电泳法
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| 标题 | 电泳法 |
| 附录序号 | 附录Ⅴ |
| 内容全文 | F. 电泳法 电泳法，是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。 各电泳法，除另有规定外，照下述方法操作。 一、纸电泳法 1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图，包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B；两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两部分；外格装有铂电极(直径0.5～0.8cm)D；里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F，此架可从槽中取出；两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。 电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般在500～10 000V。 2. 操作法 (1) 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液(pH3.0) 取枸橼酸 (C6H8O7·H2O)39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。 (2) 滤纸 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端5～8cm处划一起始线，每隔2.5～3cm处做一记号备点样用。 (3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10μl,共3点，并留2个空白位置。 干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。 (4) 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为18～20V/cm，电泳约1小时45分钟，取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。 (5) 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。 二、醋酸纤维素薄膜电泳法 1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。 2.试剂 (1) 巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。 (2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。 (3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。 (4) 透明液 取冰醋酸25ml，加无水乙醇75ml，混匀。 3.操作法 (1) 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。 (2) 点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2～3μl,在10～12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4～5cm为宜。 (3) 染色 电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。 (4) 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10～15分钟，取出平铺于洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长期保存。 (5) 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。 洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全， 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占百分率。 扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 (未透明薄膜) 或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸收度，计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。 三、琼脂糖凝胶电泳法 1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。 2.试剂 (1) 醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。 (2) 甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。 3.操作法 (1)制胶 取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。 (2) 标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下规定配制。 (3) 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm，电流强度1～2mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。 (4) 染色与脱色 取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 1.仪器装置 通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。 2.试剂 (1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。 (4)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解，加20%乙醇制成250ml。 (5)染色液 取0.25%(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (6)稀染色液 取上述染色液2ml，加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (7)脱色液 7%醋酸溶液。 3.操作法 (1)制胶 取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡， 加0.56%过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。 (2)标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。 (3)电泳 将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1～2滴及0.04%溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。 (4)染色和脱色 电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10～30分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。 (5)结果判断 将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。 相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R'<[m]>)进行比较。其计算式如下： 进胶端到供试品或标准品区带的距离 相对迁移率(R'<[m]>)＝───────────────── 进胶端到溴酚蓝区带的距离 扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分，由各组分的峰面积计算百分含量。 五、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R'<[m]>)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。 1.仪器装置 除另有规定外，同聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2.试剂 (1)丙烯酰胺液溶 称取丙烯酰胺22.2g与双丙烯酰胺0.6g， 溶于100ml水中，贮于褐色瓶中低温保存。 (2) 凝胶缓冲液 称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、磷酸氢二钠(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g与十二烷基硫酸钠2.0g，加水至1000ml(若有沉淀析出,可加温至37℃溶解)。 (3)电泳缓冲液 将凝胶缓冲液稀释1倍。 (4)染色液 称取25mg考马斯亮蓝R<[250]>,溶于57%乙醇与9.2%醋酸混合液100ml中。 (5)脱色液 取无水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀释至1000ml。 3.操作法 除下列规定外，其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (1)制胶 用丙烯酰胺溶液-凝胶缓冲液-水-1.6%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺(需冷却)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。 (2)标准蛋白溶液及供试品溶液的制备 取标准蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制。 (3)电泳 调节电流使每管为8mA。 4.相对迁移率和分子量计算 将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移率：
蛋白移动的距离 染色前的胶条长度
相对迁移率(R'<[m]>)＝──────────×──────────
脱色后的胶条长度 染料移动的前沿距离以R'<[m]>为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出供试品分子量。 |