特应性皮炎的化学介质：I型过敏反应释放的Ltb4参与特应性皮炎发病
特应性皮炎是一种慢性炎症性皮肤病，通常发生在有个人或家族特应病史的病人中。尽管特应性皮炎的发病机制还不清楚，但很多发现提示：IgE介导的过敏反应在其发病中起作用，80%的患者血清IgE水平升高。
I型过敏反应有时伴随迟发相反应(LPR)。组织学上，迟发相反应以组织浸润为特征，主要是中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，也有单核细胞。这种组织学特征表明迟发相反应中有趋化因素参与。在众多趋化性化合物中，白细胞三烯B4(LTB4)是强有力的白细胞趋化因子。尽管LTB4在皮肤过敏反应中的细胞来源还未确定，但实验表明：皮内注射LTB4可引起一过性红斑和持久的组织学中性粒细胞浸润变化。这些变化表明LTB4可能在迟发相反应发生中起作用。
本实验研究了I型过敏反应中介质的释放，尤其是LTB4的释放，以解释迟发相反应的炎症细胞浸润机制。同时研究了抗原刺激产生的LTB4在特应性皮炎发病中的作用。
方法
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一.皮肤介质释放的体内试验(皮窗试验技术)
入选皮窗试验者为皮内注射屋尘螨抗原速发相和迟发相呈阳性皮肤反应的病人。皮肤窗试验操作如下：选患者背部两块未受累皮肤，用手术刀片边缘刮去表面鳞屑和表皮上层，露出没有出血的闪光表面。制备一个漏斗形状的硅烷化的玻璃小室，内径12 mm，与一个短硅管相接。皮肤刮过后用Tyrode溶液冲洗两次，以去除渗出物。将小室用氰基丙烯酸盐胶布粘在处理过的皮肤处。每个舱充满0.7 mk Tyrode溶液，并用钳子封上，避免与空气接触，孵育10分钟，收集液体以获取每个部位激发前标本。其中一个刮过的部位用0.7 mk 含150 AU/mk 屋尘螨抗原的溶液激发，即皮肤反应研究所用同一种溶液。在随后的3个小时每小时收集舱内液体一次，并用重新用Tyrode溶液充满舱内。另一个刮过部位在同一时间只用Tyrode溶液孵育作为对照。舱内液体按上述方法提取后保存于-70 ℃，以备测组胺和LTB4。
二. LTB4放射免疫测定
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体外研究反应混合物和体内研究皮窗液体里的LTB4的量用氚化LTB4测试系统(英国)测量。组胺用反相高压液相提取并测量。上清液中组胺释放按皮肤中总组胺含量的百分比来表达。
结果
一. 皮肤反应
54例特应性皮炎患者，皮内注射4种环境过敏原和3种食物过敏原。用Norman 标准评价速发相皮肤反应。由于没有可用的标准评价迟发相皮肤反应，我们采用自定的标准：将注射后4、6或8小时任一点红斑和水肿直径变化超过5 mm者判为阳性反应。结果发现环境过敏原的速发相反应和迟发相反应阳性率高于食物过敏原。在迟发相反应所有部位，可以连续地观察到从注射即刻出现的风团到迟发相的红斑水肿反应。
特应性皮炎患者中有72.2%的人对屋尘螨过敏原发生迟发相反应。为比较特应性皮炎患者与健康对照者的迟发相反应发生率，我们对40例没有任何特应性疾病的健康对照者进行了屋尘螨抗原皮肤试验。40例中有18例速发相反应阳性，只有1例迟发相反应阳性。
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尽管速发相风团红斑反应与迟发相反应标准不同，两相的结果特征相似。结果显示很多特应性皮炎患者对一些环境过敏原敏感，先发生速发相反应，后又发生迟发相反应。
二. 体外实验介质释放
在6个实验中，均可见体外皮肤标本有大量的非特异性交叉反应抗原(NCA)和LTB4释放，在抗原刺激后的前20分钟还有组胺释放。这个结果表明I型过敏反应不仅释放组胺，还有NCA
和LTB4释放。
三. 高压液相研究
在一个代表性的实验中，用高压液相分馏体外反应混合物之上清。每一片断的NCA见图1。在过敏原刺激标本的所有部分NCA有2个峰。
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图1 高压液相色谱中每部分的中性粒细胞趋化性。趋化指数＝中性粒细胞浸润数目/相应缓冲液中中性粒细胞浸润数目
图2 高压液相色谱中每部分的LTB4(pg/部分)
主峰出现在第10和11片断。
用放射免疫测定(RIA)方法检测每一片断的LTB4。结果在NCA主峰的相同片断均检测到LTB4
(图2)。
四. 体内介质释放
在过敏原激发后1小时内，可见过敏原刺激组胺的释放(13.4±5.1 ng/部位；n＝8)。释放量比对照部位(0.7±0.3 ng/部位；P<0.02)明显升高。4小时激发部位皮窗中组胺平均水平超过每小时10 ng/部位，而对照部位平均水平不到3
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ng/部位。激发部位皮窗中前列腺素D2(PGD2)平均水平从第1到第4小时也比对照部位高，尽管仅第4小时的差异具有统计学意义。为检测体内试验抗原激发后LTB4释放，我们检测了过敏原激发后皮窗中LTB4的量。结果在激发后1小时内可见过敏原激发LTB4的释放(282.5±121.2 ng/部位；n＝6)明显高于对照部位(53.8±11.0
ng/部位，P<0.05)。在过敏原激发后3小时和4小时激发部位LTB4释放也比对照部位显著增高。
方法
上述研究证明了体内人皮肤I型过敏反应中LTB4的释放。这一现象以往未见报道。同时证明特应性皮炎患者非病变皮肤用过敏原刺激后，不仅释放组胺，还释放LTB4。
Atkin 等证明了NCA可在IgG或 IgE致敏的豚鼠肺碎片的过敏反应中以抗原特异性方式出现。他们鉴定了NCA
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的LTB4类似功能，在人类LTB4是体内鼻黏膜速发相和迟发相反应中释放的介质，纯化的体外人肺肥大细胞也有LTB4释放。Robinson
等用体外实验证明IgE介导的纯化人皮肤肥大细胞释放PGD2和白细胞三烯C4(LTC4)，但未提及LTB4释放。本项研究用体外试验显示了人皮肤抗原诱导NCA释放并用高压液相色谱分析法证实为LTB4。我们在体外实验中成功地用反应血清致敏皮肤标本，结果发现有NCA和
LTB4释放。然而LTB4的细胞来源还不能确定。体外研究中肥大细胞可能是抗原激发后LTB4的一个来源，因为试验系统未见有炎症细胞浸润。巨噬细胞可能也是LTB4的来源。Jacobsson等证明外周静脉血的活化单核细胞释放白细胞三烯A4(LTA4)，LTA4可被单克隆淋巴细胞转化为LTB4。Freekand等推测LTB4的大量自发性释放可能不是来自肥大细胞，而是来自巨噬细胞，后者已显示是有效的LTB4来源。然而，他们还推测肥大细胞可以对IgE介导的刺激发生反应，产生LTB4因为肺碎片抗IgE激活可以导致LTB4水平增加。尽管对人肥大细胞能否产生LTB4现在仍有争论，鼠的肥大细胞可以产生LTB4已经明确。
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除肥大细胞和巨噬细胞外，中性粒细胞也可能是LTB4的来源。然而，体外研究中健康人皮肤标本只含有很少量中性粒细胞。因此认为，只有肥大细胞和巨噬细胞是LTB4的可能来源，尤其在迟发相反应的炎症早期阶段。
我们假设I型过敏反应中释放的LTB4可能在特应性皮炎皮损部位引起持久性炎症反应和白细胞浸润。尽管特应性皮炎是典型的皮肤过敏反应，相当一部分学者不愿意接受这样一个概念，即IgE介导的机制在特应性皮炎发病中起作用，因为特应性皮炎患者的皮损更像IV型迟发型超敏反应，而不像I型速发型超敏反应。
我们已经证明特应性皮炎患者皮内注射常见环境过敏原后常有迟发相反应发生。而且，发生率与以往报道的豚草过敏的患者一样高。
自从Dokovich等第一次描述IgE介导的超敏反应的皮肤迟发相反应以来，人们就一直用迟发相反应来解释I型过敏反应中的细胞浸润。然而，很少有人研究迟发相反应在特应性皮炎发病中的作用。Mitchekk等曾证明产生湿疹的机制包括抗原与特异性IgE慢性相互作用。他们表明如果过敏原持续作用于磨损的皮肤，48小时在斑贴部位可以激发出湿疹，这种情况只发生于对特异性过敏原有速发型针刺反应的病人。他们因此得出结论：抗原与皮肤特异性IgE慢性相互作用可以产生湿疹反应，可能是因为激发了迟发相反应。Ring和Dorsk提出过敏原刺激后肥大细胞或嗜碱细胞释放的血管活性物质(如组胺、二十烷或血小板活性因子)可产生瘙痒、接触性荨麻疹，或者迟发相反应，与搔抓一起反应产生湿疹样皮肤改变。
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Mihm等描述特应性皮炎的急性水疱皮损的组织学特征为：以淋巴细胞和单核/巨噬细胞为主，偶见中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞浸润。本项研究结果表明：迟发相反应在特应性皮炎发病中的作用主要由细胞反应引起，我们也观察了炎症部位的组织学变化。在慢性皮损，临床表现为丘疹和苔藓化，组织学为表皮增厚、单核细胞浸润。急性和亚急性皮损，临床为红斑、丘疱疹和水肿，组织学为粒细胞和单核细胞浸润。
一些学者报道人皮肤迟发相反应的组织学变化为过敏原注射后6～8小时血管周围淋巴细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞浸润。组织学研究显示了皮肤迟发相反应和特应性皮炎炎症皮损组织学特征的相似性，尤其是粒细胞浸润，伴随有单核细胞。组织学发现提示一些白细胞化学趋化因子可能通过迟发相反应的方式在特应性皮炎中产生炎症反应中起重要作用。另外，在人皮肤注射LTB4(1.6
nmok/部位)6小时后可有中性粒细胞浸润。尽管这些组织学特征在特应性皮炎并不完全特异，从特应性皮炎患者皮损部抽吸的疱液和皮损部位活检标本中均可测到高水平具有生物活性的LTB4和LTB4样的免疫反应。这些发现表明LTB4在特应性皮炎炎症变化中起重要作用。
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Reshef等用皮窗试验证明了皮肤迟发相反应中产生二十烷类(PGD2和LTC4)和组胺，但未提及LTB4的产生，我们以往的皮窗试验证明了特异性抗原刺激引起的速发相反应的组胺和PGD2释放。
在体内研究中，抗原特异性组胺和PGD2释放从第一到四小时都可见到，抗原特异性LTB4释放从第一到四小时也可见到。在我们的结果中抗原诱导LTB4的释放量为283 pg/部位(约400 pg/mk)，意味着皮窗液体中含有10～9 mok/L
LTB4。这个LTB4浓度足以激发组织中粒细胞化学趋化活动。
Shakit等证明了过敏性鼻炎患者皮窗中抗原刺激的LTB4释放。他们描述了LTB4与组胺不同的释放模式，强调LTB4释放发生在延迟阶段(抗原刺激后3～9小时)。在我们的皮窗试验中，LTB4释放高峰在抗原刺激后1小时，与组胺和PGD2在一起，提示肥大细胞可在抗原刺激的速发相释放二十烷类。
粒细胞曾被认为是迟发相反应的主要反应细胞。然而，近来有研究证实T细胞也在鼠和人皮肤迟发相反应发生中起重要作用。最近还有报道一些其他化合物可能也在迟发相反应中起作用。有报道特应性个体皮肤迟发相反应中有白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6( IL-6)、 粒细胞-巨噬细胞刺激因子GM-CSF、白细胞介素-8(IL-8)、 RANTES和巨细胞趋化性和激活性因子(MCP-1)参与。皮内注射有组胺释放活性的MIP-1α和MCP-1可以发生速发和迟发相反应，有中性粒细胞和单核细胞浸润和肥大细胞脱颗粒。尽管上述细胞因子有白细胞趋化活性，可能在迟发相反应中起作用，LTB4释放的时间过程与这些细胞因子不同。在迟发相反应的早期阶段，LTB4主要作为化学趋化因子以延长炎症反应。参考文献(略), http://www.100md.com
I型过敏反应有时伴随迟发相反应(LPR)。组织学上，迟发相反应以组织浸润为特征，主要是中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，也有单核细胞。这种组织学特征表明迟发相反应中有趋化因素参与。在众多趋化性化合物中，白细胞三烯B4(LTB4)是强有力的白细胞趋化因子。尽管LTB4在皮肤过敏反应中的细胞来源还未确定，但实验表明：皮内注射LTB4可引起一过性红斑和持久的组织学中性粒细胞浸润变化。这些变化表明LTB4可能在迟发相反应发生中起作用。
本实验研究了I型过敏反应中介质的释放，尤其是LTB4的释放，以解释迟发相反应的炎症细胞浸润机制。同时研究了抗原刺激产生的LTB4在特应性皮炎发病中的作用。
方法
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一.皮肤介质释放的体内试验(皮窗试验技术)
入选皮窗试验者为皮内注射屋尘螨抗原速发相和迟发相呈阳性皮肤反应的病人。皮肤窗试验操作如下：选患者背部两块未受累皮肤，用手术刀片边缘刮去表面鳞屑和表皮上层，露出没有出血的闪光表面。制备一个漏斗形状的硅烷化的玻璃小室，内径12 mm，与一个短硅管相接。皮肤刮过后用Tyrode溶液冲洗两次，以去除渗出物。将小室用氰基丙烯酸盐胶布粘在处理过的皮肤处。每个舱充满0.7 mk Tyrode溶液，并用钳子封上，避免与空气接触，孵育10分钟，收集液体以获取每个部位激发前标本。其中一个刮过的部位用0.7 mk 含150 AU/mk 屋尘螨抗原的溶液激发，即皮肤反应研究所用同一种溶液。在随后的3个小时每小时收集舱内液体一次，并用重新用Tyrode溶液充满舱内。另一个刮过部位在同一时间只用Tyrode溶液孵育作为对照。舱内液体按上述方法提取后保存于-70 ℃，以备测组胺和LTB4。
二. LTB4放射免疫测定
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体外研究反应混合物和体内研究皮窗液体里的LTB4的量用氚化LTB4测试系统(英国)测量。组胺用反相高压液相提取并测量。上清液中组胺释放按皮肤中总组胺含量的百分比来表达。
结果
一. 皮肤反应
54例特应性皮炎患者，皮内注射4种环境过敏原和3种食物过敏原。用Norman 标准评价速发相皮肤反应。由于没有可用的标准评价迟发相皮肤反应，我们采用自定的标准：将注射后4、6或8小时任一点红斑和水肿直径变化超过5 mm者判为阳性反应。结果发现环境过敏原的速发相反应和迟发相反应阳性率高于食物过敏原。在迟发相反应所有部位，可以连续地观察到从注射即刻出现的风团到迟发相的红斑水肿反应。
特应性皮炎患者中有72.2%的人对屋尘螨过敏原发生迟发相反应。为比较特应性皮炎患者与健康对照者的迟发相反应发生率，我们对40例没有任何特应性疾病的健康对照者进行了屋尘螨抗原皮肤试验。40例中有18例速发相反应阳性，只有1例迟发相反应阳性。
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尽管速发相风团红斑反应与迟发相反应标准不同，两相的结果特征相似。结果显示很多特应性皮炎患者对一些环境过敏原敏感，先发生速发相反应，后又发生迟发相反应。
二. 体外实验介质释放
在6个实验中，均可见体外皮肤标本有大量的非特异性交叉反应抗原(NCA)和LTB4释放，在抗原刺激后的前20分钟还有组胺释放。这个结果表明I型过敏反应不仅释放组胺，还有NCA
和LTB4释放。
三. 高压液相研究
在一个代表性的实验中，用高压液相分馏体外反应混合物之上清。每一片断的NCA见图1。在过敏原刺激标本的所有部分NCA有2个峰。
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图1 高压液相色谱中每部分的中性粒细胞趋化性。趋化指数＝中性粒细胞浸润数目/相应缓冲液中中性粒细胞浸润数目
图2 高压液相色谱中每部分的LTB4(pg/部分)
主峰出现在第10和11片断。
用放射免疫测定(RIA)方法检测每一片断的LTB4。结果在NCA主峰的相同片断均检测到LTB4
(图2)。
四. 体内介质释放
在过敏原激发后1小时内，可见过敏原刺激组胺的释放(13.4±5.1 ng/部位；n＝8)。释放量比对照部位(0.7±0.3 ng/部位；P<0.02)明显升高。4小时激发部位皮窗中组胺平均水平超过每小时10 ng/部位，而对照部位平均水平不到3
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ng/部位。激发部位皮窗中前列腺素D2(PGD2)平均水平从第1到第4小时也比对照部位高，尽管仅第4小时的差异具有统计学意义。为检测体内试验抗原激发后LTB4释放，我们检测了过敏原激发后皮窗中LTB4的量。结果在激发后1小时内可见过敏原激发LTB4的释放(282.5±121.2 ng/部位；n＝6)明显高于对照部位(53.8±11.0
ng/部位，P<0.05)。在过敏原激发后3小时和4小时激发部位LTB4释放也比对照部位显著增高。
方法
上述研究证明了体内人皮肤I型过敏反应中LTB4的释放。这一现象以往未见报道。同时证明特应性皮炎患者非病变皮肤用过敏原刺激后，不仅释放组胺，还释放LTB4。
Atkin 等证明了NCA可在IgG或 IgE致敏的豚鼠肺碎片的过敏反应中以抗原特异性方式出现。他们鉴定了NCA
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的LTB4类似功能，在人类LTB4是体内鼻黏膜速发相和迟发相反应中释放的介质，纯化的体外人肺肥大细胞也有LTB4释放。Robinson
等用体外实验证明IgE介导的纯化人皮肤肥大细胞释放PGD2和白细胞三烯C4(LTC4)，但未提及LTB4释放。本项研究用体外试验显示了人皮肤抗原诱导NCA释放并用高压液相色谱分析法证实为LTB4。我们在体外实验中成功地用反应血清致敏皮肤标本，结果发现有NCA和
LTB4释放。然而LTB4的细胞来源还不能确定。体外研究中肥大细胞可能是抗原激发后LTB4的一个来源，因为试验系统未见有炎症细胞浸润。巨噬细胞可能也是LTB4的来源。Jacobsson等证明外周静脉血的活化单核细胞释放白细胞三烯A4(LTA4)，LTA4可被单克隆淋巴细胞转化为LTB4。Freekand等推测LTB4的大量自发性释放可能不是来自肥大细胞，而是来自巨噬细胞，后者已显示是有效的LTB4来源。然而，他们还推测肥大细胞可以对IgE介导的刺激发生反应，产生LTB4因为肺碎片抗IgE激活可以导致LTB4水平增加。尽管对人肥大细胞能否产生LTB4现在仍有争论，鼠的肥大细胞可以产生LTB4已经明确。
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除肥大细胞和巨噬细胞外，中性粒细胞也可能是LTB4的来源。然而，体外研究中健康人皮肤标本只含有很少量中性粒细胞。因此认为，只有肥大细胞和巨噬细胞是LTB4的可能来源，尤其在迟发相反应的炎症早期阶段。
我们假设I型过敏反应中释放的LTB4可能在特应性皮炎皮损部位引起持久性炎症反应和白细胞浸润。尽管特应性皮炎是典型的皮肤过敏反应，相当一部分学者不愿意接受这样一个概念，即IgE介导的机制在特应性皮炎发病中起作用，因为特应性皮炎患者的皮损更像IV型迟发型超敏反应，而不像I型速发型超敏反应。
我们已经证明特应性皮炎患者皮内注射常见环境过敏原后常有迟发相反应发生。而且，发生率与以往报道的豚草过敏的患者一样高。
自从Dokovich等第一次描述IgE介导的超敏反应的皮肤迟发相反应以来，人们就一直用迟发相反应来解释I型过敏反应中的细胞浸润。然而，很少有人研究迟发相反应在特应性皮炎发病中的作用。Mitchekk等曾证明产生湿疹的机制包括抗原与特异性IgE慢性相互作用。他们表明如果过敏原持续作用于磨损的皮肤，48小时在斑贴部位可以激发出湿疹，这种情况只发生于对特异性过敏原有速发型针刺反应的病人。他们因此得出结论：抗原与皮肤特异性IgE慢性相互作用可以产生湿疹反应，可能是因为激发了迟发相反应。Ring和Dorsk提出过敏原刺激后肥大细胞或嗜碱细胞释放的血管活性物质(如组胺、二十烷或血小板活性因子)可产生瘙痒、接触性荨麻疹，或者迟发相反应，与搔抓一起反应产生湿疹样皮肤改变。
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Mihm等描述特应性皮炎的急性水疱皮损的组织学特征为：以淋巴细胞和单核/巨噬细胞为主，偶见中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞浸润。本项研究结果表明：迟发相反应在特应性皮炎发病中的作用主要由细胞反应引起，我们也观察了炎症部位的组织学变化。在慢性皮损，临床表现为丘疹和苔藓化，组织学为表皮增厚、单核细胞浸润。急性和亚急性皮损，临床为红斑、丘疱疹和水肿，组织学为粒细胞和单核细胞浸润。
一些学者报道人皮肤迟发相反应的组织学变化为过敏原注射后6～8小时血管周围淋巴细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞浸润。组织学研究显示了皮肤迟发相反应和特应性皮炎炎症皮损组织学特征的相似性，尤其是粒细胞浸润，伴随有单核细胞。组织学发现提示一些白细胞化学趋化因子可能通过迟发相反应的方式在特应性皮炎中产生炎症反应中起重要作用。另外，在人皮肤注射LTB4(1.6
nmok/部位)6小时后可有中性粒细胞浸润。尽管这些组织学特征在特应性皮炎并不完全特异，从特应性皮炎患者皮损部抽吸的疱液和皮损部位活检标本中均可测到高水平具有生物活性的LTB4和LTB4样的免疫反应。这些发现表明LTB4在特应性皮炎炎症变化中起重要作用。
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Reshef等用皮窗试验证明了皮肤迟发相反应中产生二十烷类(PGD2和LTC4)和组胺，但未提及LTB4的产生，我们以往的皮窗试验证明了特异性抗原刺激引起的速发相反应的组胺和PGD2释放。
在体内研究中，抗原特异性组胺和PGD2释放从第一到四小时都可见到，抗原特异性LTB4释放从第一到四小时也可见到。在我们的结果中抗原诱导LTB4的释放量为283 pg/部位(约400 pg/mk)，意味着皮窗液体中含有10～9 mok/L
LTB4。这个LTB4浓度足以激发组织中粒细胞化学趋化活动。
Shakit等证明了过敏性鼻炎患者皮窗中抗原刺激的LTB4释放。他们描述了LTB4与组胺不同的释放模式，强调LTB4释放发生在延迟阶段(抗原刺激后3～9小时)。在我们的皮窗试验中，LTB4释放高峰在抗原刺激后1小时，与组胺和PGD2在一起，提示肥大细胞可在抗原刺激的速发相释放二十烷类。
粒细胞曾被认为是迟发相反应的主要反应细胞。然而，近来有研究证实T细胞也在鼠和人皮肤迟发相反应发生中起重要作用。最近还有报道一些其他化合物可能也在迟发相反应中起作用。有报道特应性个体皮肤迟发相反应中有白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6( IL-6)、 粒细胞-巨噬细胞刺激因子GM-CSF、白细胞介素-8(IL-8)、 RANTES和巨细胞趋化性和激活性因子(MCP-1)参与。皮内注射有组胺释放活性的MIP-1α和MCP-1可以发生速发和迟发相反应，有中性粒细胞和单核细胞浸润和肥大细胞脱颗粒。尽管上述细胞因子有白细胞趋化活性，可能在迟发相反应中起作用，LTB4释放的时间过程与这些细胞因子不同。在迟发相反应的早期阶段，LTB4主要作为化学趋化因子以延长炎症反应。参考文献(略), http://www.100md.com