通心络胶囊对大脑中动脉梗塞模型大鼠兴奋性氨基酸及内皮素基因表达的影响 复旦大学医学院附属华山医院
通心络胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司生产)有较强的益气活血通络作用。我们在通心络治疗急性脑梗塞取得较好疗效的基础上，观察了通心络对大鼠大脑中动脉梗塞模型兴奋性氨基酸、内皮素及其基因表达的影响，旨在阐明通心络治疗急性脑血管病的确切疗效及其可能的作用机理。
材料和方法
1. 大鼠大脑中动脉梗塞模型研制
大鼠可逆性大脑中动脉梗塞MCAO模型的研制 雄性9周Wister大鼠30只，体重205±15 g，购自上海医科大学实验动物部。随机分为对照组、模型组、通心络组，每组10只。
通心络组以戊巴比妥钠50 mg/kg 腹腔内注射麻醉，右侧股动脉插管监测血压，红外线灯保持动物肛温38℃。颈正中切口，依次暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉远端及翼腭突动脉。在颈外动脉远心端分支处插入4-0聚丙烯手术缝线(线端预先加热成球形，直径0.3～0.35 mm)，缓慢向颈内动脉推进插线，当进线约17～20 mm时可感到明显的阻力，同时可见颈内动脉颅外段明显的屈曲、紧张，提示尼龙线已阻塞大脑中动脉，即刻腹腔注射通心络(15 g/kg)，用缝线在颈外动脉处结扎固定尼龙线并结扎切口。模型组以等体积生理盐水代替通心络，余同通心络组；对照组(假手术组)尼龙线只插到颅底没有阻塞大脑中动脉。MCAO后3 h观察动物神经功能缺损状况。大鼠MACO 3 h几乎所有动物都有程度不同的神经功能缺损。通心络组神经功能缺损评分明显低于对照组，P<0.05。提示通心络能有效改善大鼠MCAO 3 h的神经功能缺损。
, 百拇医药
2. 神经功能缺损评分
大鼠大脑中动脉梗塞3 h后进行神经功能缺损评分：大鼠无任何不对称活动为0分；提起尾巴时左前爪不能完全伸展为1分；在1分的基础上左前肢活动障碍为2分；左前肢紧贴胸壁为3分；大鼠自由活动时向左侧转弯为4分；4分伴有明显的左前爪后推动作为5分；只能围绕原点向左旋转为6分；左侧肢体完全不能支撑身体重量，只能躺向左侧为7分。
3. 兴奋性氨基酸检测
用高效液相色谱法(HPLC)测定兴奋性氨基酸含量。谷氨酸(Gku)和麦门冬氨酸(MNDA)标准品购自Sigma公司。实验动物断头取海马称重，加入10%磺基水杨酸钠冰浴，组织匀浆器4 000 rpm匀浆20 s，1 000 rpm离心10 min，取上清定容量为2 mk，移入Eppendorf管，-70℃保存待测。用磷苯二甲醛等柱前衍生。色谱条件：流动相A为甲醇：PBS等于37；流动相B为0.05 mok/L的NaAc-HAC缓冲液，流速为2 mk/min，柱温30℃检测波长为UV-360 nm，色谱柱为Aktex4.6 mm ID×25 cm。
, 百拇医药
4. 内皮素含量测定及其基因表达
内皮素放免检测药盒购自中国人民解放军总医院放射免疫研究所。实验大鼠断头取海马称重，煮沸10 min，加入1 mok/L预冷醋酸(W/V＝1.5)，组织匀浆器4 000 rpm匀浆20 s，4 000 rpm离心10 min4℃取上清-70℃保存待测。ET-1 mRNA表达采用半定量逆转录—多聚酶链式反应(sqRT-PCR)方法测定。根据ET-1的核酸序列，自行设计与合成PCR引物，上下游引物序列为：5’-CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG G-3’5’-AAG ATG CCA GCC ATG GAG AGC G-3’。经RT-PCR扩增出54-699 nt的ET-1 cDNA序列，长度为546 bp。取各组总mRNA 1.0 μg，按常规程序逆转录，42℃反应30 min，95℃加热5 min。再分别取5.0 μk逆转录产物进行PCR扩增、变性、退火及延伸，温度分别为94℃、50℃、72℃，时间为40 s、30 s、1 min，循环30个周期。对DNA扩增带进行图象分析，测出IOD值进行比较。
, 百拇医药
5. 统计方法
采用卡方检验及t检验。
结果
1. 通心络对MCAO大鼠神经功能缺损的影响
大鼠MCAO 3 h几乎所有动物都有程度不同的神经功能缺损。通心络组神经功能缺损评分明显低于模型组P<0.05。提示通心络能有效改善大鼠MCAO 3 h的神经功能缺损(表1)。
表1 通心络对MCAO大鼠神经功能缺损的影响(x±s)
组别
例数
神经功能缺损积分
, 百拇医药
模型组
10
5.23±0.90
通心络组
10
3.72±0.82*
注：*与模型组比较P<0.05
2. 通心络对MCAO大鼠模型中枢兴奋性氨基酸的影响
大鼠MCAO 3 h海马谷氨酸、麦门冬氨酸等兴奋性氨基酸含量明显升高，与对照组比较P<0.05；通心络组谷氨酸与麦门冬氨酸含量明显低于模型组P<0.05，如表2所示。
表2 通心络对MCAO大鼠海马兴奋性氨基酸的影响(mg/g.wt
, 百拇医药
x±s)
组别
n
GLU
MNDA
对照组
10
9.11±2.41
5.45±1.19
模型组
10
87.81±10.65*
46.41±8.74*
, 百拇医药
通心络组
10
47.21±9.05#
21.46±6.87#
注：*与对照组比较P<0.05；＃与模型组比较P<0.05。
3. 通心络对MCAO大鼠内皮素含量的影响
大鼠MCAO 3 h海马内皮素含量明显升高，与对照组比较P<0.05通心络组内皮素含量明显低于模型组(P<0.05)，如表3所示。
表3 通心络对MCAO大鼠海马内皮素含量的影响
组别
, 百拇医药
n
内皮素(pg/ml
x±s)
对照组
10
9.05±1.90
模型组
10
15.14±3.49*
通心络组
10
10.12±1.50#
注：*与对照组比较P<0.05；＃与模型组比较P<0.05。
, 百拇医药
4. 通心络对MCAO大鼠内皮素基因表达的影响
ET-1mRNA研究发现，各组均可见一条546 bp特异带，经图象分析检测表明，大鼠MCAO 3 h，中枢ET-1 mRNA表达明显增强；通心络能降低MCAO大鼠的中枢ET-1 mRNA表达。提示通心络能有效改善MCAO大鼠的缺血损伤。
讨论
中枢兴奋性氨基酸对急性缺血性脑卒中神经细胞的毒性作用越来越引起国内外学者的重视。谷氨酸与麦门冬氨酸是中枢主要的兴奋性氨基酸，谷氨酸在中枢含量最高分布最广作用最强。在发生脑缺血的数分钟至数小时内，中枢兴奋性氨基酸即大量增加。本研究表明大鼠MCAO 3 h，伴随着神经功能缺损，海马谷氨酸与麦门冬氨酸含量达87.81±10.65 mg/g和46.41±8.74 mg/g，与对照组比较P<0.05。祛风通络药腹腔注射可降低MCAO大鼠海马谷氨酸与麦门冬氨酸含量，降低神经功能缺损积分，与模型组比较P<0.05。
, 百拇医药
内皮素(endothekin，ET)是1988年日本学者Yanagisawa从培养的猪主动脉内皮细胞分离纯化的一种多肽，是目前已知的最强的血管收缩物质。ET由21个氨基酸组成，其分子量约为2.4 kD，分子内有两对由半胱氨酸残基构成的二硫键。人ET-1基因全长12464
bp，基因结构由5个外显子与4个内含子组成。大量研究表明，急性脑缺血时，循环及脑组织内ET的合成与释放增加，进而促进Ca++内流，使缺血区域神经细胞内Ca++超载，加重脑细胞的损害。本研究资料表明，大鼠MCAO 3 h海马ET-1含量及ET-1mRNA表达显著增加，与文献报道一致。祛风通络药腹腔注射可降低MCAO大鼠海马ET-1含量，与模型组比较P<0.05，抑制ET-1mRNA表达。
虽然汉唐至今许多医家一再强调祛风通络药治疗急性脑梗塞有效，但由于内风学说与瘀血学说的提出致使这种行之有效的方法没有得到足够的重视。通心络胶囊为石家庄以岭药业股份有限公司生产，由蜈蚣、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、人参、赤芍、冰片等组成，是国家新药基金资助项目，具有益气活血、通络解痉之功效。本研究结果表明通心络胶囊对大脑中动脉梗塞模型大鼠神经功能缺损有改善作用这可能与降低中枢兴奋性氨基酸含量、降低内皮素含量及抑制内皮素基因表达有关。为活血通络药治疗缺血性脑卒中提供了现代科学依据。, http://www.100md.com(蔡定芳阮晴珉)
材料和方法
1. 大鼠大脑中动脉梗塞模型研制
大鼠可逆性大脑中动脉梗塞MCAO模型的研制 雄性9周Wister大鼠30只，体重205±15 g，购自上海医科大学实验动物部。随机分为对照组、模型组、通心络组，每组10只。
通心络组以戊巴比妥钠50 mg/kg 腹腔内注射麻醉，右侧股动脉插管监测血压，红外线灯保持动物肛温38℃。颈正中切口，依次暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉远端及翼腭突动脉。在颈外动脉远心端分支处插入4-0聚丙烯手术缝线(线端预先加热成球形，直径0.3～0.35 mm)，缓慢向颈内动脉推进插线，当进线约17～20 mm时可感到明显的阻力，同时可见颈内动脉颅外段明显的屈曲、紧张，提示尼龙线已阻塞大脑中动脉，即刻腹腔注射通心络(15 g/kg)，用缝线在颈外动脉处结扎固定尼龙线并结扎切口。模型组以等体积生理盐水代替通心络，余同通心络组；对照组(假手术组)尼龙线只插到颅底没有阻塞大脑中动脉。MCAO后3 h观察动物神经功能缺损状况。大鼠MACO 3 h几乎所有动物都有程度不同的神经功能缺损。通心络组神经功能缺损评分明显低于对照组，P<0.05。提示通心络能有效改善大鼠MCAO 3 h的神经功能缺损。
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2. 神经功能缺损评分
大鼠大脑中动脉梗塞3 h后进行神经功能缺损评分：大鼠无任何不对称活动为0分；提起尾巴时左前爪不能完全伸展为1分；在1分的基础上左前肢活动障碍为2分；左前肢紧贴胸壁为3分；大鼠自由活动时向左侧转弯为4分；4分伴有明显的左前爪后推动作为5分；只能围绕原点向左旋转为6分；左侧肢体完全不能支撑身体重量，只能躺向左侧为7分。
3. 兴奋性氨基酸检测
用高效液相色谱法(HPLC)测定兴奋性氨基酸含量。谷氨酸(Gku)和麦门冬氨酸(MNDA)标准品购自Sigma公司。实验动物断头取海马称重，加入10%磺基水杨酸钠冰浴，组织匀浆器4 000 rpm匀浆20 s，1 000 rpm离心10 min，取上清定容量为2 mk，移入Eppendorf管，-70℃保存待测。用磷苯二甲醛等柱前衍生。色谱条件：流动相A为甲醇：PBS等于37；流动相B为0.05 mok/L的NaAc-HAC缓冲液，流速为2 mk/min，柱温30℃检测波长为UV-360 nm，色谱柱为Aktex4.6 mm ID×25 cm。
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4. 内皮素含量测定及其基因表达
内皮素放免检测药盒购自中国人民解放军总医院放射免疫研究所。实验大鼠断头取海马称重，煮沸10 min，加入1 mok/L预冷醋酸(W/V＝1.5)，组织匀浆器4 000 rpm匀浆20 s，4 000 rpm离心10 min4℃取上清-70℃保存待测。ET-1 mRNA表达采用半定量逆转录—多聚酶链式反应(sqRT-PCR)方法测定。根据ET-1的核酸序列，自行设计与合成PCR引物，上下游引物序列为：5’-CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG G-3’5’-AAG ATG CCA GCC ATG GAG AGC G-3’。经RT-PCR扩增出54-699 nt的ET-1 cDNA序列，长度为546 bp。取各组总mRNA 1.0 μg，按常规程序逆转录，42℃反应30 min，95℃加热5 min。再分别取5.0 μk逆转录产物进行PCR扩增、变性、退火及延伸，温度分别为94℃、50℃、72℃，时间为40 s、30 s、1 min，循环30个周期。对DNA扩增带进行图象分析，测出IOD值进行比较。
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5. 统计方法
采用卡方检验及t检验。
结果
1. 通心络对MCAO大鼠神经功能缺损的影响
大鼠MCAO 3 h几乎所有动物都有程度不同的神经功能缺损。通心络组神经功能缺损评分明显低于模型组P<0.05。提示通心络能有效改善大鼠MCAO 3 h的神经功能缺损(表1)。
表1 通心络对MCAO大鼠神经功能缺损的影响(x±s)
组别
例数
神经功能缺损积分
, 百拇医药
模型组
10
5.23±0.90
通心络组
10
3.72±0.82*
注：*与模型组比较P<0.05
2. 通心络对MCAO大鼠模型中枢兴奋性氨基酸的影响
大鼠MCAO 3 h海马谷氨酸、麦门冬氨酸等兴奋性氨基酸含量明显升高，与对照组比较P<0.05；通心络组谷氨酸与麦门冬氨酸含量明显低于模型组P<0.05，如表2所示。
表2 通心络对MCAO大鼠海马兴奋性氨基酸的影响(mg/g.wt
, 百拇医药
x±s)
组别
n
GLU
MNDA
对照组
10
9.11±2.41
5.45±1.19
模型组
10
87.81±10.65*
46.41±8.74*
, 百拇医药
通心络组
10
47.21±9.05#
21.46±6.87#
注：*与对照组比较P<0.05；＃与模型组比较P<0.05。
3. 通心络对MCAO大鼠内皮素含量的影响
大鼠MCAO 3 h海马内皮素含量明显升高，与对照组比较P<0.05通心络组内皮素含量明显低于模型组(P<0.05)，如表3所示。
表3 通心络对MCAO大鼠海马内皮素含量的影响
组别
, 百拇医药
n
内皮素(pg/ml
x±s)
对照组
10
9.05±1.90
模型组
10
15.14±3.49*
通心络组
10
10.12±1.50#
注：*与对照组比较P<0.05；＃与模型组比较P<0.05。
, 百拇医药
4. 通心络对MCAO大鼠内皮素基因表达的影响
ET-1mRNA研究发现，各组均可见一条546 bp特异带，经图象分析检测表明，大鼠MCAO 3 h，中枢ET-1 mRNA表达明显增强；通心络能降低MCAO大鼠的中枢ET-1 mRNA表达。提示通心络能有效改善MCAO大鼠的缺血损伤。
讨论
中枢兴奋性氨基酸对急性缺血性脑卒中神经细胞的毒性作用越来越引起国内外学者的重视。谷氨酸与麦门冬氨酸是中枢主要的兴奋性氨基酸，谷氨酸在中枢含量最高分布最广作用最强。在发生脑缺血的数分钟至数小时内，中枢兴奋性氨基酸即大量增加。本研究表明大鼠MCAO 3 h，伴随着神经功能缺损，海马谷氨酸与麦门冬氨酸含量达87.81±10.65 mg/g和46.41±8.74 mg/g，与对照组比较P<0.05。祛风通络药腹腔注射可降低MCAO大鼠海马谷氨酸与麦门冬氨酸含量，降低神经功能缺损积分，与模型组比较P<0.05。
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内皮素(endothekin，ET)是1988年日本学者Yanagisawa从培养的猪主动脉内皮细胞分离纯化的一种多肽，是目前已知的最强的血管收缩物质。ET由21个氨基酸组成，其分子量约为2.4 kD，分子内有两对由半胱氨酸残基构成的二硫键。人ET-1基因全长12464
bp，基因结构由5个外显子与4个内含子组成。大量研究表明，急性脑缺血时，循环及脑组织内ET的合成与释放增加，进而促进Ca++内流，使缺血区域神经细胞内Ca++超载，加重脑细胞的损害。本研究资料表明，大鼠MCAO 3 h海马ET-1含量及ET-1mRNA表达显著增加，与文献报道一致。祛风通络药腹腔注射可降低MCAO大鼠海马ET-1含量，与模型组比较P<0.05，抑制ET-1mRNA表达。
虽然汉唐至今许多医家一再强调祛风通络药治疗急性脑梗塞有效，但由于内风学说与瘀血学说的提出致使这种行之有效的方法没有得到足够的重视。通心络胶囊为石家庄以岭药业股份有限公司生产，由蜈蚣、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、人参、赤芍、冰片等组成，是国家新药基金资助项目，具有益气活血、通络解痉之功效。本研究结果表明通心络胶囊对大脑中动脉梗塞模型大鼠神经功能缺损有改善作用这可能与降低中枢兴奋性氨基酸含量、降低内皮素含量及抑制内皮素基因表达有关。为活血通络药治疗缺血性脑卒中提供了现代科学依据。, http://www.100md.com(蔡定芳阮晴珉)