米非司酮抗早孕绒毛及蜕膜中雌、孕激素受体的免疫组织化学研究
我们应用免疫组织化学(免疫组化)方法及CHAMPION数字图像处理系统，检测米非司酮并米索前列醇终止早孕的绒毛及蜕膜中雌激素受体(ER)、与孕激素受体(PR)，从受体水平探讨药物流产的机理及流产后子宫出血时间长的可能原因。1 资料与方法1.1 临床资料 1999年8月至10月在我院妇产科门诊确诊为早孕，自愿要求药物终止妊娠10例为米非司酮组，选择同期吸宫流产10例为对照组。两组对象均符合以下条件：19～32岁；停经＜56d；平时月经规则；3个月内未用过甾体激素类药物；无生殖道炎症和肿瘤。1.2 方法1.2.1 标本收集 米非司酮组：晨7时服米非司酮50mg，晚7时25mg，连服2d，总量150mg。第3天晨7时服米索前列醇600μg，8时来我院观察、孕囊排出后即刻收集绒毛及蜕膜。对照组：常规负压吸引流产，收集绒毛及蜕膜。1.2.2 标本处理 取绒毛及蜕膜立即置于10%甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、厚5μm切片。1.2.3 ER、PR免疫组化染色方法 采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白—过氧化酶法(strepvavidin-peroxidase,SP)，每张切片常规脱蜡和水化后用PBS液(pH7.4)冲洗3次；加50μl过氧化酶阻断剂，室温下孵育10min；用PBS冲洗3次；加50μl正常动物非免疫血清，室温下孵育5min，PBS冲洗1次；加一抗50μl，置4℃冰箱中过夜，PBS冲洗3次；加生物素标记的二抗50μl，室温下孵育10min；PBS冲洗3次；加SP溶液50μl，室温下孵育10min，PBS冲洗3次；加新配制的二氨基联苯胺(DAB)溶液100μl；显微镜下观察，显色后流水冲洗终止显色、脱水、封片。1.2.4 主要试剂 抗ER、PR单克隆抗体、DAB溶液、SP免疫组化染色超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。1.3 结果判断 SP免疫组化染色后细胞核出现棕黄色颗粒为ER或PR阳性细胞，观察棕黄色颗粒的分布及染色深浅。细胞核呈蓝色为阴性细胞。结果采用阳性细胞百分比法，每张切片经CHAMPION数字图像处理系统处理，得出阳性率。1.4 统计学分析 采用t检验。2 结 果2.1 两组绒毛中ER、PR表达 对照组绒毛细胞胞核呈棕黄色，ER、PR呈阳性。米非司酮组10例绒毛细胞中未见棕黄色颗粒，ER、PR无表达。两组绒毛中ER、PR阳性细胞百分比差异有显著性(P＜0.005)见表1。2.2 两组蜕膜中ER、PR表达 两组蜕膜细胞胞核均有棕黄色颗粒覆盖，对照组蜕膜细胞胞核内棕黄色颗粒多、染色深，米非司酮组棕黄色染色的细胞数及染色强度明显减少。两组蜕膜中ER、PR阳性细胞百分比差异有显著性(P＜0.005)。
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3 讨 论3.1 米非司酮在受体水平抗早孕的机理 米非司酮在受体水平拮抗孕激素生物学效应，对胚胎及其支持组织的代谢和形态结构产生多方面的影响［1］，包括改变内分泌激素之间的平衡，从而发挥抗早孕作用。关于米非司酮对绒毛中ER、PR的影响至今未见报道，而对蜕膜中ER、PR的影响仅有少量报道，且观点不一。本研究结果表明，正常早孕绒毛和蜕膜中都存在ER、PR，且蜕膜中ER、PR水平高于绒毛。
米非司酮能否直接作用于绒毛，文献报道不一。Shi等［2］从妊娠蜕膜和绒毛中PR含量及米非司酮作用后的变化推测，米非司酮不能直接作用于绒毛。杨业洲［3］等发现，米非司酮能抑制滋养细胞增殖，诱导和促进其凋亡，米非司酮对绒毛的作用是直接的。本研究证实，正常早孕绒毛中存在ER、PR，服米非司酮后能直接作用于绒毛。因此，我们推测用米非司酮后可能影响了绒毛细胞内分泌激素之间的平衡，导致绒毛滋养细胞变性、坏死，继而发生流产。我们认为，米非司酮抗早孕机理不仅是继发于蜕膜损伤，对绒毛的直接作用也不可忽视。这一结果为米非司酮能直接作用于绒毛提供依据。
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免疫组化SP法染色显示，正常早孕蜕膜细胞胞核被棕黄色颗粒覆盖比例较多，染色较深，米非司酮组蜕膜中ER、PR染色的细胞数显著减少，两组差异有显著性(P＜0.005)。提示米非司酮能降低蜕膜中ER、PR水平。PR水平下降影响孕激素生物学效应，蜕膜变性、坏死，继而导致绒毛供血不足，胚胎停止发育，这是米非司酮抗早孕的重要药理作用。3.2 米非司酮对蜕膜中ER的影响 本研究结果表明，米非司酮对蜕膜中ER的影响与既往多数文献报道不一致。周剑萍等［4］报道，早孕妇女服米非司酮后蜕膜ER明显增加。Shi等［5］则报道，ER无变化，本研究则表明，米非司酮使蜕膜中ER下降，黄丽丽等［6］的报道与本结果相同。由于蜕膜中ER下降，雌激素不能发挥生物学效应，药物流产后的子宫内膜创面修复发生障碍，同时降低子宫平滑肌对催产素的敏感性，蜕膜不易排出，滞留宫腔，导致流产后子宫出血时间延长。这一观点可为临床防治药物流产后子宫出血提供理论依据。
米非司酮抗早孕的机理可能是多环节的，本研究提示，米非司酮使早孕绒毛及蜕膜中ER、PR下降是其抗早孕的机理之一。但受体水平的调控是一个复杂的过程，尚需进一步研究。杨雪峰(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)任芬若(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)翟子江(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)白桦(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)胡生海(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)王淑芝(河南巩义市妇幼保健院)姚雪蓉(河南巩义市妇幼保健院)参考文献1，Spitz IM,Bardin CW.Clinical pharmacology of RU486:An antiprogestin and antiglucocorticoid.Contracption,1993,48:403～4442，Shi WL,Wang JD,Fu Y,et al.Estrogen and progesterone receptor in human decidua after RU486 treatment.Fertril Steril,1993,60:68-733，杨业洲，曹泽毅，韩字研，等.RU486对人早孕绒毛细胞增殖和凋亡的影响.中华妇产科杂志，1998，(5)：2684，周剑萍，张俊慧，刘银坤，等.RU48对人蜕膜与绒毛糖脂及雌、孕激素受体的影响.生殖与避孕，1996，(5)：3595，Shi WJ,Wang JD,Xu LK,et al.Early changes of affinity and binding sites of progeterone and oestrogen receptors in decidua exposed to RU486.Hum Reprod,1992,7:9346，黄丽丽，石一复，陈晓瑞，等.RU486抗早孕蜕膜雌、孕激素受体的免疫组织化学研究.中华妇产科杂志，1999，5：275-277 杨雪峰 任芬若 翟子江 白桦 胡生海 王淑芝 姚雪蓉现代妇产科进展, http://www.100md.com
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3 讨 论3.1 米非司酮在受体水平抗早孕的机理 米非司酮在受体水平拮抗孕激素生物学效应，对胚胎及其支持组织的代谢和形态结构产生多方面的影响［1］，包括改变内分泌激素之间的平衡，从而发挥抗早孕作用。关于米非司酮对绒毛中ER、PR的影响至今未见报道，而对蜕膜中ER、PR的影响仅有少量报道，且观点不一。本研究结果表明，正常早孕绒毛和蜕膜中都存在ER、PR，且蜕膜中ER、PR水平高于绒毛。
米非司酮能否直接作用于绒毛，文献报道不一。Shi等［2］从妊娠蜕膜和绒毛中PR含量及米非司酮作用后的变化推测，米非司酮不能直接作用于绒毛。杨业洲［3］等发现，米非司酮能抑制滋养细胞增殖，诱导和促进其凋亡，米非司酮对绒毛的作用是直接的。本研究证实，正常早孕绒毛中存在ER、PR，服米非司酮后能直接作用于绒毛。因此，我们推测用米非司酮后可能影响了绒毛细胞内分泌激素之间的平衡，导致绒毛滋养细胞变性、坏死，继而发生流产。我们认为，米非司酮抗早孕机理不仅是继发于蜕膜损伤，对绒毛的直接作用也不可忽视。这一结果为米非司酮能直接作用于绒毛提供依据。
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免疫组化SP法染色显示，正常早孕蜕膜细胞胞核被棕黄色颗粒覆盖比例较多，染色较深，米非司酮组蜕膜中ER、PR染色的细胞数显著减少，两组差异有显著性(P＜0.005)。提示米非司酮能降低蜕膜中ER、PR水平。PR水平下降影响孕激素生物学效应，蜕膜变性、坏死，继而导致绒毛供血不足，胚胎停止发育，这是米非司酮抗早孕的重要药理作用。3.2 米非司酮对蜕膜中ER的影响 本研究结果表明，米非司酮对蜕膜中ER的影响与既往多数文献报道不一致。周剑萍等［4］报道，早孕妇女服米非司酮后蜕膜ER明显增加。Shi等［5］则报道，ER无变化，本研究则表明，米非司酮使蜕膜中ER下降，黄丽丽等［6］的报道与本结果相同。由于蜕膜中ER下降，雌激素不能发挥生物学效应，药物流产后的子宫内膜创面修复发生障碍，同时降低子宫平滑肌对催产素的敏感性，蜕膜不易排出，滞留宫腔，导致流产后子宫出血时间延长。这一观点可为临床防治药物流产后子宫出血提供理论依据。
米非司酮抗早孕的机理可能是多环节的，本研究提示，米非司酮使早孕绒毛及蜕膜中ER、PR下降是其抗早孕的机理之一。但受体水平的调控是一个复杂的过程，尚需进一步研究。杨雪峰(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)任芬若(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)翟子江(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)白桦(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)胡生海(河南医科大学第三附属医院妇产科，450052)王淑芝(河南巩义市妇幼保健院)姚雪蓉(河南巩义市妇幼保健院)参考文献1，Spitz IM,Bardin CW.Clinical pharmacology of RU486:An antiprogestin and antiglucocorticoid.Contracption,1993,48:403～4442，Shi WL,Wang JD,Fu Y,et al.Estrogen and progesterone receptor in human decidua after RU486 treatment.Fertril Steril,1993,60:68-733，杨业洲，曹泽毅，韩字研，等.RU486对人早孕绒毛细胞增殖和凋亡的影响.中华妇产科杂志，1998，(5)：2684，周剑萍，张俊慧，刘银坤，等.RU48对人蜕膜与绒毛糖脂及雌、孕激素受体的影响.生殖与避孕，1996，(5)：3595，Shi WJ,Wang JD,Xu LK,et al.Early changes of affinity and binding sites of progeterone and oestrogen receptors in decidua exposed to RU486.Hum Reprod,1992,7:9346，黄丽丽，石一复，陈晓瑞，等.RU486抗早孕蜕膜雌、孕激素受体的免疫组织化学研究.中华妇产科杂志，1999，5：275-277 杨雪峰 任芬若 翟子江 白桦 胡生海 王淑芝 姚雪蓉现代妇产科进展, http://www.100md.com