L-门冬酰胺酶
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| 药品名称 | L-门冬酰胺酶 |
| 拼音名 | L-Mendongxian'anmei |
| 英文名 | L-Asparaginase |
| 类别 | 原料药 |
| 来源(分子式)/处方与标准 | 本品系自埃希氏大肠杆菌(E.coli ASI.357)中提取制备的具有分解L-门冬酰胺作用
的酶。 每毫克蛋白含L-门冬酰胺酶效价不得低于250单位。 |
| 全文 | 【性状】 本品为白色结晶状粉末；无嗅，无味。 本品在水中易溶，在乙醇和醚中不溶。 【鉴别】 (1)取本品5mg，加水1ml溶解，加20%氢氧化钠溶液5ml，摇匀,再加1%硫酸铜溶液1滴，摇匀，溶液呈蓝紫色。 (2)取效价测定项下供试品溶液0.1ml，加0.33%门冬酰胺溶液1.9ml,置37℃水浴反应15分钟，取出，加茚三酮约3mg，加热，显蓝紫色。 【检查】 酸碱度 取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典1995年版二部附录Ⅵ H)，pH值应为6.5～7.5。 溶液的澄清度与颜色 取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含5mg的溶液，应澄清无色。 纯度 取本品适量，加供试品缓冲液制成每1ml中约含200单位的溶液，临用前置水浴中放置5分钟，冷却，作为供试品溶液，照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(见附)试验,点样10μl，将电泳后的凝胶板在参比波长700nm、测定波长580nm处，置薄层色谱仪扫描,按面积归一化法计算主峰相对百分含量，应不得低于90%。 干燥失重 取本品适量，置105℃干燥3小时，减失重量不得过5.0%(中国药典1995年版二部附录Ⅷ L)。 重金属 取本品0.5g，依法检查(中国药典1995年版二部附录Ⅷ H第一法),含重金属不得过百万分之二十。 异常毒性 取本品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含44000单位的溶液。 取体重20±1g的雄性小白鼠5只,分别自尾静脉注射0.5ml,给药后30分钟内不得出现呼吸困难、抽搐症状。 降压物质 取本品适量，依法检查(中国药典1995年版二部附录Ⅺ G),剂量按猫体重每1kg注射1万单位，应符合规定。 热原 取本品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含200单位的溶液，依法检查(中国药典1995年版二部附录Ⅺ D)，剂量按家兔体重每1kg注射1ml，应符合规定。 【比活力测定】 效价测定 对照品溶液的制备 取105℃干燥至恒重的硫酸胺0.1322g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。 临用前精密吸取5ml置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。 供试品溶液的制备 取本品约0.1g，精密称定，加入磷酸盐缓冲液(pH8.0)(取磷酸氢二钠17.9g，磷酸二氢钠7.8g，加水约400ml溶解后，调节pH值至8.0，再加水至500ml)溶解，制成每1ml中含L-门冬酰胺酶0.05mg的溶液。 测定法 取试管3支(14×1.2cm)，各加0.33%门冬酰胺溶液1.9ml,于37℃水浴中预热3分钟,分别于第1管(t0)加入上述磷酸盐缓冲液(pH8.0)0.1ml，第2、3管(t)各精密加入供试品溶液0.1ml,置37℃水浴中,准确反应15分钟，立即加入25%三氯醋酸溶液各0.5ml,摇匀，分别为空白反应液(t0)和反应液(t)。 精密量取t0、t和对照品溶液各0.5ml置试管中,每份平行做2管，各加水7.0ml及碘化汞钾溶液(取碘化汞23g，碘化钾16g，加水至100ml，临用前用20%氢氧化钠溶液等体积混合)1ml，混匀；另取试管一支，加水7.5ml及碘化汞钾溶液1ml，作为空白对照管，室温放置15分钟，于450nm的波长处，分别测定吸收度A0、At和As，计算平均值，按下式计算： (At-A0)×50×稀释倍数 效价(单位/mg)＝────────────── As×15×称样量(mg) 式中 50为反应常数；15为反应时间。 效价单位定义：一个L-门冬酰胺酶单位相当于在37±1℃，每分钟分解L-门冬酰胺产生1μmol氨所需的酶量。 蛋白含量 取本品约20mg，精密称定，照氮测定法(中国药典1995年版二部附录ⅦD第二法)测定，计算每1mg供试品中蛋白毫克数。 比活力 按下式计算： 每1mg供试品中效价单位数 比活力＝───────────── 每1mg供试品中蛋白毫克数 【作用与用途】 抗肿瘤酶类药。 【贮藏】 遮光，密闭，冷处保存。 【制剂】 注射用L-门冬酰胺酶附SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定L-门冬酰胺酶纯度一、试剂配制1.丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备溶液称取丙烯酰胺29.2g，双丙烯酰胺0.8g，加水溶解，并稀释至100ml，过滤贮存于棕色瓶中，4℃保存。 2.三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.8)称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加水溶解，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至8.8,加水稀释至100ml，4℃保存。 3.三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.8)量取上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.8)1份，加水2份稀释后,用2mol/L盐酸溶液调节pH值至6.8，4℃保存。 4.10%十二烷基硫酸钠溶液称取十二烷基硫酸钠10g，加水溶解，并稀释至100ml，室温保存。 5.供试品缓冲液量取水4.8ml，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.8)1.2ml，甘油1.0ml，10%十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，0.5%(W/V)溴酚蓝溶液0.5ml，β-巯基乙醇0.5ml混匀，4℃保存。 6.电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷15g，甘氨酸72g，十二烷基硫酸钠5g，加水溶解，并稀释至1000ml，4℃保存。 临用前5倍稀释。 7.10%过硫酸铵溶液(临用前配制)8.固定液称取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水至500ml。 9.染色液称取0.5g考马斯亮蓝R-250，加水200ml溶解后，加甲醇200ml与冰醋酸50ml，再加水至500ml。 10.脱色液量取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。 11.保存液量取冰醋酸75ml，加水至1000ml，混匀。 二、凝胶的制备1.分离胶的制备(12%)量取水3.35ml，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.8)2.5ml，10%十二烷基硫酸钠溶液100μl,丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备液4.0ml，混匀，脱气15分钟后，再加入10%过硫酸铵溶液50μl,四甲基乙二胺5μl，充分混匀，立即小心地倒入胶膜中，在胶面上覆上一层水，水平静置至胶体凝固。 2.浓缩胶的配制量取水6.1ml，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.8)2.5ml,10%十二烷基硫酸钠溶液100μl，丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备液1.3ml，混匀，脱气15分钟，再加入10%过硫酸铵溶液50μl，四甲基乙二胺10μl，混匀，立即倒入去掉水层的分离胶上，插入梳子，梳子底部与分离胶的前沿距离约1cm，水平放置至胶体凝固。 三、电泳凝胶板制好后，各孔加入10μl的供试品溶液，倒入电极缓冲液，200伏电压下进行电泳。 当蓝色溴酚蓝接近胶板底部时，停止电泳，取下胶板，在溴酚蓝处做标记。 四、胶板的处理将胶板置于固定液中,固定30分钟，再取出胶板置于染色液中，37℃染色2～3小时,然后将胶板置于脱色液中，至背景清晰无色(中途可换几次脱色液)，然后将胶板置于保存液中保存。 五、结果处理取胶板在薄层扫描仪上进行扫描，计算百分含量。 将电泳胶板照相保存。 |