聚合酶链式反应(Pcr)技术在感染性疾病诊断中的应用
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[作 者]
连 伟
[单 位]
[来 源]
[全 文]
聚合酶链式反应技术(PCR)是1985年由美国的Cetus公司的研究人员首先报道的。在一个简单的体外的试管反应中，能使DNA分子短时间内由极少量增加至数百万倍。PCR的特点被总结为"三S"：即敏感(Sensitive)、特异(Selectivity)、高效快速(Speed)。自从其问世以来，已在医学、基础医学和生物学等许多领域内得到广泛推广。据不完全统计，应用PCR方法的文章目前已超过5000篇。
感染性疾病的诊断，过去多采用临床诊断、形态学诊断、生化学诊断及血清学诊断的方法，这些方法有时存在灵敏度和特异性低及速度慢等不足之处，在技术操作方面也存在一定的局限性，有的病原体侵入人体后需潜伏一定时间后才能出现抗体，用血清学和生化学方法很难及时诊断出来，有的病毒(如艾滋病病毒)的血清学诊断只能确定是否接触过这种病毒，但不能肯定是否存在现行感染，而分离、培养病毒是十分繁琐的。PCR技术和上述方法相比，具有高度的特异性、灵敏性、操作简单、快速等优点，国内外已在几十种感染性疾病中开展应用。
, 百拇医药
1 乙型肝炎病毒
乙型肝炎是世界性传染病，在第三世界中流行尤其严重，中国亦是乙肝的高发国家。乙型肝炎病毒的DNA是已知动物病毒中基因组最小的分子，由部分双链环形DNA组成。其全基因组序列已经测出，不同亚型或不同毒株间核苷酸总数稍有差异，各基本的定位也已十分明确，Larzul等从三种亚型、五个毒株的保守序列中设计了16个引物，可与DNA不同部位结合，其中15个引物分别含有BamHI、Hind III、PstI等酶切位点，合成的片段可以从128-1226核苷酸可覆盖全基因组，Kaneko等应用0.01pg的克隆乙肝病毒DNA为模板，设计了C基因特异的一对引物，扩增产物应用琼脂糖凝胶电泳分离后，溴化乙锭(EB)染色法或PCR-Southern印迹杂交法或斑点杂交法进行鉴定，使乙肝病毒检测的灵敏度可达到样品中10-5pgDNA，是目前所有用于乙肝诊断的方法中敏感度最高的一种，它在临床诊断中的普及应用，可使人们对病毒在宿主体内的感染状态有新的认识。
2 巨细胞病毒
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董枫等根据电脑基因库中人巨细胞病毒AD169株的核苷酸顺序资料，设计了两对引物和一个探针，扩增产物长度分别为151bp和215bp，PCR产物应用EB染色及Southern印迹杂交鉴定，结果证明有高度的特异性，灵敏度可达到1fg模板DNA，相当于4个病毒颗粒，高于病毒分离方法。同时还对可疑感染患儿的尿标本进行了检测，认为此方法适全在临床和基础研究中推广应用。
3 人类乳头瘤病毒
人类乳头瘤病毒(HPV)基因组为双链闭环DNA，是一种有明显异质性的病毒，每一型病毒都与特定的皮肤粘膜病变相联系。近年来发现人类生殖道HPV感染明显升高，且有证据表明这与生殖道癌瘤的发生有一定的关联，因此寻找一种简便、敏感而特异的诊断HPV感染的方法十分重要。Shibata等应用PCR方法扩增靶序列，少至0.01pg的HPV-16-pBR322或HPV-BR322DNA能被扩增而显出一条十分清晰的带，因此大量宿主基因DNA存在情况下，仍能特异地发现病毒的感染。
, 百拇医药
4 艾滋病毒
艾滋病是在本世纪出现的对人类危害最大的一种传染性疾病，是因人类免疫系统缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染所致。HIV属于逆转录的RNA病毒，在细胞内敏殖水平较低，难以培养，也不易用血清学方法检出。Kellogg选限病毒基因中的高度保守区，设计了两对引物和一对探针，以HLA-Dqα基因的扩增作为HIV基因扩增的内对照，扩增产物结合寡核苷酸探针杂交，HIV抗体阳性者的HIV检测率达96%。
Albert等使用他们合成的四套套缩式引物(nested primer)直接应用细胞裂解物作为模板进行HIV基因的扩增，用溴化乙锭染色的凝胶电泳来观察判断结果，使PCR更加敏感、快速特异。应用上述方法第一次证实了一个人可同时被两种类型的HIV(I型及II型)所感染。目前已对HIV感染的母亲所出生的新生儿及儿童成功地进行了HIV的检测。
, 百拇医药 5 螺旋体
莱姆氏病是由博氏疏螺旋体感染所引起的一种疾病。在北美、欧洲等国较常见，有人称之为仅次于艾滋病的第二位传染性疾病，其临床表现多种多样，很不典型。此类螺旋体感染后引起的免疫反应很弱，血清学方法存在不敏感及交叉反应强等缺点，菌体分离很困难，培养条件复杂，阳性率很低，临床上诊断不易。Rosa和Schwan对10余种博氏疏螺旋体菌株及其它几种疏螺旋体进行克隆，从中筛选出位于染色体上的一段基因进行序列分析，并据此设计了一对引物。应用该引物对博氏疏螺旋体进行PCR扩增，结果18株中的17株博氏疏螺旋体均呈阳性反应，而与其它疏螺旋体没有任何交叉反应。另外，Rosa又进一步设计了三对引物，其中一对能检测出所有亚洲菌株和大部分欧洲菌株，另一对能检测出所有美洲菌株和部分欧洲菌株，应用此方法可以把不同来源的菌株分成两个亚群，而美洲和欧洲的莱姆病，其临床表现、病情发展及预后均有不同，因此这对了解菌株起源及其与临床之间的关系具有很大价值。Malloy等针对博氏疏螺旋体外膜蛋白基因(OspA)设计了一对引物，扩增产生309bp长的片段，应用扩增产物进行电泳检查及斑点杂交，对于所检测的十株博氏螺旋体均呈阳性，而其它细菌和疏螺旋体均为阴性，同时在样品制备上简化了DNA撮步骤，采用样品处理一步法进行PCR，得到了良好的效果，为临床开展检测工作提供了方便。我们采用PCR方法进行博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因的检测，也取得满意结果。
, 百拇医药
Eye建立了检测肾钩端螺旋体Sejroe血清群中一些亚型的PCR方法，检出灵敏度达到10个螺旋体DNA，大大高于血清学方法和分离培养。
6 立克次体
立克次体病传染性很强，既往的检测方法周期长、效率低、成本高，且有遭受感染的危险，Webb针对鼠立克次休17kD蛋白抗原基因设计引物，扩增出434bp的片段，对不同感染程度的蚤匀标本进行检测，同步进行ELISA、DFA和噬菌斑分析，结果显示PCR方法灵敏度较同。
7 支原体
目前认为，肺炎支原体肯定为人类原发性非典型肺炎的病原体。Berent从肺炎支原体标准株DNA中分离出长度0.5-1.0kb的片段作为目的基因，合成引物及寡核苷酸探针，不同的肺炎支原体株经PCR后进行斑点杂交，或Southern blot分析，均呈阳性，而其他支原体则均为阴性，应用此方法对实验性感染肺炎支原体的动物标本进行检测，并同时比较PCR方法、分离培养和同位素探针杂交法，结果PCR方法更敏感和稳定。
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8 衣原体
沙眼衣原体的体外培养十分困难，极易污染。Stergarrd根据其特异性质粒的序列设计了两对引物，建立了PCR系统，反应灵敏度能达到单拷贝的质粒DNA分子，对已经进行了体外培养和酶联免疫吸附试验阳性的临床标本进行检测，符合率达到了100%。
9 结核杆菌
结核在中国仍然是对人民生活产生严重影响的细菌，且治疗时间长，疗效慢，故建立快速敏感的结核菌检查法，无论对结核的诊断，还是疗效观察，都有重要意义。Hance在1989年首先应用PCR方法检测结核杆菌DNA。Hermans等根据只存在于结核杆菌复合的IS986的DNA序列设计了一对引物，扩增245bp的片段，应用Southern blot进行鉴定，检测灵敏度可达到10~100fgDNA，相当于10~100个细菌的DNA量，且只有人型、牛型结核菌和BCG有阳性扩增。国内吴雪琼、程绍基等采用与Hermans 同样的引物进行研究，结果基本一致。Pierre采用再次扩增法对结核杆菌65kDα蛋白抗原基本进行扩增，提高了检测的敏感性，用于检测临床标本和痰液、支气管灌洗液、胸腔积液等，可以有效地防止这些标本中的物质对Taq聚合酶的抑制作用，从而使临床标本中结核杆菌的检出率大为提高。Ralphs建立的扩增结核杆菌1.5kb特异性片段的PCR方法，可以特异性地将结核杆菌与其它分支杆菌相区别。
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10 其它分支杆菌
Hartskeerl针对麻风杆菌36KDα蛋白抗原基困，建立了扩增530bp特异保守序列的PCR方法，用于检测感染动物组织标本中的麻风杆菌，灵敏度达到20个细菌DNA，促进了麻风病的诊断和研究。
鸟结核杆菌的感染常常是AIDS的并发症，但它与结核杆菌感染症状相似，临床上难以正确诊断，且使用常规抗痨治疗效果很差，需要有早期特异的诊断。Jocken建立的PCR方法能够特异地从艾滋病人的周围血中检测出鸟结核菌，为正确的治疗提供了可靠依据。
11 军团菌
军团菌属于细胞内寄生菌，可引起人类典型肺炎和庞蒂亚克热，其临床症状不典型，体外培养的阳性率不高，易致误诊，病死率可达20%，目前它是国外院外感染的主要致病菌。Starnbach等对嗜肺军团菌DNA的一个种特异性片段两端进行序列分析，设计了一对引物进行PCR扩增，对于水环境中嗜肺军团菌可以进行特异性检测。Rej则对嗜肺军团菌mip基因的mRAN进行反转录PCR扩增，此方法可以发现尚有致病性但培养阳性的军团菌。
12 其它
对伤寒杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌的毒素基因、大肠杆菌及产毒大肠杆菌，幽门螺杆菌[19]，顽固梭状芽胞杆菌及其毒素基因，以及原虫、锥虫、利什曼原虫、血吸虫、放线菌C5的PCR检测方法也都有所报道。应用这些方法，不仅能有效地诊断病原菌的感染，而且对感染的病菌是否存在毒素产生基因也可作出诊断，这对于疾病的正确治疗、处理及流行病学的研究都有着重要意义。, 百拇医药
连 伟
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聚合酶链式反应技术(PCR)是1985年由美国的Cetus公司的研究人员首先报道的。在一个简单的体外的试管反应中，能使DNA分子短时间内由极少量增加至数百万倍。PCR的特点被总结为"三S"：即敏感(Sensitive)、特异(Selectivity)、高效快速(Speed)。自从其问世以来，已在医学、基础医学和生物学等许多领域内得到广泛推广。据不完全统计，应用PCR方法的文章目前已超过5000篇。
感染性疾病的诊断，过去多采用临床诊断、形态学诊断、生化学诊断及血清学诊断的方法，这些方法有时存在灵敏度和特异性低及速度慢等不足之处，在技术操作方面也存在一定的局限性，有的病原体侵入人体后需潜伏一定时间后才能出现抗体，用血清学和生化学方法很难及时诊断出来，有的病毒(如艾滋病病毒)的血清学诊断只能确定是否接触过这种病毒，但不能肯定是否存在现行感染，而分离、培养病毒是十分繁琐的。PCR技术和上述方法相比，具有高度的特异性、灵敏性、操作简单、快速等优点，国内外已在几十种感染性疾病中开展应用。
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1 乙型肝炎病毒
乙型肝炎是世界性传染病，在第三世界中流行尤其严重，中国亦是乙肝的高发国家。乙型肝炎病毒的DNA是已知动物病毒中基因组最小的分子，由部分双链环形DNA组成。其全基因组序列已经测出，不同亚型或不同毒株间核苷酸总数稍有差异，各基本的定位也已十分明确，Larzul等从三种亚型、五个毒株的保守序列中设计了16个引物，可与DNA不同部位结合，其中15个引物分别含有BamHI、Hind III、PstI等酶切位点，合成的片段可以从128-1226核苷酸可覆盖全基因组，Kaneko等应用0.01pg的克隆乙肝病毒DNA为模板，设计了C基因特异的一对引物，扩增产物应用琼脂糖凝胶电泳分离后，溴化乙锭(EB)染色法或PCR-Southern印迹杂交法或斑点杂交法进行鉴定，使乙肝病毒检测的灵敏度可达到样品中10-5pgDNA，是目前所有用于乙肝诊断的方法中敏感度最高的一种，它在临床诊断中的普及应用，可使人们对病毒在宿主体内的感染状态有新的认识。
2 巨细胞病毒
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董枫等根据电脑基因库中人巨细胞病毒AD169株的核苷酸顺序资料，设计了两对引物和一个探针，扩增产物长度分别为151bp和215bp，PCR产物应用EB染色及Southern印迹杂交鉴定，结果证明有高度的特异性，灵敏度可达到1fg模板DNA，相当于4个病毒颗粒，高于病毒分离方法。同时还对可疑感染患儿的尿标本进行了检测，认为此方法适全在临床和基础研究中推广应用。
3 人类乳头瘤病毒
人类乳头瘤病毒(HPV)基因组为双链闭环DNA，是一种有明显异质性的病毒，每一型病毒都与特定的皮肤粘膜病变相联系。近年来发现人类生殖道HPV感染明显升高，且有证据表明这与生殖道癌瘤的发生有一定的关联，因此寻找一种简便、敏感而特异的诊断HPV感染的方法十分重要。Shibata等应用PCR方法扩增靶序列，少至0.01pg的HPV-16-pBR322或HPV-BR322DNA能被扩增而显出一条十分清晰的带，因此大量宿主基因DNA存在情况下，仍能特异地发现病毒的感染。
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4 艾滋病毒
艾滋病是在本世纪出现的对人类危害最大的一种传染性疾病，是因人类免疫系统缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染所致。HIV属于逆转录的RNA病毒，在细胞内敏殖水平较低，难以培养，也不易用血清学方法检出。Kellogg选限病毒基因中的高度保守区，设计了两对引物和一对探针，以HLA-Dqα基因的扩增作为HIV基因扩增的内对照，扩增产物结合寡核苷酸探针杂交，HIV抗体阳性者的HIV检测率达96%。
Albert等使用他们合成的四套套缩式引物(nested primer)直接应用细胞裂解物作为模板进行HIV基因的扩增，用溴化乙锭染色的凝胶电泳来观察判断结果，使PCR更加敏感、快速特异。应用上述方法第一次证实了一个人可同时被两种类型的HIV(I型及II型)所感染。目前已对HIV感染的母亲所出生的新生儿及儿童成功地进行了HIV的检测。
, 百拇医药 5 螺旋体
莱姆氏病是由博氏疏螺旋体感染所引起的一种疾病。在北美、欧洲等国较常见，有人称之为仅次于艾滋病的第二位传染性疾病，其临床表现多种多样，很不典型。此类螺旋体感染后引起的免疫反应很弱，血清学方法存在不敏感及交叉反应强等缺点，菌体分离很困难，培养条件复杂，阳性率很低，临床上诊断不易。Rosa和Schwan对10余种博氏疏螺旋体菌株及其它几种疏螺旋体进行克隆，从中筛选出位于染色体上的一段基因进行序列分析，并据此设计了一对引物。应用该引物对博氏疏螺旋体进行PCR扩增，结果18株中的17株博氏疏螺旋体均呈阳性反应，而与其它疏螺旋体没有任何交叉反应。另外，Rosa又进一步设计了三对引物，其中一对能检测出所有亚洲菌株和大部分欧洲菌株，另一对能检测出所有美洲菌株和部分欧洲菌株，应用此方法可以把不同来源的菌株分成两个亚群，而美洲和欧洲的莱姆病，其临床表现、病情发展及预后均有不同，因此这对了解菌株起源及其与临床之间的关系具有很大价值。Malloy等针对博氏疏螺旋体外膜蛋白基因(OspA)设计了一对引物，扩增产生309bp长的片段，应用扩增产物进行电泳检查及斑点杂交，对于所检测的十株博氏螺旋体均呈阳性，而其它细菌和疏螺旋体均为阴性，同时在样品制备上简化了DNA撮步骤，采用样品处理一步法进行PCR，得到了良好的效果，为临床开展检测工作提供了方便。我们采用PCR方法进行博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因的检测，也取得满意结果。
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Eye建立了检测肾钩端螺旋体Sejroe血清群中一些亚型的PCR方法，检出灵敏度达到10个螺旋体DNA，大大高于血清学方法和分离培养。
6 立克次体
立克次体病传染性很强，既往的检测方法周期长、效率低、成本高，且有遭受感染的危险，Webb针对鼠立克次休17kD蛋白抗原基因设计引物，扩增出434bp的片段，对不同感染程度的蚤匀标本进行检测，同步进行ELISA、DFA和噬菌斑分析，结果显示PCR方法灵敏度较同。
7 支原体
目前认为，肺炎支原体肯定为人类原发性非典型肺炎的病原体。Berent从肺炎支原体标准株DNA中分离出长度0.5-1.0kb的片段作为目的基因，合成引物及寡核苷酸探针，不同的肺炎支原体株经PCR后进行斑点杂交，或Southern blot分析，均呈阳性，而其他支原体则均为阴性，应用此方法对实验性感染肺炎支原体的动物标本进行检测，并同时比较PCR方法、分离培养和同位素探针杂交法，结果PCR方法更敏感和稳定。
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8 衣原体
沙眼衣原体的体外培养十分困难，极易污染。Stergarrd根据其特异性质粒的序列设计了两对引物，建立了PCR系统，反应灵敏度能达到单拷贝的质粒DNA分子，对已经进行了体外培养和酶联免疫吸附试验阳性的临床标本进行检测，符合率达到了100%。
9 结核杆菌
结核在中国仍然是对人民生活产生严重影响的细菌，且治疗时间长，疗效慢，故建立快速敏感的结核菌检查法，无论对结核的诊断，还是疗效观察，都有重要意义。Hance在1989年首先应用PCR方法检测结核杆菌DNA。Hermans等根据只存在于结核杆菌复合的IS986的DNA序列设计了一对引物，扩增245bp的片段，应用Southern blot进行鉴定，检测灵敏度可达到10~100fgDNA，相当于10~100个细菌的DNA量，且只有人型、牛型结核菌和BCG有阳性扩增。国内吴雪琼、程绍基等采用与Hermans 同样的引物进行研究，结果基本一致。Pierre采用再次扩增法对结核杆菌65kDα蛋白抗原基本进行扩增，提高了检测的敏感性，用于检测临床标本和痰液、支气管灌洗液、胸腔积液等，可以有效地防止这些标本中的物质对Taq聚合酶的抑制作用，从而使临床标本中结核杆菌的检出率大为提高。Ralphs建立的扩增结核杆菌1.5kb特异性片段的PCR方法，可以特异性地将结核杆菌与其它分支杆菌相区别。
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10 其它分支杆菌
Hartskeerl针对麻风杆菌36KDα蛋白抗原基困，建立了扩增530bp特异保守序列的PCR方法，用于检测感染动物组织标本中的麻风杆菌，灵敏度达到20个细菌DNA，促进了麻风病的诊断和研究。
鸟结核杆菌的感染常常是AIDS的并发症，但它与结核杆菌感染症状相似，临床上难以正确诊断，且使用常规抗痨治疗效果很差，需要有早期特异的诊断。Jocken建立的PCR方法能够特异地从艾滋病人的周围血中检测出鸟结核菌，为正确的治疗提供了可靠依据。
11 军团菌
军团菌属于细胞内寄生菌，可引起人类典型肺炎和庞蒂亚克热，其临床症状不典型，体外培养的阳性率不高，易致误诊，病死率可达20%，目前它是国外院外感染的主要致病菌。Starnbach等对嗜肺军团菌DNA的一个种特异性片段两端进行序列分析，设计了一对引物进行PCR扩增，对于水环境中嗜肺军团菌可以进行特异性检测。Rej则对嗜肺军团菌mip基因的mRAN进行反转录PCR扩增，此方法可以发现尚有致病性但培养阳性的军团菌。
12 其它
对伤寒杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌的毒素基因、大肠杆菌及产毒大肠杆菌，幽门螺杆菌[19]，顽固梭状芽胞杆菌及其毒素基因，以及原虫、锥虫、利什曼原虫、血吸虫、放线菌C5的PCR检测方法也都有所报道。应用这些方法，不仅能有效地诊断病原菌的感染，而且对感染的病菌是否存在毒素产生基因也可作出诊断，这对于疾病的正确治疗、处理及流行病学的研究都有着重要意义。, 百拇医药