药物代谢研究的意义与进展(下)
二、 药物代谢转化研究常用方法及系统
1.体内代谢研究
在生物体内,包括药物在内的大多数外源物(Xenobiotics)主要由肝脏代谢,其含有大部分代谢酶(P450及相关酶)并且具有高血流量，因而成为最主要的生物转化器官。另外，药物亦可在肝外器官如肾、脑、肺、胃、肠道、皮肤、胎盘等多处器官和组织中发生代谢转化。药物与机体作用后，被排除体外，其中最重要的是经肾或胆汁排出。一般进行药物代谢研究，整体动物或人体内研究最能反映药物代谢的体内整体特征，但出于伦理考虑，很少在人体内进行药物代谢及其毒理研究。一般首先采用实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗等，但由于药物代谢受多种因素干扰，尤其存在明显的代谢种属差异性，因此从动物获得的信息外推至人体具有风险性及欺骗性。使用高等动物如minipig、灵长类动物，由于它们生理结构上更接近人体，可提供有关人体代谢的可能有用信息。近年来，加速器质谱法(Accelerator
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mass spectrometry，AMS)作为高灵敏度、高准确度的定量测定同位素的质谱法，已应用于生物医学领域，它使得以极低的化学或放射危害直接进行人体内药物的ADME研究成为可能，它与色谱法联用，可用于鉴定代谢产物及毒物、药物的分子靶标。整体动物或人体实验，尿液、胆汁中药物代谢产物的存在情况常能代表性地反映药物在生物体内代谢转化全貌，因此，一般采用收集尿液和胆汁的方法对代谢物进行分析研究。
2.体外代谢研究系统及应用
生物样品中药物及其代谢物浓度一般很低，而且生物样品成分复杂，内源杂质较多，因此直接从尿液、胆汁、血液中分离检测代谢物较为困难；另外，体内整体动物实验周期长，受干扰因素多，样品处理较复杂，尤其不能适应现代药物开发研究的高通量代谢筛选要求。采用体外代谢研究可以排除体内因素干扰，直接观察酶对底物的选择代谢性，为整体试验提供可靠的理论依据。对于体内代谢转化率低、毒性大及缺乏灵敏检测手段的药物来说，体外代谢研究成为了良好的研究手段。
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肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。
2.1 肝微粒体体外温孵法及基因重组P450酶系
2.1.1 肝微粒体体外温孵法
肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。
2.1.1.1 细胞色素P450及其亚型
细胞色素P450(CYP450S)是肝微粒体混合功能氧化酶系的主要成分，是一组由许多同功酶组成的超基因大家族，涉及大多数药物代谢的P450酶系主要有CYP1、CYP2、CYP3三个家族，根据代谢转化的特点，可有目的地进行诱导，影响其酶的亚型，使其对底物的代谢选择性更强及转化率更高。
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2.1.1.2 运用肝微粒体体外温孵法进行药物体外代谢途径研究
运用肝微粒体及NADP+与异柠檬酸还原酶系再生NADPH系统能够进行药物体外代谢途径的研究，Alison
等对Tegaserod(一种选择性的5-HT4受体)的体外代谢途径进行研究，结果表明，O-去甲基的Tegaserod是其在肝微粒体代谢中的主要产物；而应用人肝组织切片及小肠组织切片对该药代谢途径作了研究，通过LC/MS的检测分析，N-葡萄糖醛酸化的Tegaserod为其主要的代谢产物，O-去甲基的Tegaserod未检出。说明肝微粒体与肝组织切片中代谢酶系的组成存在差异，对应于催化不同的代谢途径，而哪一种体外代谢途径更接近于体内情况仍需进一步的研究。
2.1.1.3 运用肝微粒体体外温孵法预测药物体内代谢清除研究
目前已越来越多地运用肝微粒体体外温孵法预测药物在体内的代谢清除，一般通过测定药物体外代谢酶促动力学获得Vmax及Km(米氏常数)，运用合理的药代动力学模型来推断体内药物的代谢清除。
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肝微粒体体外温孵法较其他的体外肝代谢方法其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普及。但肝微粒体体外温孵法同其他体外肝代谢方法相比，在与体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。
2.1.2 基因重组P450酶系
基因重组P450酶即利用基因工程及细胞工程，将调控P450酶表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，经细胞培养，表达高水平的P450，纯化后可获得较纯的单一P450同功酶。
基因重组P450酶系因其具有分子水平的优势在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。基因重组P450酶系还可促进了对人P450酶系功能和特异性的研究，导致其更便利的应用于药物的高通量筛选。因其结果的具体性和科学性更强，故适合研究药物代谢领域微观化和细节化的问题，更有利于指导相关领域的工作。但其实验成本较高，有碍方法的广泛开展。
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2.2 肝细胞体外温孵法
肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似，也是以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物-药物间相互作用时，该方法得到广泛的应用。但肝细胞制备技术较复杂，目前以胶原酶灌注技术为主。但体外肝细胞活性仅能维持4小时，不利于储存和反复使用。为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题，减少新鲜肝组织的消耗，尤其是目前人肝细胞的应用越来越普及，Hengstler等研究出了优化的肝细胞冷冻技术，同新鲜肝细胞相比经过该技术冷冻储藏的肝细胞，其活性为新鲜肝细胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%，因而该冷冻的肝细胞可用于温孵时间不超过8小时的代谢研究，亦可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一步优化。
肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相比在代谢物生成、体外代谢清除等研究方面有许多相似性，但针对具体药物在代谢物种类、生成主要代谢物及所反映的药代特性上存在着程度不同的质或量的差异。在药物代谢酶诱导研究中，肝细胞体外温孵法占主导地位，且随着肝细胞冷冻技术的发展，因其体外活性维持时间短而造成应用受限的状况也会不断的改善。
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2.3 离体肝灌流法
离体肝灌流法与肝微粒体法、肝细胞体外温孵法比较，一方面保留着完整细胞的天然屏障和营养液的供给，因而能在一段时间内保持肝脏的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有离体系统的优点，能够排除其他器官组织的干扰，可控制受试物质的浓度，定量的观察受试物质对肝脏的作用。
由于其具有器官水平的优势，兼备体外实验和整体动物实验的优点，更适于定量研究药物体外代谢行为和特点，并能解决在其他的体外肝代谢模型和整体动物实验中不能得到满意解决的难点，因而在药理学和毒理学的研究中已受到广泛的重视。同时离体肝灌流亦应用于对药物的药代动力学参数进行考察。但其对实验设备及技术有一定的要求，在一定程度上限制了其应用。
2.4 器官组织切片法
器官组织切片法也是研究药物代谢及其毒性的有效的体外系统，该法不破坏器官的细胞构成和组织结构，所得结果与体内法相近。在各种器官组织切片中以肝切片的应用最多。肝切片相对于纯化的P450同功酶、P450混合酶、肝微粒体、游离的肝细胞来说，不仅完整保留了所有肝脏药酶及各种细胞器的活性，而且，保留了细胞与细胞间的联系及一定的细胞间质，其更能反映药物在体内生理情况下的实际代谢过程，且可在较长的孵育时间内保持代谢活性(可达8～24h)；其缺点为切片机的使用受限，而且好的切片机价格昂贵。De
, 百拇医药
Kanter等利用利多卡因、睾酮及7-乙氧基香豆素为探针药物，进行了器官切片温孵实验，结果表明该系统具有Ⅰ相及Ⅱ相多相代谢途径，且易于比较不同器官组织的代谢差别。研究发现不同种属及不同器官间代谢类型及速度不同。
综上所述，常用的肝体外代谢研究方法有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法及器官组织切片法等，广泛应用于药物的代谢途径、体内代谢清除及药物间相互作用研究等，应根据不同的要求和目的分别选择应用。体外肝代谢研究可针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物的特性进行结构改造，以获得安全稳定的候选物，根据候选物的代谢特征(如药酶诱导、抑制、参与代谢的药酶种类、活性代谢物的生成等)确定药物的开发应用价值，因而具有广阔的应用前景。今后，随着研究的不断深入，药物体外肝代谢研究将不断完善，进一步发挥其价值。, 百拇医药(王满元)
1.体内代谢研究
在生物体内,包括药物在内的大多数外源物(Xenobiotics)主要由肝脏代谢,其含有大部分代谢酶(P450及相关酶)并且具有高血流量，因而成为最主要的生物转化器官。另外，药物亦可在肝外器官如肾、脑、肺、胃、肠道、皮肤、胎盘等多处器官和组织中发生代谢转化。药物与机体作用后，被排除体外，其中最重要的是经肾或胆汁排出。一般进行药物代谢研究，整体动物或人体内研究最能反映药物代谢的体内整体特征，但出于伦理考虑，很少在人体内进行药物代谢及其毒理研究。一般首先采用实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗等，但由于药物代谢受多种因素干扰，尤其存在明显的代谢种属差异性，因此从动物获得的信息外推至人体具有风险性及欺骗性。使用高等动物如minipig、灵长类动物，由于它们生理结构上更接近人体，可提供有关人体代谢的可能有用信息。近年来，加速器质谱法(Accelerator
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mass spectrometry，AMS)作为高灵敏度、高准确度的定量测定同位素的质谱法，已应用于生物医学领域，它使得以极低的化学或放射危害直接进行人体内药物的ADME研究成为可能，它与色谱法联用，可用于鉴定代谢产物及毒物、药物的分子靶标。整体动物或人体实验，尿液、胆汁中药物代谢产物的存在情况常能代表性地反映药物在生物体内代谢转化全貌，因此，一般采用收集尿液和胆汁的方法对代谢物进行分析研究。
2.体外代谢研究系统及应用
生物样品中药物及其代谢物浓度一般很低，而且生物样品成分复杂，内源杂质较多，因此直接从尿液、胆汁、血液中分离检测代谢物较为困难；另外，体内整体动物实验周期长，受干扰因素多，样品处理较复杂，尤其不能适应现代药物开发研究的高通量代谢筛选要求。采用体外代谢研究可以排除体内因素干扰，直接观察酶对底物的选择代谢性，为整体试验提供可靠的理论依据。对于体内代谢转化率低、毒性大及缺乏灵敏检测手段的药物来说，体外代谢研究成为了良好的研究手段。
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肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。
2.1 肝微粒体体外温孵法及基因重组P450酶系
2.1.1 肝微粒体体外温孵法
肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。
2.1.1.1 细胞色素P450及其亚型
细胞色素P450(CYP450S)是肝微粒体混合功能氧化酶系的主要成分，是一组由许多同功酶组成的超基因大家族，涉及大多数药物代谢的P450酶系主要有CYP1、CYP2、CYP3三个家族，根据代谢转化的特点，可有目的地进行诱导，影响其酶的亚型，使其对底物的代谢选择性更强及转化率更高。
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2.1.1.2 运用肝微粒体体外温孵法进行药物体外代谢途径研究
运用肝微粒体及NADP+与异柠檬酸还原酶系再生NADPH系统能够进行药物体外代谢途径的研究，Alison
等对Tegaserod(一种选择性的5-HT4受体)的体外代谢途径进行研究，结果表明，O-去甲基的Tegaserod是其在肝微粒体代谢中的主要产物；而应用人肝组织切片及小肠组织切片对该药代谢途径作了研究，通过LC/MS的检测分析，N-葡萄糖醛酸化的Tegaserod为其主要的代谢产物，O-去甲基的Tegaserod未检出。说明肝微粒体与肝组织切片中代谢酶系的组成存在差异，对应于催化不同的代谢途径，而哪一种体外代谢途径更接近于体内情况仍需进一步的研究。
2.1.1.3 运用肝微粒体体外温孵法预测药物体内代谢清除研究
目前已越来越多地运用肝微粒体体外温孵法预测药物在体内的代谢清除，一般通过测定药物体外代谢酶促动力学获得Vmax及Km(米氏常数)，运用合理的药代动力学模型来推断体内药物的代谢清除。
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肝微粒体体外温孵法较其他的体外肝代谢方法其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普及。但肝微粒体体外温孵法同其他体外肝代谢方法相比，在与体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。
2.1.2 基因重组P450酶系
基因重组P450酶即利用基因工程及细胞工程，将调控P450酶表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，经细胞培养，表达高水平的P450，纯化后可获得较纯的单一P450同功酶。
基因重组P450酶系因其具有分子水平的优势在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。基因重组P450酶系还可促进了对人P450酶系功能和特异性的研究，导致其更便利的应用于药物的高通量筛选。因其结果的具体性和科学性更强，故适合研究药物代谢领域微观化和细节化的问题，更有利于指导相关领域的工作。但其实验成本较高，有碍方法的广泛开展。
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2.2 肝细胞体外温孵法
肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似，也是以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物-药物间相互作用时，该方法得到广泛的应用。但肝细胞制备技术较复杂，目前以胶原酶灌注技术为主。但体外肝细胞活性仅能维持4小时，不利于储存和反复使用。为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题，减少新鲜肝组织的消耗，尤其是目前人肝细胞的应用越来越普及，Hengstler等研究出了优化的肝细胞冷冻技术，同新鲜肝细胞相比经过该技术冷冻储藏的肝细胞，其活性为新鲜肝细胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%，因而该冷冻的肝细胞可用于温孵时间不超过8小时的代谢研究，亦可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一步优化。
肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相比在代谢物生成、体外代谢清除等研究方面有许多相似性，但针对具体药物在代谢物种类、生成主要代谢物及所反映的药代特性上存在着程度不同的质或量的差异。在药物代谢酶诱导研究中，肝细胞体外温孵法占主导地位，且随着肝细胞冷冻技术的发展，因其体外活性维持时间短而造成应用受限的状况也会不断的改善。
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2.3 离体肝灌流法
离体肝灌流法与肝微粒体法、肝细胞体外温孵法比较，一方面保留着完整细胞的天然屏障和营养液的供给，因而能在一段时间内保持肝脏的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有离体系统的优点，能够排除其他器官组织的干扰，可控制受试物质的浓度，定量的观察受试物质对肝脏的作用。
由于其具有器官水平的优势，兼备体外实验和整体动物实验的优点，更适于定量研究药物体外代谢行为和特点，并能解决在其他的体外肝代谢模型和整体动物实验中不能得到满意解决的难点，因而在药理学和毒理学的研究中已受到广泛的重视。同时离体肝灌流亦应用于对药物的药代动力学参数进行考察。但其对实验设备及技术有一定的要求，在一定程度上限制了其应用。
2.4 器官组织切片法
器官组织切片法也是研究药物代谢及其毒性的有效的体外系统，该法不破坏器官的细胞构成和组织结构，所得结果与体内法相近。在各种器官组织切片中以肝切片的应用最多。肝切片相对于纯化的P450同功酶、P450混合酶、肝微粒体、游离的肝细胞来说，不仅完整保留了所有肝脏药酶及各种细胞器的活性，而且，保留了细胞与细胞间的联系及一定的细胞间质，其更能反映药物在体内生理情况下的实际代谢过程，且可在较长的孵育时间内保持代谢活性(可达8～24h)；其缺点为切片机的使用受限，而且好的切片机价格昂贵。De
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Kanter等利用利多卡因、睾酮及7-乙氧基香豆素为探针药物，进行了器官切片温孵实验，结果表明该系统具有Ⅰ相及Ⅱ相多相代谢途径，且易于比较不同器官组织的代谢差别。研究发现不同种属及不同器官间代谢类型及速度不同。
综上所述，常用的肝体外代谢研究方法有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法及器官组织切片法等，广泛应用于药物的代谢途径、体内代谢清除及药物间相互作用研究等，应根据不同的要求和目的分别选择应用。体外肝代谢研究可针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物的特性进行结构改造，以获得安全稳定的候选物，根据候选物的代谢特征(如药酶诱导、抑制、参与代谢的药酶种类、活性代谢物的生成等)确定药物的开发应用价值，因而具有广阔的应用前景。今后，随着研究的不断深入，药物体外肝代谢研究将不断完善，进一步发挥其价值。, 百拇医药(王满元)