型上显示了强的神经保护作用，其治疗窗超过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，如ZK 200775(>4h)，几个公司正在开发此类药物。
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2 [Ca2+]i
在兴奋性氨基酸毒性-脑浆Ca2+超载-缺氧缺血神经元损伤中，Ca2+占据着中心位置，许多减少脑缺血神经元损伤的策略都是直接或间接以脑内Ca2+为目标。考虑到Ca2+拮抗剂在心绞痛中的疗效，10年来有不少Ca2+拮抗剂已用于临床抗脑缺血的治疗，但在几项大规模临床试验中都未显示疗效。不过，对Ca2+拮抗剂的研究并未停止，新的非选择性Ca2+拮抗剂如NNC 09-0026，CNS-1237和SB 201823-A总的来说对局灶性缺血模型比全脑缺血更有效，而选择性N型Ca2+通道拮抗剂在局灶性和全脑缺血模型中都显示了极好的效果，引起了研究者的广泛兴趣，作用于神经元的亚型选择性拮抗剂将代替有血管扩张作用的L型Ca2+拮抗剂成为新的研究方向。尽管大量实验支持缺血时Ca2+过Glu受体通道内流造成Ca2+胞内超载，但有些实验也提出了异议，Pisani等的实验发现，在大鼠脑片诱发皮层锥体细胞缺氧缺糖8～12min，同时记录膜电位和胞浆游离Ca2+，观察到先是早超极化，随后是一个大而可逆的去极化并伴有[Ca2+]i的升高，L型Ca2+通道拮抗剂尼莫地平强烈抑制膜电位变化和[Ca2+]i升高，L型Ca2+通道激动剂Bay K8644则相反。抑制内Ca2+释放的dantrolene，NMDA受体拮抗剂D-APV，AMPA受体拮抗剂CNQX，I/II型代谢型Glu受体拮抗剂MCPG和Na+通道阻断剂TTX对此均无影响，由此说明缺血早期膜电位和[Ca2+]i的变化是由Ca2+通过L型Ca2+通道内流形成的。近期一项调整设计的临床试验也发现在中风后12h内服用尼莫地平显示出了疗效，当然，在缺血过程的不同阶段，Ca2+通道和Glu通道的开放到底以谁为主，是否具有脑区特异性仍是有待解决的问题。
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3 细胞凋亡
在缺血中心周围半暗区的血流供应由于侧枝血管而未完全中断，处于一种电生理静止而能量尚未耗竭的状态，神经元在这种中度缺血状态并不立即死亡，可存活数小时，这期间如果及时再灌或使用Glu受体拮抗剂将逆转神经元的死亡。若脑缺血严重且持续时间长，则神经元表现为急性坏死，若缺血后很快恢复血供，则神经元的形态、功能虽无改变，但在某些易损区如海马，几天后将发生迟发性神经元死亡，这种死亡与半暗区神经元的死亡可能具有相同的机制。缺血脑损伤是缺血后坏死和延迟性细胞死亡的联合效应，可以想象，与缺血后急性坏死狭窄的时间窗相比，通过干预缺血几天后的延迟性细胞死亡对治疗缺血脑损伤明显有利。
在动物脑中风模型中，神经元存在脑浆与核固缩以及DNA裂解等凋亡特征。不少证据也显示在缺血损伤中存在神经元凋亡。半胱天冬酶(caspase)家族的成员是凋亡的主要启动和执行成分，zVAD-fmk、选择性的caspase-3抑制剂zDEVD-fmk和选择性caspase-1抑制剂YVAD-cmk都能减轻大脑中动脉闭塞(MCAO)后的组织损伤，非特异性的非肽类半胱天冬酶抑制剂由于能通过血脑屏障及进入神经元与胶质细胞，将是新的治疗中风和其他脑损伤的途径。半胱天冬酶抑制剂的治疗窗远大于Glu受体拮抗剂，在中度缺血后再灌9h，zDEVD-fmk仍有保护作用，而MK-801只在损伤后1h内有效，二者的合用将进一步减少缺血后损伤，并协同扩展治疗窗。凋亡过程需新蛋白的合成，使用蛋白合成抑制剂如环己酰亚胺可减少MCAO后的梗塞体积，同时使用NMOA受体拮抗剂和环己酰亚胺以阻断缺血坏死和凋亡使局灶性缺血大鼠的梗塞体积进一步缩小。
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需要指出的是，最近Colbourne等检查了沙土鼠全脑缺血5min后海马CA1区的损伤特征，发现缺血后d 4有96%的CA1神经元死亡，但是电子显微镜的观察结果发现缺血神经元的死亡表现为坏死而非凋亡的形态特征，如膨胀的细胞器和核内的空泡。这与过去认为全脑缺血后海马CA1区神经元死亡为凋亡的看法不同，并且认为过去基于DNA梯状电泳，切口末端标记和光学显微镜的判断并不可靠。而在另一项研究中，用klenow标记法检测带5'突出端的DNA单链断裂或DNA双链断裂，用TUNEL法检测带3'突出端或平端的DNA双链断裂，发现丘脑、皮层klenow阳性比TUNEL阳性出现早，再灌2h即出现，与其他易损区不同，CA1区在再灌后72h后才发现断裂DNA双链和单链，说明CA1区的凋亡机制与其他脑区有区别，其确切机制有待更深入的研究。
4 炎症、一氧化氮(NO)与自由基
4.1 炎症 缺血/再灌后的Ca2+超载和自由基诱导许多促炎症基因的表达。缺血神经元可以表达脂氧酶-2(COX-2)，产生过氧化物和毒性前列腺素类物质，血管内皮细胞也诱导表达粘附分子，与中性粒细胞发生粘附，导致炎性细胞穿过血管壁进入脑实质。脑细胞如星状细胞和小胶质细胞也参与炎症反应，缺血后4～6h，星状胶质细胞开始肥厚而小胶质细胞则变形活化生成NO和氧自由基等神经毒性物质。某些细胞因子是脑中重要的炎症介质，IL-1β，IL-6和了NF-α都与缺血后神经元丢失有关。用转基因方法过量表达重组人IL-1受体拮抗蛋白可以减少脑缺血损伤，小鼠MCAO后用Western blot和免疫组化对ICAM-1进行定量和定位，发现转染IL-1受体拮抗蛋白的小鼠血管内皮ICAM-l的表达减少，说明IL-1在局灶性脑缺血中通过激活炎症引起的细胞粘附发挥重要作用。能诱导全身中性粒细胞减少以阻止中性粒细胞的浸润，通过抗体中和粘附分子及其受体，或者能够抑制产生毒性介质的酶如iNOS或COX-2的药物将成为治疗缺血性中风的目标。
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4.2 NO 不同的NO合酶(NOS)在脑缺血中起不同的作用，诱生型NO合酶(iNOS)在缺血再灌过程中是一个重要的炎症介质，不仅在浸润缺血脑组织的中性粒细胞和缺血区血管壁表达，在星状胶质细胞和小胶质细胞也都表达iNOS，生成的过量NO还能与O2·反应形成毒性更大的OONO-。在小鼠MCAO缺血模型中选择性COX-2抑制剂NS 398能减少梗塞体积并改善运动障碍，但对于iNOS基因缺失的小鼠，NS 398则无影响，此时神经元型NO合酶(nNOS)抑制剂7-NI能减少皮层梗塞面积，说明COX-2的产物参与脑缺血损伤，并且iNOS产生的NO与此过程有关。神经元的nNOS也参与神经损伤，而内皮细胞的内皮型NO合酶(eNOS)则维持内皮功能完整，包括抑制白细胞和血小板粘附、调节血张力等。转基因动物模型更明确地显示了它们各自在脑缺血中的作用，在局灶性脑缺血情况下，eNOS基因敲除的小鼠形成的梗塞大，而缺少iNOS基因的小鼠与野生型相比梗塞大为缩小，nNOS基因敲除的小鼠形成的梗塞也小。
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HMG-CoA还原酶抑制剂(statins)原为抗动脉粥样硬化药，最近的临床观察发现statins能明显改善缺血中风症状，其机制并非通过抗脑血管粥样硬化和抗血栓作用。statins在脑缺血中可以刺激内皮细胞eNOS表达，同时抑制iNOS，从而协同发挥神经保护作用，这种维持内皮细胞eNOS活性的内皮重构功能是statins抗脑缺血的主要机制。statins疗法也许是一条改善脑缺血炎性神经元丢失的新途径。
4.3 自由基 自发或由治疗所引起的再灌将在半暗区产生大量反应性氧化物(ROS)，超过细胞内在的清除能力，产生脂质过氧化和膜损伤，ROS还作为重要的信号分子引发炎症和凋亡，如诱导促炎症转录因子NF-κB的表达，即使在局灶性脑缺血的后期使用自由基清除剂也有效，更说明自由基在脑缺血损伤中的重要性。
中性粒细胞通过产生大量O2·参与缺血后再灌注损伤，长时间缺血后内皮细胞不断损伤，中性粒细胞的激活更加明显，给予抗中性粒细胞的抗CD-18抗体能显著减少MCA0 120 min后再灌大鼠皮层半暗区的中性粒细胞积累和O2·浓度，而对MCAO 60～90min后再灌大鼠则无作用，说明缺血不同时间后氧自由基的作用途径不同。ACE抑制剂在自发性高血压和正常血压大鼠都能保护脑缺血损伤，在原代培养的鸡胚端脑神经元，莫昔普利(moexipril)和依那普利(enalapril)能剂量依赖性地减少Glu，staturosporine，Fe2+/3+诱导的线粒体ROS生成和神经元损伤，说明ACE抑制剂通过清除自由基增加神经元的存活。
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5 线粒体
线粒体在真核细胞的代谢中起重要作用，是ATP的合成场所并参与脑浆钙稳态的调节。现在认为，线粒体细胞色素C的释放是凋亡重要的前期事件。在缺血期，由于能量耗竭，细胞膜上能量依赖的离子泵受损，造成细胞内外离子浓度失调，去极化使胞内Ca2+超载。此时线粒体可以通过膜上运载体摄取胞脑浆中的Ca2+，起一种细胞内缓冲器作用，摄取由线粒体膜电位驱动并与[Ca2+]i成比例。如果[Ca2+]i很高，则会摄取大量的Ca2+，同时质子大量泵出，消耗ATP并产生大量活性氧自由基。氧化应激和线粒体基质高Ca2+诱发线粒体通透性跃迁(MPT)，MPT是由于线粒体内膜上一种多蛋白复合物孔道的开放引起，孔道为电压操纵的阳离子通道，去极化、基质Ca2+升高和氧化剂有利于其开放。MPT打破线粒体内膜的通透性屏障，释放出Ca2+，消除质子梯度使氧化磷酸化中断，并出现渗透性肿胀，内膜的嵴伸展使外膜胀破，释放出位于内外膜之间的细胞色素C，短暂的MPT释放出少量细胞色素C，激活caspase-9，casPase-9再激活其他caspase如caspase-3引起凋亡。而长时间缺血后的再灌将产生大而不可逆的MPT，造成线粒体结构破坏，使呼吸链中断，并失去自由基清除能力，Ca2+激活的细胞降解和自由基损伤最终导致细胞坏死。环孢菌素A是MPT孔道抑制剂，在缺血2h再灌时给环孢菌素A能显著减少MCAO大鼠的梗塞体积，说明阻断MPT，维持线粒体的完整和功能在缺血后再灌期至关重要。线粒体膜电位一般为120～170 mV，远大于其他部位，这使线粒体能吸引阳离子，能穿过脂质体的亲脂性阳离子将很容易地向线粒体富集。目前已设计出以亲脂性阳离子为载体的抗癌药，以此为借鉴，设计增加线粒体Ca2+容量或能防止氧化应激的药物将可保护线粒体损伤。
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最近，Paschen等提出了神经元损伤的内质网假说，对线粒体损伤模式做了补充。内质网功能的紊乱是许多急慢性脑病理情况下神经元损伤的共同标志。内质网在新合成蛋白的折叠和加工中起关键作用，所有这些过程都是Ca2+依赖的，所以内质网Ca2+稳态对维持细胞生理功能很重要，内质网Ca2+库耗竭会产生严重的应激反应，包括抑制蛋白合成，激活应激基因表达，这与缺血诱导的反应相似，说明二者存在共同的机制。内质网Ca2+库由控制Ca2+释放的IP3受体和ryanodine受体以及控制Ca2+摄入的Ca2+泵调节，海马CA1区IP3受体密度特别高，而Ca2+泵免疫活性却相对较低，这种Ca2+释放和摄入的不平衡性可能是其对缺血敏感的结构基础。
6 缺血性预适应与内源性保护物质
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6.1 缺血性预适应 脑缺血后，机体也会作出反应，主动地产生神经保护作用，这种机体内在的对抗机制使机体能耐受一定程度的缺血损伤。如事先短暂的缺血或预适应可动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重缺血产生保护作用。一般认为心肌缺血预处理时，ATP降解生成的腺苷与腺苷受体结合，激活蛋白激酶C(PKC)，使PKC从脑浆向膜内转位，从而抑制随后的缺血所致的Ca2+内流和兴奋性氨基酸的释放，并增加K+及Cl-电导，稳定细胞膜。但在培养大鼠皮层神经元，缺血预适应的保护效应不能被PKC抑制剂staurosporine或PKC抗体以及MAPK抑制剂取消，说明神经细胞缺血预适应机制与心肌组织有所不同，并不需要PKC或MAPK的激活。
化学缺血预适应是近来发展的用药物造成轻度缺氧以诱发中枢神经系统的缺氧耐受性，如3-NP能提高缺氧耐受性，改善缺氧时的能量代谢，减少自由基的生成和维持神经元的功能，阿司匹林正是已在临床使用的具有化学缺血预适应作用的药物。化学缺血预适应可以提高机体的初级缺氧耐受力(primary hypoxic tolerance)，研究发现这与动物的性别及雌性动物的动情周期有关。预先给予3-NP和阿司匹林，雄性大鼠和处于动情前期的雌性大鼠脑片15min缺氧后群峰电位幅度明显恢复，而对发情间期的雌鼠则无效。
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6.2 腺苷 腺苷被认为是一种内源性保护物质。在电生理活动增加、缺氧、缺血等代谢应激时，由于ATP的分解产生大量腺苷，在大脑中，A1受体与GABA受体一样是重要的抑制性调节因素，包括减少突触前Glu、多巴胺等的释放，稳定突触前膜，减弱NMDA受体兴奋性；在缺血动物模型上，易损区A1受体很快减少，这种受体的丢失以及对随后兴奋性传入冲动的去抑制也许是脑缺血中选择性易损现象的机制之一，也可能是再灌过程中持续低水平的NMDA受体激活可以不断增加脑损伤体积的原因之一。在缺血状态下，细胞外高浓度的腺苷既有抑制能量代谢又有显著的降温作用，而体温对中风的预后至关重要，体温升高1℃，危险将增加2.2倍，而且，尽管缺血后A1受体迅速减少，但腺苷摄取或降解抑制剂以及腺苷受体激动剂的治疗窗都比较长，如A1受体激动剂ADAC在沙土鼠缺血后12h给药仍可显著减少神经元丢失。已有大量实验显示激动A1受体明显减少局灶和全脑缺血动物的致病和致死性，A1受体激动剂用于脑缺血治疗的可能性正在进一步研究之中。
7 结语
脑是人体最重要的器官，脑缺血后，机体主动或被动地作出广泛的反应，对所有这些反应的介入都会对缺血的后果产生影响。随着我们对缺血损伤机制越来越多的了解，抗脑缺血的策略也有了更多的选择，这种严重威胁人类健康的顽疾，相信总有一天会被攻克。, 百拇医药
[关键词] 缺血性中风；谷氨酸；凋亡；炎症；自由基；线粒体；腺苷
缺血性中风(ischemic stroke)是由于某动脉供血区的血流因栓塞或出血而暂时或永久地减少所致，其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应。从近年关于脑缺血的文献中可以发现，一方面对其机制的了解越来越深入；另一方面，有效的治疗手段仍然缺乏，尽管在动物模型上已取得多种有希望的治疗方法，临床试验的结果却令人失望。目前临床还是以溶栓为主，但应用中存在出血的危险和其他限制。本文将对目前脑缺血研究中几个令人关注的方面作一综述。
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1 谷氨酸(Glu)
Glu受体的过度激活是引起缺血神经元死亡的主要因素，兴奋性毒性不仅引起急性坏死，也启动延迟性细胞死亡，还与缺血后的炎症反应有关。由于恢复血供后，细胞内钙([Ca2+]i)可回到正常水平，积累的Glu在九分钟内也可被Giu运载体摄取。Szatkowski等提出一种假设：缺血时短暂的过量Glu释放和[Ca2+]i超载将产生长时程的突触传递增强，即使缺血后正常水平的Glu的释放也会高度刺激神经网络，产生异常兴奋，引起能量需求加大和脑内Ca2+堆积，最终导致神经元死亡。
抑制兴奋性毒性是治疗中风的首要目标，动物实验也取得了一定的效果，但临床试验结果却不理想，这主要是因为与动物模型相比，中风患者具有极度的异质性和治疗时间有所延误。同时，产生神经保护作用的药物浓度过高，会阻断正常脑组织的Glu受体，产生不良反应，如高/低血压、拟精神病症状等。目前的策略是找出导致损伤而对正常脑组织功能影响很小的受体亚型或只阻断缺血部位的受体。已发现某些ifenprodil类似物在类似缺血组织的酸性环境中作用增强，是否可以设计一种药物在正常pH无活性而在低pH时产生强大作用，或者采用低亲和力的非竞争性拮抗剂，发挥强的阻滞作用后很快恢复，不影响正常突触传递。此外，α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂在几种啮齿类动物模型上显示了强的神经保护作用，其治疗窗超过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，如ZK 200775(>4h)，几个公司正在开发此类药物。
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2 [Ca2+]i
在兴奋性氨基酸毒性-脑浆Ca2+超载-缺氧缺血神经元损伤中，Ca2+占据着中心位置，许多减少脑缺血神经元损伤的策略都是直接或间接以脑内Ca2+为目标。考虑到Ca2+拮抗剂在心绞痛中的疗效，10年来有不少Ca2+拮抗剂已用于临床抗脑缺血的治疗，但在几项大规模临床试验中都未显示疗效。不过，对Ca2+拮抗剂的研究并未停止，新的非选择性Ca2+拮抗剂如NNC 09-0026，CNS-1237和SB 201823-A总的来说对局灶性缺血模型比全脑缺血更有效，而选择性N型Ca2+通道拮抗剂在局灶性和全脑缺血模型中都显示了极好的效果，引起了研究者的广泛兴趣，作用于神经元的亚型选择性拮抗剂将代替有血管扩张作用的L型Ca2+拮抗剂成为新的研究方向。尽管大量实验支持缺血时Ca2+过Glu受体通道内流造成Ca2+胞内超载，但有些实验也提出了异议，Pisani等的实验发现，在大鼠脑片诱发皮层锥体细胞缺氧缺糖8～12min，同时记录膜电位和胞浆游离Ca2+，观察到先是早超极化，随后是一个大而可逆的去极化并伴有[Ca2+]i的升高，L型Ca2+通道拮抗剂尼莫地平强烈抑制膜电位变化和[Ca2+]i升高，L型Ca2+通道激动剂Bay K8644则相反。抑制内Ca2+释放的dantrolene，NMDA受体拮抗剂D-APV，AMPA受体拮抗剂CNQX，I/II型代谢型Glu受体拮抗剂MCPG和Na+通道阻断剂TTX对此均无影响，由此说明缺血早期膜电位和[Ca2+]i的变化是由Ca2+通过L型Ca2+通道内流形成的。近期一项调整设计的临床试验也发现在中风后12h内服用尼莫地平显示出了疗效，当然，在缺血过程的不同阶段，Ca2+通道和Glu通道的开放到底以谁为主，是否具有脑区特异性仍是有待解决的问题。
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3 细胞凋亡
在缺血中心周围半暗区的血流供应由于侧枝血管而未完全中断，处于一种电生理静止而能量尚未耗竭的状态，神经元在这种中度缺血状态并不立即死亡，可存活数小时，这期间如果及时再灌或使用Glu受体拮抗剂将逆转神经元的死亡。若脑缺血严重且持续时间长，则神经元表现为急性坏死，若缺血后很快恢复血供，则神经元的形态、功能虽无改变，但在某些易损区如海马，几天后将发生迟发性神经元死亡，这种死亡与半暗区神经元的死亡可能具有相同的机制。缺血脑损伤是缺血后坏死和延迟性细胞死亡的联合效应，可以想象，与缺血后急性坏死狭窄的时间窗相比，通过干预缺血几天后的延迟性细胞死亡对治疗缺血脑损伤明显有利。
在动物脑中风模型中，神经元存在脑浆与核固缩以及DNA裂解等凋亡特征。不少证据也显示在缺血损伤中存在神经元凋亡。半胱天冬酶(caspase)家族的成员是凋亡的主要启动和执行成分，zVAD-fmk、选择性的caspase-3抑制剂zDEVD-fmk和选择性caspase-1抑制剂YVAD-cmk都能减轻大脑中动脉闭塞(MCAO)后的组织损伤，非特异性的非肽类半胱天冬酶抑制剂由于能通过血脑屏障及进入神经元与胶质细胞，将是新的治疗中风和其他脑损伤的途径。半胱天冬酶抑制剂的治疗窗远大于Glu受体拮抗剂，在中度缺血后再灌9h，zDEVD-fmk仍有保护作用，而MK-801只在损伤后1h内有效，二者的合用将进一步减少缺血后损伤，并协同扩展治疗窗。凋亡过程需新蛋白的合成，使用蛋白合成抑制剂如环己酰亚胺可减少MCAO后的梗塞体积，同时使用NMOA受体拮抗剂和环己酰亚胺以阻断缺血坏死和凋亡使局灶性缺血大鼠的梗塞体积进一步缩小。
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需要指出的是，最近Colbourne等检查了沙土鼠全脑缺血5min后海马CA1区的损伤特征，发现缺血后d 4有96%的CA1神经元死亡，但是电子显微镜的观察结果发现缺血神经元的死亡表现为坏死而非凋亡的形态特征，如膨胀的细胞器和核内的空泡。这与过去认为全脑缺血后海马CA1区神经元死亡为凋亡的看法不同，并且认为过去基于DNA梯状电泳，切口末端标记和光学显微镜的判断并不可靠。而在另一项研究中，用klenow标记法检测带5'突出端的DNA单链断裂或DNA双链断裂，用TUNEL法检测带3'突出端或平端的DNA双链断裂，发现丘脑、皮层klenow阳性比TUNEL阳性出现早，再灌2h即出现，与其他易损区不同，CA1区在再灌后72h后才发现断裂DNA双链和单链，说明CA1区的凋亡机制与其他脑区有区别，其确切机制有待更深入的研究。
4 炎症、一氧化氮(NO)与自由基
4.1 炎症 缺血/再灌后的Ca2+超载和自由基诱导许多促炎症基因的表达。缺血神经元可以表达脂氧酶-2(COX-2)，产生过氧化物和毒性前列腺素类物质，血管内皮细胞也诱导表达粘附分子，与中性粒细胞发生粘附，导致炎性细胞穿过血管壁进入脑实质。脑细胞如星状细胞和小胶质细胞也参与炎症反应，缺血后4～6h，星状胶质细胞开始肥厚而小胶质细胞则变形活化生成NO和氧自由基等神经毒性物质。某些细胞因子是脑中重要的炎症介质，IL-1β，IL-6和了NF-α都与缺血后神经元丢失有关。用转基因方法过量表达重组人IL-1受体拮抗蛋白可以减少脑缺血损伤，小鼠MCAO后用Western blot和免疫组化对ICAM-1进行定量和定位，发现转染IL-1受体拮抗蛋白的小鼠血管内皮ICAM-l的表达减少，说明IL-1在局灶性脑缺血中通过激活炎症引起的细胞粘附发挥重要作用。能诱导全身中性粒细胞减少以阻止中性粒细胞的浸润，通过抗体中和粘附分子及其受体，或者能够抑制产生毒性介质的酶如iNOS或COX-2的药物将成为治疗缺血性中风的目标。
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4.2 NO 不同的NO合酶(NOS)在脑缺血中起不同的作用，诱生型NO合酶(iNOS)在缺血再灌过程中是一个重要的炎症介质，不仅在浸润缺血脑组织的中性粒细胞和缺血区血管壁表达，在星状胶质细胞和小胶质细胞也都表达iNOS，生成的过量NO还能与O2·反应形成毒性更大的OONO-。在小鼠MCAO缺血模型中选择性COX-2抑制剂NS 398能减少梗塞体积并改善运动障碍，但对于iNOS基因缺失的小鼠，NS 398则无影响，此时神经元型NO合酶(nNOS)抑制剂7-NI能减少皮层梗塞面积，说明COX-2的产物参与脑缺血损伤，并且iNOS产生的NO与此过程有关。神经元的nNOS也参与神经损伤，而内皮细胞的内皮型NO合酶(eNOS)则维持内皮功能完整，包括抑制白细胞和血小板粘附、调节血张力等。转基因动物模型更明确地显示了它们各自在脑缺血中的作用，在局灶性脑缺血情况下，eNOS基因敲除的小鼠形成的梗塞大，而缺少iNOS基因的小鼠与野生型相比梗塞大为缩小，nNOS基因敲除的小鼠形成的梗塞也小。
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HMG-CoA还原酶抑制剂(statins)原为抗动脉粥样硬化药，最近的临床观察发现statins能明显改善缺血中风症状，其机制并非通过抗脑血管粥样硬化和抗血栓作用。statins在脑缺血中可以刺激内皮细胞eNOS表达，同时抑制iNOS，从而协同发挥神经保护作用，这种维持内皮细胞eNOS活性的内皮重构功能是statins抗脑缺血的主要机制。statins疗法也许是一条改善脑缺血炎性神经元丢失的新途径。
4.3 自由基 自发或由治疗所引起的再灌将在半暗区产生大量反应性氧化物(ROS)，超过细胞内在的清除能力，产生脂质过氧化和膜损伤，ROS还作为重要的信号分子引发炎症和凋亡，如诱导促炎症转录因子NF-κB的表达，即使在局灶性脑缺血的后期使用自由基清除剂也有效，更说明自由基在脑缺血损伤中的重要性。
中性粒细胞通过产生大量O2·参与缺血后再灌注损伤，长时间缺血后内皮细胞不断损伤，中性粒细胞的激活更加明显，给予抗中性粒细胞的抗CD-18抗体能显著减少MCA0 120 min后再灌大鼠皮层半暗区的中性粒细胞积累和O2·浓度，而对MCAO 60～90min后再灌大鼠则无作用，说明缺血不同时间后氧自由基的作用途径不同。ACE抑制剂在自发性高血压和正常血压大鼠都能保护脑缺血损伤，在原代培养的鸡胚端脑神经元，莫昔普利(moexipril)和依那普利(enalapril)能剂量依赖性地减少Glu，staturosporine，Fe2+/3+诱导的线粒体ROS生成和神经元损伤，说明ACE抑制剂通过清除自由基增加神经元的存活。
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5 线粒体
线粒体在真核细胞的代谢中起重要作用，是ATP的合成场所并参与脑浆钙稳态的调节。现在认为，线粒体细胞色素C的释放是凋亡重要的前期事件。在缺血期，由于能量耗竭，细胞膜上能量依赖的离子泵受损，造成细胞内外离子浓度失调，去极化使胞内Ca2+超载。此时线粒体可以通过膜上运载体摄取胞脑浆中的Ca2+，起一种细胞内缓冲器作用，摄取由线粒体膜电位驱动并与[Ca2+]i成比例。如果[Ca2+]i很高，则会摄取大量的Ca2+，同时质子大量泵出，消耗ATP并产生大量活性氧自由基。氧化应激和线粒体基质高Ca2+诱发线粒体通透性跃迁(MPT)，MPT是由于线粒体内膜上一种多蛋白复合物孔道的开放引起，孔道为电压操纵的阳离子通道，去极化、基质Ca2+升高和氧化剂有利于其开放。MPT打破线粒体内膜的通透性屏障，释放出Ca2+，消除质子梯度使氧化磷酸化中断，并出现渗透性肿胀，内膜的嵴伸展使外膜胀破，释放出位于内外膜之间的细胞色素C，短暂的MPT释放出少量细胞色素C，激活caspase-9，casPase-9再激活其他caspase如caspase-3引起凋亡。而长时间缺血后的再灌将产生大而不可逆的MPT，造成线粒体结构破坏，使呼吸链中断，并失去自由基清除能力，Ca2+激活的细胞降解和自由基损伤最终导致细胞坏死。环孢菌素A是MPT孔道抑制剂，在缺血2h再灌时给环孢菌素A能显著减少MCAO大鼠的梗塞体积，说明阻断MPT，维持线粒体的完整和功能在缺血后再灌期至关重要。线粒体膜电位一般为120～170 mV，远大于其他部位，这使线粒体能吸引阳离子，能穿过脂质体的亲脂性阳离子将很容易地向线粒体富集。目前已设计出以亲脂性阳离子为载体的抗癌药，以此为借鉴，设计增加线粒体Ca2+容量或能防止氧化应激的药物将可保护线粒体损伤。
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最近，Paschen等提出了神经元损伤的内质网假说，对线粒体损伤模式做了补充。内质网功能的紊乱是许多急慢性脑病理情况下神经元损伤的共同标志。内质网在新合成蛋白的折叠和加工中起关键作用，所有这些过程都是Ca2+依赖的，所以内质网Ca2+稳态对维持细胞生理功能很重要，内质网Ca2+库耗竭会产生严重的应激反应，包括抑制蛋白合成，激活应激基因表达，这与缺血诱导的反应相似，说明二者存在共同的机制。内质网Ca2+库由控制Ca2+释放的IP3受体和ryanodine受体以及控制Ca2+摄入的Ca2+泵调节，海马CA1区IP3受体密度特别高，而Ca2+泵免疫活性却相对较低，这种Ca2+释放和摄入的不平衡性可能是其对缺血敏感的结构基础。
6 缺血性预适应与内源性保护物质
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6.1 缺血性预适应 脑缺血后，机体也会作出反应，主动地产生神经保护作用，这种机体内在的对抗机制使机体能耐受一定程度的缺血损伤。如事先短暂的缺血或预适应可动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重缺血产生保护作用。一般认为心肌缺血预处理时，ATP降解生成的腺苷与腺苷受体结合，激活蛋白激酶C(PKC)，使PKC从脑浆向膜内转位，从而抑制随后的缺血所致的Ca2+内流和兴奋性氨基酸的释放，并增加K+及Cl-电导，稳定细胞膜。但在培养大鼠皮层神经元，缺血预适应的保护效应不能被PKC抑制剂staurosporine或PKC抗体以及MAPK抑制剂取消，说明神经细胞缺血预适应机制与心肌组织有所不同，并不需要PKC或MAPK的激活。
化学缺血预适应是近来发展的用药物造成轻度缺氧以诱发中枢神经系统的缺氧耐受性，如3-NP能提高缺氧耐受性，改善缺氧时的能量代谢，减少自由基的生成和维持神经元的功能，阿司匹林正是已在临床使用的具有化学缺血预适应作用的药物。化学缺血预适应可以提高机体的初级缺氧耐受力(primary hypoxic tolerance)，研究发现这与动物的性别及雌性动物的动情周期有关。预先给予3-NP和阿司匹林，雄性大鼠和处于动情前期的雌性大鼠脑片15min缺氧后群峰电位幅度明显恢复，而对发情间期的雌鼠则无效。
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6.2 腺苷 腺苷被认为是一种内源性保护物质。在电生理活动增加、缺氧、缺血等代谢应激时，由于ATP的分解产生大量腺苷，在大脑中，A1受体与GABA受体一样是重要的抑制性调节因素，包括减少突触前Glu、多巴胺等的释放，稳定突触前膜，减弱NMDA受体兴奋性；在缺血动物模型上，易损区A1受体很快减少，这种受体的丢失以及对随后兴奋性传入冲动的去抑制也许是脑缺血中选择性易损现象的机制之一，也可能是再灌过程中持续低水平的NMDA受体激活可以不断增加脑损伤体积的原因之一。在缺血状态下，细胞外高浓度的腺苷既有抑制能量代谢又有显著的降温作用，而体温对中风的预后至关重要，体温升高1℃，危险将增加2.2倍，而且，尽管缺血后A1受体迅速减少，但腺苷摄取或降解抑制剂以及腺苷受体激动剂的治疗窗都比较长，如A1受体激动剂ADAC在沙土鼠缺血后12h给药仍可显著减少神经元丢失。已有大量实验显示激动A1受体明显减少局灶和全脑缺血动物的致病和致死性，A1受体激动剂用于脑缺血治疗的可能性正在进一步研究之中。
7 结语
脑是人体最重要的器官，脑缺血后，机体主动或被动地作出广泛的反应，对所有这些反应的介入都会对缺血的后果产生影响。随着我们对缺血损伤机制越来越多的了解，抗脑缺血的策略也有了更多的选择，这种严重威胁人类健康的顽疾，相信总有一天会被攻克。, 百拇医药