利用转基因动物开发药用蛋白的建议书
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利用转基因动物开发药用蛋白的建议书
利用转基因动物(也就是奶山羊的乳汁或猪的血液)生产药用蛋白是80年代末继细菌转化CHO cell转染之后兴起的一种更有效更具优势的重组蛋白生产技术。它与传统的微生物发酵或者哺乳动物细胞培养等生产工艺相比较具有翻译后加工和天然产物一致，生产量大，生产成本低等优点。据美国权威机构红十字会预测到2010年由转基因动物产品所构成的销售额至少350亿美圆。美国和英国以转基因动物开发的药物A-Ⅲ和α-AAT将于2000年提出新药申请进入市场。在欧美目前至少有120种以上的药物以转基因技术的形式开发。这一方向是基因工程的发展方向。
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我们在此领域已做了相当的基础工作所构建的hEPO和hGH乳腺特异性基因元件已经过转基因鼠确证。HSA和hHb(人血红蛋白)的构建工作绝大部分已经完成。现需要进一步制作生产型转基因动物羊和猪。此项工作开发约需500万元花3-5年的时间即可完成生产型转基因动物猪和羊的制作。每种有效表达的转基因动物羊和猪价值至少亿元以上。
转基因动物的制作无论是在企业寻求资产经营，新的市场扩张和技术创新，还是为我国人民制造更为安全的药物方面均有着巨大的经济利益和社会效益。
一导言
转基因一词的概念，是80年代由美国一位科学家提出的，它是指遗传物质在生殖细胞的跨物种转移。转基因动物就是(所有组织细胞)携带有外源基因的动物，而上述这些外源的遗传物质(Gene)可以由亲代向子代传递，并遵守Mederl定律。它是通过人为的，而非传统的杂交技术所能实现的。通过遗传物质的转移，使得生物体机能能够一定程度上按人们的意愿表现某些性状。
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1980年J.W.Gordon 通过将外源基因注入小鼠受精卵，发现外源基因可以整合到小鼠基因组中，从而找到了实现高等动物遗传转化的方法。随后1982年Palmiter将大鼠的生长激素基因转移到小鼠，培养出体形比小鼠(正常)大的一倍的"超级鼠"，该结果登在NATURE封面上引起轰动。1985年英美科学家分别提到利用哺乳动物乳腺作为一种替代现有的哺乳动物细胞培养和细胞发酵的新方法生产蛋白类药物，1987年英国科学家率先以小鼠作为模型动物确证了治疗性蛋白α-AAT在乳腺系统中的特异性表达。1991年英国PPL公司实现了αAAT在绵羊乳腺中商业化表达，表达浓度高达37g/L ，同时美国科学家也实现了tPA在奶山羊中的商业化表达，表达浓度为10g/l，Protein C在猪乳腺中的商业化表达，至此人类治疗性蛋白在哺乳动物乳腺定位化表达已经无任何技术性障碍。在政策准入和质量管理标准方面，欧洲和美国在94年和95年分别颁布了针对医疗目的的制作转基因动物要点。从1996年开始美国和英国利用转基因动物生产药用蛋白进入临床试验阶段。其中英国PPL公司的α-AAT将按计划于2000年底完成临床试验。2001年开始商业化生产。美国Genzyme公司已于2000年3月完成临床期试验，将于2000年内进入市场。随着转基因动物所制造的药物进入市场的开始，一个崭新的基因工程制药技术时期也将正式来临。
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药物的发展经历了天然产物利用，化学合成和基因工程三个阶段，而人类认识自然生命的深度也分为：原核细胞(细菌)，真核细胞和高等生物个体水平三个层次。因此利用转基因动物个体水平制药是人类认识和发展的必然最高水平，利用转基因动物制药具有表达量高，生产成本低，与天然产物完全一致，分离纯化容易。尤其适合于一些使用量大，结构复杂的血液因子，如HSA，ProteinC, 纤维蛋白原(Fibrinogen)等。并具有优于这些血液制品不受来源限制，没有血液污染的优点。正是因为如此，自从80年代以来转基因动物成为生命科学中发展最快的领域之一。转基因动物这一技术除应用 于生产蛋白类药物，食品，医用材料之外，在应用领域其他方面也有着广泛的应用。
1.疾病的动物模型：用于研究，治疗疾病或者药物筛选，药物治疗，毒物测试。
2.提升传统生产业，如畜牧品种改良。
3.异种器官移植(以及相同技术核内的培养组织移植)
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4.改造小鼠免疫系统，生产人源化抗体。
二国内外的发展现状：
目前国外的转基因动物的研究与开发已经取得相当的成功，除绵羊，山羊和猪被成功的用作生物反应器外，还有牛和兔等动物，开展这一项目开发的国家有荷兰，瑞典，法国，西班牙，古巴，俄罗斯，以色列，日本，德国，芬兰，加拿大，澳大利亚，新西兰等国，据不完全统计，从事转基因药用蛋白的生产公司以近二十家，目前约120种以上的药用蛋白正在进行转基因动物生产的开发，技术水平已经达商业化生产要求的有约30种以上，正在进行临床试验的有约15-20种，在转基因动物制药领域中最引人注意的例子如下：
1. 英国PPL公司开发的主要开发产品有：
α-1-Antitrysin (2000年将完成期临床)
Factor IX
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Fibrinogen
多肽如降钙素 等15种以上产品
2. 美国Genzyme公司开发的主要开发产品有：
Antithrombin (以于2000年3月完成Ⅲ期临床)
BR-96-Antibody 等十几种抗体
HSA (人血白蛋白)
tPA 等
3. 荷兰的Genphrming 公司开发的主要产品有：
Lacterfferin
CI抑制因子
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人I型胶原蛋白
人纤维蛋白原
人因子8(Factor Ⅲ)
此外还有以色列的Dalcani研究所在奶山羊中表达了HSA，美国红十字公司在猪乳腺中成功表达了ProteinC，加拿大的Nexia公司利用奶山羊生产蛛丝，可用于航空，医疗，防弹衣等，美国的Abgenix和 Medarex公司利用小鼠生产人源化抗体治疗癌症和风湿性关节炎等，上述所提到的药物均已进入临床阶段。
国内最初在转基因技术方面的起步和国外是几乎同步的，例如有众所周知的"童鱼"，但因童第周先生注射的是RNA，没有可能发生重组现象，也显示不出太多的理论意义。国内科学工作者很早就注意到转基因动物技术广阔的技术前景。早在90年代初，中科院上海细胞所施履吉先生就提出生物反应器的设想，但是由于国内的经费的严重不足和体制上的一些局限，至今国内转基因动物生产化方面仍落后于国外，但总的说来，这方面的差距不是十分大。在转基因动物制作方面应该没有什么差距。比如据称上海医学遗传所曾溢滔院士研制了一条以整合胚移植为基础转基因山羊制作路线。并通过和复旦大学合作获得了乳汁中具有人凝血因子IX蛋白的转基因山羊，最近西北农业大学完成了体细胞克隆山羊的制作。随着国外转基因技术进入商业化的日益临近，国内的一些企业也纷纷进入此领域研制开发，已经公开的主要有以下几家：
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a)北京在促进国家高技术落户中关村合作协议共11项，其中两项和转基因动物有关，即包括863转基因动物基地和转基因实验基地。
b)深圳市政府组织绿鹏公司，南油集团和特区报社等单位委托北农大陈永福开发转基因牛，生产HSA。此外，深圳海王生物拟投资4800万建转基因动物生产研究所，主要由哈工大开发转基因鸡。
c)上海，上海儿童医院和浙江"超凡"公司共投资5000万开发转基因奶山羊。上海一家生产保龄球私人企业投资一个亿准备开发转基因奶山羊，具体的项目好象是人溶菌酶，人乳蛋白和人乳清蛋白等。上海复星公司，华东医药及另外一家公司准备联合开发转基因牛生产乳铁蛋白(Lacterferin)。
d)珠海丽珠和深圳某企业出资资助发育所开发的奶山羊表达EPO。
此外，沈阳三生也正在着于进行这一项目的准备工作。
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实事求是的讲，目前尚无充分的证据表明国内那家企业取得一定的成功，都尚处于开发阶段中。从国内各个单位所选的药用蛋白来看，基本上都是选择已经成熟有产品的药用蛋白如EPO，HSA等。目前尚未听说有开发类似国外的新品种，如药用单抗，抗HIV类蛋白等。
目前中国的国情，政府不会投资很多的钱完成这一项目，而且在现有的体制下，就是投了钱，效果也不会很好，对于这种资金小，风险大回报高的项目，适合以所有人和人格化色彩比较高的企业形式参与开发。从目前企业参与介入的时机来讲，现以有了多家民营企业如浙江超凡，绿鹏，中路，海王，锦绣大地，复星和华东制药等开始进行开发，因此不存在市场准入成本太高的问题。另一方面，我在这一领域已做7-8年的基础准备工作。因此，只要有适当资金投入，我们最终的结果绝对不会晚于别人，往往在每当出现新的技术进步和变革时，抓住这一时机是实现企业超常规发展的最佳时机。北大方正的王选教授讲曾经讲过："一个企业最可怕的是在技术上错过一个时代。"
转基因动物制作简框图(见下页)
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三. 转基因动物的 制作过程及所需条件
1. 转基因动物的 制作过程大致可划分为三个步骤,
A.重组元件的构建
此步骤是转基因动物制作的核心技术，构建的有效和合理与否至为重要和关键,它决定了表达的特异性和表达水平的高低.
此步骤就是将某一特异性组织(如乳腺,血液等)的调控区基因和目的基因(如EPO, GH, HSA, Hb等)的结构基因按照正确的读码框架拼接.HSA和Hb项目此步骤已经接近完成,调节基因已准备好.
B. 小鼠的模型确证:
利用小鼠这一简单的实验动物验证所构建基因元件的正确性这一过程约需半年.hEPO和hGH项目已完成此项工作,直接制作大动物即可.
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C. 经过验证正确的基因元件,制作生产用转基因动物(牛,羊,猪等)
从技术手段上讲转基因动物目前的实际制作方法有三种可供选择:
a)逆转录病毒转染
b)ES细胞转染
c)受精卵的显微注射
对于我们的制作只能采用显微注射的方法
取经过激素超排处理过的动物的受精卵,用显微操作仪注射100-200个copy的重组基因原件进入受精卵的雄性原核.随即将注射过的受精卵移入经同步处理的假孕母畜的子宫或输卵管内,在一般情况下经过注射过的受精卵约有60-80%的成活率,经移植后的受精卵的受孕率约25-50%,而所出生的动物中整合外源基因的约占10-30%(小鼠) ,8-10% (羊).在这些整合有外源基因的阳性动物中有一定比例的高表达动物(这一比例越为1/20).总体情况可见下页所画简图.
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2. 转基因动物制作工作所需设备,条件,场地和人员
a.基因工程实验室
用于完成重组基因元件的构建,分离,纯化和阳性动物的筛选,检测.所需面积约15M2,所需仪器设备有:
超净工作台 冰箱 天平 紫外检测仪 高速离心机(台式) 电泳仪 PH计
紫外分光光度计 培养箱 水浴箱 摇床 PCR仪
等共计约需仪器费用20万人民币
b.清洁动物房9-12M2饲养小鼠(仅用半年左右可租借)
c.显微注射室约15M2,需装修,装紫外灯
, 百拇医药 显微注射仪器有
倒置显微镜 $15000 拉针仪 $3800
显微操作Leica $18000 煅针仪 $3500
CO2培养箱 $3600 注射仪 $ 4500
共计约需仪器费用$ 45000(不考虑打折因素)
d.大动物外科手术室：
约需20M2 1-2张台子，一些手术器械即可
e. 需要租借一个约15亩大能饲养500头羊和100-200头猪的农场，条件除要求干燥不潮湿，距离公路大于1000米，有水，有电外无特殊要求。
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3. 制作转基因动物所需要人员的专业领域要求及拟成立的项目组成员：
制作转基因动物所需要下述三种专业技术领域的专门技术人员专门协同完成：
a)基因重组技术：负责所转移重组原件的克隆，构建，纯化及所制作转基因动物的筛选，检测，鉴定。
b)显微操作技术：负责手术取卵和卵子的显微注射。
c)动物繁殖技术领域：负责动物超排取卵同步发情和胚胎移植
我们拟成立的项目组成员是：中科院上海细胞所周筱刚和徐国江负责显微注射和手术取卵工作。上海细胞所是国内开展转基因动物技术方面较早的单位，国内目前许多从事此领域工作的人曾在细胞所学习。徐国江老师和周筱刚老师在显微注射技术操作方面有着丰富的经验和扎实的理论基础。我和他们合作。完成了转基因小鼠制作。奶山羊(猪)的超数排卵和胚胎移植工作是西北农业大学的窦忠英先生，窦先生许多年一直从事此领域的的工作。至于开发转基因动物制药技术的核心技术，重组原件的构建，在这方面我已有7年的工作基础，已完成奶山羊乳蛋白调节基因的分离，克隆，分析，测序，并完成猪血液特异性调节蛋白基因的分离，克隆，分析，测序，优化；同时分离克隆了消除位置效应的元件，重组了药物目的基因hEPO,hGH和调节基因。如此大量细致的基础工作，国内没有其他实验室开展过，而且我们所构建的基因原件已经经过了小鼠模型的验证。
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在决定参与投资和合作的个人和单位有：
1.我的一个同学决定以我个人名义投资50-100万
2.我所在的泽生公司将投资100-200万
3.中科院上海细胞生物研究所郭礼和先生也表示了投资参与开发的意向
4.中科院生物工程中心也会以实物投资形式参与开发
5.中科院院士刘新垣先生愿意担任所成立公司的顾问或直接出面组织此事
所以综合我们团队的全部优势，一旦开发资金到位，并且理顺体制方面的关系，采取一种能适应高科技开发的管理机制，我们开发的结果和速度在国内绝对不会落后于人的。目前国内虽然已有多家企业开始介入转基因动物制药的开发，然而在此领域介入的强度和深度还远远不够，并且刚刚起步，另一方面，因转基因动物仅仅是一种生产手段和技术，原则上可以生产所有蛋白类药物，因此，只要所开发的药物互不相同，其他企业和我们开发就互不冲突。另外象HSA和血红蛋白类代用品这种市场容量相当大的药品也需要多家生产企业开发才能满足市场需求。
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4. 本项目种子期的完成约需要3-5年共计需要经费500万元人民币(不含场地和实验室)
其中仪器设备费 ：80万
试剂费 40万
动物饲养费 250万
人工及办公费 130万
5.本项目的产业计划和融资方式如下表：
阶段(Ⅰ)创业(或种子)期(Ⅱ)创立期(Ⅲ)成熟(或成长)期
任务指标完成有意义的转基因动物纯化工艺建立临床研究新药报批生产基地建立，市场营销，开发
所需资金500万3－4千万>4610万港元(按香港创业板)
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可供选择投资工具合作伙伴新股，风险投资，公司债券上市或被上市公司收购
期限3－4年2年1－2年
本阶段收入方式接受委托开发或合同研究技术或药证转让药品市场开发或销售
赢利大概能力20－100万/年千万级/年>亿元/年
关于第一阶段收入方式的说明：我已和养生堂徐乃正老师达成协议，在公司建立和正常运转之后，有偿为养生堂进行委托开发(制作模型)和合同研究(为九源生物有限公司建立某种抗体的奶山羊乳腺表达系统)。
我们希望能够找到兼顾专业发展潜力及方向和商业赢利双重要求的合适的进入这一行业切入点。但我现在仍然感到公司初期在短平快，能迎合投资者迅速有所回报方面是欠缺的。
四所拟开发项目的简单评价
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为了开发转基因动物制药这一技术,我们选择了具有不同特点的但市场较为成熟的下列四种产品作为先导产品进行开发:
序号 所拟开发的项目 所需达到的指标
1 转基因奶山羊乳腺特异性表达人红细胞生成素(hEPO) >200mg/L
2转基因奶山羊乳腺特异性表达人生长激素(hGH) >200mg/L
3转基因奶山羊乳腺特异性表达人血白蛋白(HSA) >2g/L
4转基因奶山羊乳腺特异性表达人血红蛋白(human Hemoglobin) >15g/L
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此外在技术领域的拓展上我们将着手：人源化抗体转基因小鼠(泽生公司要求做)和即将完成的抗体通用表达载体，准备用于在奶山羊的乳腺中生产治疗性抗体。
1. EPO：
EPO是由有肾脏合成的一种糖蛋白，作用是刺激人血红细胞的成熟，在临床上用于治疗由于肾衰，放疗，化疗，风湿性关节炎和慢性疾病引起的贫血。EPO在国外自从1989年被美国FDA批准上市以来随着适应症的推广，销售额逐年上升，多年来一直名列生物技术类药物榜首。1998年全球销售额约25亿美元。目前国内的EPO生产，全部为CHO细胞培养技术，只有6家单位得到生产许可，3家获得新药证书。另有几家单位获准进行临床试验，将来最终会有十几家单位获得生产许可，年生产能力将达到500万支，而国内去年(1998年)实际销售量约100万支(约4-5亿RMB)但据医药界人士称，中国每年仅肾衰病人就有50万之多，但其中仅2万病人得到治疗，所以中国实际EPO年需求量为1500-2000万支，然而，市场销量的如何扩大，将受许多种因素，社会经济发展水平，人们认识水平，医疗体制，医疗保险机制和药价水平(现在国内销售价高于国外一倍，EPO在美国$18，在中国国内为325RMB)等多种因素影响。现在CHO培养生产EPO已经不能继续申报，而转基因动物生产做为生产工艺重大改进仍然可以进入这一市场分一杯羹。而转基因动物和CHO相比较就是生产生产成本大大降低，更有利于价格竞争。
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2.人生长激素
在临床上用于治疗侏儒和老年人，更年期妇女的骨质疏松症。与EPO相似，该产品在国外也是相当成功的基因产品之一，1996年在美国销售额达6亿美圆，1997年仅Gentech和 Lili就达4.8亿美圆。目前国内开发或生产该产品的单位有：上海联合赛尔，上海海济(上诉两单位技术均源于上海细胞所)，安徽安科和长春金赛公司。年销售额不详。
3.HSA人血白蛋白
HSA是存在于血液中的非糖基化蛋白，MW65000，血液中浓度为42g/L,它的功能是维持血液通透性(bloodstream osmolarity)，调节血压以及转运脂肪和氨基酸。它在临床上是使用量较大的一个药品，广泛用于外科手术，创伤性失血，水肿和低蛋白等症用于增加血容量同时也被用作基因工程药品的保护剂，我国目前人血白蛋白每年消耗40-50吨，HSA连续五年一直处于国内大中城市医院药品销售额前3位。98年国内销售额为30多亿(这一数据中国药房等杂志均有报道)，单价约3.56$/g。但是目前我国HSA的消费远远低于WHO所规定的0.2-0.5克/人年 的指导标准，目前国内所销售的HAS均为血液制品，来于国内30多家血液制品厂和部分进口，国内血液制品厂最大也不超过市场份额的5%。基因工程产品与传统的血液制品相比较其优点在于 1。没有污染，如肝炎，HIV等病毒 2。来源不受限制，从生产成本方面考虑酵母生产高于血液的低温乙醇法，而转基因动物生产HAS生产成本远远低于从人血中纯化的HSA。最近日本Yoshitami(原绿十字)建立了年生产350万支12g/支的HSA酵母生产线，首期工程100万支商品"Alberc"2000年上市，据说酵母生产纯化要求三个一米的pharmacia的柱，多根1.6米chromaflow,纯度要求达到99.999999%,仅设备投资就达一亿美圆。
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国内华北制药联合军事医学科学院，上海海济，上海医药集团公司，通化金马，和山东格兰百克等单位也在开发Yeast生产HSA此项开发关键在于中试放大和设备投资。这也就是为什么Genetech公司早在1981年就取得HSA在Yeast中表达的专利，而现在仍未开发，日本率先投资重组HAS是因为日本发酵工业实力最为发达和日本财团实力最为雄厚。
国外以色列，美国PPL和美国Genzyme等公司均在开发转基因动物生产HSA这一项技术，其中以色列几年前就完成了转基因奶山羊的制作平均水平为(10g/L奶)。国内北农大(陈永福)和上海儿童医院(曾溢滔)也在开发转基因牛表达HSA。
4人血红蛋白：
利用血红蛋白开发血液代用品，目前尚未成为商品，美国有四家公司利用牛血，过期人血和E.Coli表达的人血红蛋白开发此类产品，目前正处于临床Ⅱ期或Ⅲ期，其中E.Coli表达的重组蛋白处于临床Ⅲ期而结果令人满意。另一方面，美国Prinston大学和DNX公司联合制作的血液系统表达人血红蛋白的转基因猪早已完成实验室工作。国内目前尚未听说那家单位开发此项目。血红蛋白作为血液代用品，其国内的市场销售额被预计高于70亿。98年北京的医疗用血为70吨，上海为80吨，血红蛋白类血液代用品和传统的输血相比较有如下优点：1。没有污染，可以避免传统输血中所造成的乙，丙肝，梅毒，AIDS，等疾病的传播，我国每年约10万人因输血传播丙肝(丙肝有10%的漏检率)。2。无需配型 3。保存期长 4。无需冷藏 。国外关于血液代用品共有两种开发方向，一是"蓝血"，属于氟化物，俄罗斯早期科学家致力于此，优点是不易造成血管堵塞，但成本高于每单位500美圆。另一方面是欧美科学家所致力的基于血红蛋白的"红血"，它优于"蓝血"之处在于它是生化品具有"蓝血"这种化学品所不具有的载氧协同效应。现在世界上开发血液代用品共有9种类型，其中7种是基于血红蛋白的。在美国，一单位血约卖$50,而DNX Henoglobin准备销$250。
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五项目进展和实际情况预计安排：
本项目暂不以项目报批成功，而以获得有生产意义的转基因动物(EPO和GH分别>200mg/L, HSA>2g/L, Hb>15g/L)繁殖若干代，纯化方法初步建立定为本项目第Ⅰ期融资目标的完成，预计约3-5年。
1起点
a.hEPO和hGH已完成基因构建，并且经小鼠模型确证正确，直接制作转基因山羊即可。
b.HSA和Hb所需调节基因已经分离，克隆，优化。
2具体任务
a.制作hEPO和hGH转基因山羊，繁殖若干代，制作群体，建立纯化方法。
b.拼接HSA和Hb重组元件，利用小鼠模型确证。
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c.制作HSA和Hb生产型动物，繁殖1-2代，扩大群体，建立纯化方法。
3实际进展的计划安排以及完成指标考评
第一年度：
上半年：实验室建设，装修，仪器订购，安装，调试
实验牧场的建立
人员适应性训练
羊种的引进，以及引进标准的细化
下半年：EPO，GH转基因奶山羊的制作的开始
a.超排方法的建立 超排卵数：平均每只供体羊应当可获得供注射卵7-8枚
b.受精卵的成活率 注射存活率：应当稳定在70-80%
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c.受孕率 受孕率：应达到30-50%
HSA和Hb完成基因构建工作。 酶切物理图谱和关键部位序列与预计结果及GENEBANK资料一致。
第二年度：
上半年：
a.继续制作转基因山羊，并着手准备筛选阳性动物 阳性率应在5-8%。
b.制作转基因小鼠验证所构建的HSA和Hb重组原件，所制作的转基因小鼠应该得到预期正确的结果。表达专一，稳定，阳性鼠健康，传代稳定。
c.建设一个能饲养200头猪的牧场。
下半年：
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b.开始准备检测阳性山羊的表达
第三，四年度
同第二年度下半年一样，继续制作转基因猪和羊，并且继续筛选和检测。
第五年度：
转基因猪，羊的筛选，检测，纯化方法的建立。
结果验收，新药报批材料准备，股份公司筹备。
第一轮风险投资退出，第二期融资开始。
4转基因动物制作过程简述：
a.基因原件的小鼠验证
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所构建的重组基因元件，虽然已经在分子水平，经电泳酶切，PCR扩增，序列测定等多种手段多次验证，但是仍然需要在小鼠这一易操作，周期短，成本低的试验动物体内观察所构建的元件在个体水平上能否正确表达目的蛋白，表达是否在专一性组织上，对该生物体是否会有病理性影响，能否稳定遗传并在子代中表达。
制作转基因小鼠验证二个基因元件预计约需DBA和C57杂交F1代供体小鼠200只，ICR受体鼠100只，公鼠20-40只(另外供体鼠的饲养状况对供卵数影响较大)，约需6个月即可得到结果。
小鼠怀孕期21天，性成熟期五周，这样一个周期(即从受精卵到G0代产仔泌乳)约3个月)根据劳动强度和所需时间安排为每周做二次，每只10只供体鼠，2.5个月即可完成200只供体鼠。
0.5个月 开始做 1 2 3 4 5 6 月
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约需0.5个月做预实验 开始有小鼠出生 开始可以剪尾巴筛选 开始可以检测 检测工作结束
(同时停止注射)
预实验的主要内容就是试剂和培养液的配制，要求受精卵放入培养基中在CO2培养箱370C培养能继续正常分裂，所配制的试剂必须达到注射受精卵后，受精卵不死，否则重新配制。
6.制作转基因小鼠的具体时间安排：
第一组 小鼠(AM11：00， PMSG)超排
周六
48hr 周日
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AM11：00 HCG 合笼交配 第二组小鼠 (AM11：00， PMSG)
超排
周一
AM8:00取卵注射移植 19hr
周二
第二组HCG 合笼交配
周 三
周 四
取卵注射移植
周 五(继续重复)
小鼠模型意义的评估：：
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小鼠模型对于基因元件在大动物个体中的表现在正确性方面有意义，而对有效性上没有多少相关，也就是小鼠的实验结果只能对基因元件在大动物体能否正确,正常的表达，该元件对生物体是否有病理性影响，能否稳定遗传给一个说明，但是这个说明无法预见，该基因元件在大动物体内表达水平的高低，比如用奶山羊的调节基因元件在小鼠中验证表达水平不高，并不等于在奶山羊中仍然不高，反过来如果使用小鼠的调节元件在小鼠中表达量高，而在山羊中也不一定高。
6. 转基因山羊是制作：
为了适应生产，经小鼠验证能正确表达的基因元件，可进一步制作具有生产价值和意义的大动物，综合考虑生产性能，制作成本和制作周期，转基因奶山羊和转基因猪比较适合。转基因奶山羊制作与转基因小鼠制作基本相似，只是同步发情和显微注射(由于核看不清楚)更难，而且其排卵时间长，发育时相不一致，可供注射的卵数少。所要求的实验条件要求为1500M2羊舍和一间约20M2的外科手术室。此外山羊每年仅5月和11月两个繁殖期(浙江地区)。所以每年可用来操作的时间3-4个月。暂时预定每两个星期做3次，，每次8-10只羊(不排除熟练后重新调整的可能)，总共每季节约75-90只供体羊，还需受体羊100只，公羊3-7只
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每个季节(1.5个月)所操作受体数 75-90只
超排所得卵数 750-1200
可供注射数 300-500
存活数 200-300
所需受体数 100只
山羊胚胎受孕率约30-50%
制作2-3个基因元件的转基因动物至少需要操作8个季节注射约6000枚受精卵才能得到结果，从开始操作第一个月算起，第三个月就能看到怀孕，第五个月生羊羔，第六个月可以筛选阳性动物，十八个月后才能检测乳腺的表达结果。
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奶山羊超排卵数约10枚卵，可供注射的50-60%，注射后存活率约70%，出生率约30-40%，所生动物阳性率~5%。在阳性动物中因位置效应每20头中才有一头表达量高的，故制作3个基因元件的转基因奶山羊约需1000-1500头山羊。另我虽有可以消除位置效应的基因元件，但因没有任何大动物使用结果的科学论文，只能试试看。如有效，可节约动物成本1/3左右。
7转基因猪的制作：
相似于奶山羊，但由于猪的自然繁殖期不明显，又是多胎动物，故制作上比奶山羊容易，仅显微注射略难一些。猪舍只需200头规模就行。此处省略不写。
六. 转基因动物个体表达系统的优势和效益分析
医药行业是永远的朝阳产业，许多专家和业内人士也预言，随着传统的化学药品的增长的放慢，天然药品和基因工程药品迅速增长，将来必然是天然药品，生物药品和化学药品三分天下，在医药市场的总量方面，目前我国人均药品消费量偏低(1997年城市人均175元，农村人均25元)这一数值远远低于欧美发达国家的标准(160-300美圆)，因此市场潜力是巨大的。随着经济水平的增长，生物技术药品的增长保持了高过20%较快的增长速度。2000年将达到72亿人民币产值，其中进口药品(生物技术类)自从1996年以来保持逐年下降的趋势，从1996年的60%(1.9亿美圆)下降到1998年的40%(1.6亿美圆)。转基因动物个体表达系统本身固有优于细菌和培养细胞，生产加工能力强(如可生产结构复杂的FⅨ六亚基的Fibrinogen),产量高(每升可达几十克)，管理生产容易，成本低和传代稳定不容易变异等优点。一些现在正在临床应用的药物(如HSA，tPA)现有的细菌或者培养细胞技术无法满足人们的需要，如E.Coli的后加工问题，CHO的生产成本和产量限制。随着人类基因组项目的开展，这一需求将更加明显。据美国权威机构红十字和遗传学会，到2005年转基因动物所生产的药品将达到350亿美圆的销售额，到2010年转基因动物所生产的药物将达到整个基因工程药物的90%以上。就我们所开发的项目的国内情况来看，2007年前后EPO，GH，HSA，和血红蛋白其市场销售额最保守估计也在150亿以上。另一方面，从社会效益角度讲，缓解我国医疗用血紧张的现状，避免患者在输血和使用血制品感染AIDS和肝炎等病毒性疾病的危险。；另外。在我们此项开发完成之后，可如法炮制开发其他类蛋白药物。
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国外的专业文献中有众多不同来源的资料具体的分析比较微生物，哺乳动物细胞培养和转基因动物系统。本项目建议书引用其中之二：(见表Ⅰ和表Ⅱ，见下页)
也可以简单的比较血源HSA和转基因HSA的原料成本：
如每年生产HSA10吨(价值约3亿)，则需血浆400吨，如每吨血浆40万元人民币，则原料费为1.6亿。
如用奶山羊的表达浓度为2g/L(国际上为10g/L的表达水平)，莎能奶山羊的年产奶量 为800-1000kg，暂定生产提纯效率为80%，则每年生产10吨HSA约需6500头山羊，假如每只山羊的每天的饲养管理费高估为10元人民币，则原料成本为2373万元。
至于日本绿十字的Yeast生产系统，我们知道它们通过扩大生产规模，优化工艺，可使Yeast的生产成本不至于太高于血源HSA生产成本。
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表Ⅰ(表中乳腺系统按100头牛计算)
CHO E.Coli Milk
表达浓度mg/L 33.5 460 100
资本投入(百万) $61m $389m $3.3m
年均花费(百万) $117m $242.3m $0.51m
年生产量(kg) 11.4 11.6 51
每克花费 $10,207 $20,192 $10
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(此表引自Theriogenology 45,P51-56 1996)
表Ⅱ 基因工程药物生产三种形式的比较
细菌 CHO 转基因动物
重组原件构建 简单 较简单 复杂
转化 简单 较复杂 难，低效
筛选 简单(1-2天) 复杂(含加压) 复杂
制作成本 低 高 极高
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制作周期 1-2周 1-2年 5-7年
产物后加工 无 有 有
表达产量 100-200mg/L 10-20mg/L >1g/L
生产成本 较低 高 低
纯化成本 高 较高 低
投 生产设施 $25millio $3million
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资 纯化设备 $25million $5million
生产花费(每升培养基) $20-50 $ 2
典型表达水平 250mg/L 1g/L
每克花费 $80-200 $1
(此表综合PPL公司和GENZYME公司资料)
七. 风险分析及防范对策
目前，转基因动物这项技术从技术路线，商业市场准入政策和实用性方面均是无障碍的，而上市潜力巨大，前景异常广阔。
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在此领域中国和国外的差距并不象其他行业中那么巨大。转基因动物的历史也不超过十年。而且中国在实验动物方面也不受限制，较为方便，也没有宗教方面的抵制的影响，但是中国也有投入偏低，从体制上并不激励科研人员从事一些周期较长的开发和研究，在社会文化的影响也好，或经济水平制约也好，中国多数企业较为急功近利。
虽然这一开发工作谈不上什么创造，但是也决不是简单的组织生产。再一点，因为是在有限的经费和有限的时间进行开发，制作出有表达的转基因动物毫无问题。但是有生产意义的高表达将涉及到概率，制作的效率，也涉及到人员之间，人与动物之间的协调配合，最终获得有生产价值的转基因动物的概率，由下述因素决定：每只供体动物所获得的卵数，所得卵的可注射率，存活率，整合率，受孕率，产生率和表达率。故此为留有余地，我们将完成任务的时间预计为3-5年。
由于是开发工作，所以要求必须有生产价值的有效表达，但由于具体涉及到每一种蛋白的特性，所以不能保证每一种蛋白药都能如期达到预计的开发水平。但是由于涉及到了不同类型的蛋白，应该肯定有一种能预期成功。另外，该投资的成功与否，也并非绝对单纯取决于该项工作能否达到预计的表达水平，也取决于该次工作国内其它单位的开发水平和市场对其的需求程度。其实也等于一种社会对开发潜力是否认可和"供求关系"的问题。
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当我们面对国内其它企业的开发，尽量在所开发产品上有所区别，我们在上游构建花了相当的时间因此与别人相比不会有一个本质的晚，再一点，从战略角度讲，国内也不可能独此一家，如果做为第一家也有一个进入成本的因素，最好能做第二，或第三家，把财力和精力花在后续产品或市场营销上。
任何技术开发都存在着所谓的"技术路径"的因素，所以未来技术的发展和进步是值得时刻关注的，诸如ES细胞和克隆的效率。从科研开发角度讲我们希望投资方配合逐渐实行员工持股是管理方式，在组织科研人员实施开发方面，我们已经有过相互合作配合顺利完成hEPO和hGH转基因小鼠的经验。
在我们与企业家接触过程中，一些希望投资的企业家表示他们并不明白风险在什么地方，感觉到对这类事没有任何把握。
事实上，正如本项建议书所提到的那样，对于每一个具体的项目或指标都存在着一个在特定的时间内或者有限的经费的情况下必须高效低成本在企业家还有耐心的情况下，得到高表达个体这种七分靠运气完成开发的概率风险。
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然对于投资转基因动物制药这一项目本身并不存在绝对失败这样的风险，也就是说根本不存在500万给你，5年过去，什么也做不出来，投资打了水漂的问题，因为我构建的原件是经小鼠验证的，必然在2-3年内能够得到特异性表达的转基因奶山羊个体，这是科学规律的必然。
退一万步讲，假如由于种种原因，五年过后，每一个具体的项目都没有达到本项目建议书所定的指标，但这并不等于说我们没有熟练掌握转基因动物制作工艺，并不妨碍我们利用自身优势开展对外合作研究，我们也可以寻求重组元件的更有效的构建。另一方面，一旦乳汁中表达目的蛋白的表达浓度达到可以纯化的水平，即使是距离生产意义有一定的距离，也可以率先申报新药证，申请临床试验。
所有这些无形资产方面的意义和价值都由当时我们所具有的水平和但是国内其他企业所具有的水平来决定。
从投资的回收方式来讲，不外于：
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1创业板上市
2成立公司后，公司贷款分期回购
3整合出售给其他上市公司
一分子水平(基因元件构建)
人 生产动物如猪，羊
分离药用蛋白基因 (如HSA，Hb)并 分离特异性组织(如乳腺，血)
改造 调节基因. 如不适合改造
按正确的读码框架拼接为杂合分子
重组基因分离纯化
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显微注射单细胞受精卵. 雄性原核
二个体水平
供体动物经激素超排
处理，并交配
取受精卵 受体动物经同步发情与阉割过的雄性动物交配
制作假孕
成活率60-80%
胚胎移植
移入代理母动物输卵管或子宫
受孕率25-50%
所出生的动物满月后经分子生物学法如PCR，同位素杂交进行筛选阳性率
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(也是整合率)约(10-30%)
蛋白质方法检测
高表达水平动物(约占1/20)
完成制作转基因动物后
的工作本建议书不做讨论
建立纯系种群
纯化方法建立，临床，药证申请等工作
转基因动物制作的简框 附件
一动物制药的GMP问题
制药业的生产管理是全过程的，生产动物的管理也必将包括在其内，目前国外已建立详细的管理规范，要求略有不同于食品生产大型牧场，但要求物理隔离，生殖隔离和生物安全隔离，并没有要求specific pathogen free
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eg. PPL公司生产动物管理要点如下叙述：
1.sourced from New. Zealand (scrapic free)
2.strict quarantine on facilities with no adjacent stock farm and natural boundary
3.monitored for unusual events by trained & experienced staff
4.feeds free from mammalian derived products
5.allowed access to natural gracing
, 百拇医药 6.nutritional practices are in line with those used in high-quality dairy flocks
7.milking performed on clinically health animals by health operators using automatic milking equipment similar to that employed in bovine dairy industry (一个挤奶机可供2000头羊用)
8.various checks are put in place to prevent animals on medication entering the milking parlour
9.natural variation in volume and expression level of individual animals is minimized by blending milk from multiple animals
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(PPL做过两个说明安全性的试验：①感染羊"用不同水平的病毒"但奶中病毒水平"异乎寻常的"低，②加入病毒于加工过程，终产品中没有。说明加工过程安全可靠)
引自PPL. Address safety issues arising from the products of therapeutic agents in transgenic milk .1996 Developments in Biological standards 88/269-276
二动物制药的药证许可证问题：
目前中国尚未真正面对过这一问题，但是中国生化制药已多年。例如凝血酶就是从猪血中提取的。美国和欧洲早在94年和95年就颁布了针对转基因动物制药的Guideline。美国Genezyme公司的AntithrombinⅢ和英国PPL公司的α－AAT已经完成Ⅲ期临床。于2000年提出新药申请。所以转基因动物制药将来在中国必将获得通过。其次，游戏规则是由最早参与游戏的人制订的，现在国内已有多家企业参与转基因动物制药的开发，到时船到桥头自然直，决不能等有了规则之后在去开发。
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a.Dec.1994 欧洲完成文件points to consider.
b.Food & Drug Adminstation Docket No 95D-0131
c.1996年进入临床Jan .2000年positiveⅢ data for antithrombin Ⅲwere presented at chase H & G conference .年底申请BLA
三关于来源乳汁治疗性蛋白药物的纯化问题
截止现在我没有做任何有关纯化方面的工作，我始终坚持这样的观点，只要"奶里面有"而且量足够大，就总归能够有效的纯化出来，这决不会成为不可解决的障碍，而且一般来说，生产成本和效率起初并不被视为进入市场的障碍。只有经过一段时间之后，市场力量(如竞争性，总需要量)会对药物生产效益有所要求。因此现在过多的要求解决纯化问题，影响主要和关键问题的解决。
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但是在我与企业的接触中此问题被企业做为关心的重点
1.我所看到的所有资料(均为权威杂志而非新闻)都将纯化容易，纯化成本低作为转基因动物生产形式的优点之一，纯化容易的理由是a.乳成分简单，乳蛋白90%为酪蛋白，β－乳球蛋白，和α－乳清蛋白b.乳成分无毒无害，人体对之的相容程度高c.表达浓度高。
其中纯化设备投资与CHO比较为1/5－1/10，纯化成本一般为CHO细胞培养物的纯化成本的几十分之一和十几分之一之间。我无法看到国外公司详细的纯化工艺过程，但从其简单的介绍大致可以了解到一般大致为：
除脂肪/酪蛋白 乳清 色谱层析 等约4－5步
(通过)PH4.6酸性沉淀 (直接进入高效分离纯化，无需富集)
或15%PEG
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或离心
其回收率约为60-80%。纯度为98%
2.我在建议书中举了"绿十字"HSA的例子给我添了不少麻烦去解释
据我所知，无论是中国的先称为药审中心，还是美国的FDA都没有对哪种药品的纯化做过具体的要求。现在市场上的HSA大都是低温乙醇法生产的，其纯化纯度也就95%，也没有听说有谁吃了发烧之类的质量方面的事。也就是一些AIDS，HBV，HCV感染等安全方面的官司而已。国外正在用转基因动物开发的药品α－AAT和AT-Ⅲ其药剂量也很大,多为5－10g的剂量，而起纯度也仅为98%。所以说"绿十字"的HAS纯度为8个9，并非这一种药品的要求，而仅是由其采用的表达系统及HAS剂量所决定的，这种现象所的出的结论只能是利用酵母这种做生物表达系统生产HAS纯化比较麻烦。, 百拇医药
电话：(021)64126606(H)64700890-346(O)
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利用转基因动物开发药用蛋白的建议书
利用转基因动物(也就是奶山羊的乳汁或猪的血液)生产药用蛋白是80年代末继细菌转化CHO cell转染之后兴起的一种更有效更具优势的重组蛋白生产技术。它与传统的微生物发酵或者哺乳动物细胞培养等生产工艺相比较具有翻译后加工和天然产物一致，生产量大，生产成本低等优点。据美国权威机构红十字会预测到2010年由转基因动物产品所构成的销售额至少350亿美圆。美国和英国以转基因动物开发的药物A-Ⅲ和α-AAT将于2000年提出新药申请进入市场。在欧美目前至少有120种以上的药物以转基因技术的形式开发。这一方向是基因工程的发展方向。
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我们在此领域已做了相当的基础工作所构建的hEPO和hGH乳腺特异性基因元件已经过转基因鼠确证。HSA和hHb(人血红蛋白)的构建工作绝大部分已经完成。现需要进一步制作生产型转基因动物羊和猪。此项工作开发约需500万元花3-5年的时间即可完成生产型转基因动物猪和羊的制作。每种有效表达的转基因动物羊和猪价值至少亿元以上。
转基因动物的制作无论是在企业寻求资产经营，新的市场扩张和技术创新，还是为我国人民制造更为安全的药物方面均有着巨大的经济利益和社会效益。
一导言
转基因一词的概念，是80年代由美国一位科学家提出的，它是指遗传物质在生殖细胞的跨物种转移。转基因动物就是(所有组织细胞)携带有外源基因的动物，而上述这些外源的遗传物质(Gene)可以由亲代向子代传递，并遵守Mederl定律。它是通过人为的，而非传统的杂交技术所能实现的。通过遗传物质的转移，使得生物体机能能够一定程度上按人们的意愿表现某些性状。
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1980年J.W.Gordon 通过将外源基因注入小鼠受精卵，发现外源基因可以整合到小鼠基因组中，从而找到了实现高等动物遗传转化的方法。随后1982年Palmiter将大鼠的生长激素基因转移到小鼠，培养出体形比小鼠(正常)大的一倍的"超级鼠"，该结果登在NATURE封面上引起轰动。1985年英美科学家分别提到利用哺乳动物乳腺作为一种替代现有的哺乳动物细胞培养和细胞发酵的新方法生产蛋白类药物，1987年英国科学家率先以小鼠作为模型动物确证了治疗性蛋白α-AAT在乳腺系统中的特异性表达。1991年英国PPL公司实现了αAAT在绵羊乳腺中商业化表达，表达浓度高达37g/L ，同时美国科学家也实现了tPA在奶山羊中的商业化表达，表达浓度为10g/l，Protein C在猪乳腺中的商业化表达，至此人类治疗性蛋白在哺乳动物乳腺定位化表达已经无任何技术性障碍。在政策准入和质量管理标准方面，欧洲和美国在94年和95年分别颁布了针对医疗目的的制作转基因动物要点。从1996年开始美国和英国利用转基因动物生产药用蛋白进入临床试验阶段。其中英国PPL公司的α-AAT将按计划于2000年底完成临床试验。2001年开始商业化生产。美国Genzyme公司已于2000年3月完成临床期试验，将于2000年内进入市场。随着转基因动物所制造的药物进入市场的开始，一个崭新的基因工程制药技术时期也将正式来临。
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药物的发展经历了天然产物利用，化学合成和基因工程三个阶段，而人类认识自然生命的深度也分为：原核细胞(细菌)，真核细胞和高等生物个体水平三个层次。因此利用转基因动物个体水平制药是人类认识和发展的必然最高水平，利用转基因动物制药具有表达量高，生产成本低，与天然产物完全一致，分离纯化容易。尤其适合于一些使用量大，结构复杂的血液因子，如HSA，ProteinC, 纤维蛋白原(Fibrinogen)等。并具有优于这些血液制品不受来源限制，没有血液污染的优点。正是因为如此，自从80年代以来转基因动物成为生命科学中发展最快的领域之一。转基因动物这一技术除应用 于生产蛋白类药物，食品，医用材料之外，在应用领域其他方面也有着广泛的应用。
1.疾病的动物模型：用于研究，治疗疾病或者药物筛选，药物治疗，毒物测试。
2.提升传统生产业，如畜牧品种改良。
3.异种器官移植(以及相同技术核内的培养组织移植)
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4.改造小鼠免疫系统，生产人源化抗体。
二国内外的发展现状：
目前国外的转基因动物的研究与开发已经取得相当的成功，除绵羊，山羊和猪被成功的用作生物反应器外，还有牛和兔等动物，开展这一项目开发的国家有荷兰，瑞典，法国，西班牙，古巴，俄罗斯，以色列，日本，德国，芬兰，加拿大，澳大利亚，新西兰等国，据不完全统计，从事转基因药用蛋白的生产公司以近二十家，目前约120种以上的药用蛋白正在进行转基因动物生产的开发，技术水平已经达商业化生产要求的有约30种以上，正在进行临床试验的有约15-20种，在转基因动物制药领域中最引人注意的例子如下：
1. 英国PPL公司开发的主要开发产品有：
α-1-Antitrysin (2000年将完成期临床)
Factor IX
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Fibrinogen
多肽如降钙素 等15种以上产品
2. 美国Genzyme公司开发的主要开发产品有：
Antithrombin (以于2000年3月完成Ⅲ期临床)
BR-96-Antibody 等十几种抗体
HSA (人血白蛋白)
tPA 等
3. 荷兰的Genphrming 公司开发的主要产品有：
Lacterfferin
CI抑制因子
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人I型胶原蛋白
人纤维蛋白原
人因子8(Factor Ⅲ)
此外还有以色列的Dalcani研究所在奶山羊中表达了HSA，美国红十字公司在猪乳腺中成功表达了ProteinC，加拿大的Nexia公司利用奶山羊生产蛛丝，可用于航空，医疗，防弹衣等，美国的Abgenix和 Medarex公司利用小鼠生产人源化抗体治疗癌症和风湿性关节炎等，上述所提到的药物均已进入临床阶段。
国内最初在转基因技术方面的起步和国外是几乎同步的，例如有众所周知的"童鱼"，但因童第周先生注射的是RNA，没有可能发生重组现象，也显示不出太多的理论意义。国内科学工作者很早就注意到转基因动物技术广阔的技术前景。早在90年代初，中科院上海细胞所施履吉先生就提出生物反应器的设想，但是由于国内的经费的严重不足和体制上的一些局限，至今国内转基因动物生产化方面仍落后于国外，但总的说来，这方面的差距不是十分大。在转基因动物制作方面应该没有什么差距。比如据称上海医学遗传所曾溢滔院士研制了一条以整合胚移植为基础转基因山羊制作路线。并通过和复旦大学合作获得了乳汁中具有人凝血因子IX蛋白的转基因山羊，最近西北农业大学完成了体细胞克隆山羊的制作。随着国外转基因技术进入商业化的日益临近，国内的一些企业也纷纷进入此领域研制开发，已经公开的主要有以下几家：
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a)北京在促进国家高技术落户中关村合作协议共11项，其中两项和转基因动物有关，即包括863转基因动物基地和转基因实验基地。
b)深圳市政府组织绿鹏公司，南油集团和特区报社等单位委托北农大陈永福开发转基因牛，生产HSA。此外，深圳海王生物拟投资4800万建转基因动物生产研究所，主要由哈工大开发转基因鸡。
c)上海，上海儿童医院和浙江"超凡"公司共投资5000万开发转基因奶山羊。上海一家生产保龄球私人企业投资一个亿准备开发转基因奶山羊，具体的项目好象是人溶菌酶，人乳蛋白和人乳清蛋白等。上海复星公司，华东医药及另外一家公司准备联合开发转基因牛生产乳铁蛋白(Lacterferin)。
d)珠海丽珠和深圳某企业出资资助发育所开发的奶山羊表达EPO。
此外，沈阳三生也正在着于进行这一项目的准备工作。
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实事求是的讲，目前尚无充分的证据表明国内那家企业取得一定的成功，都尚处于开发阶段中。从国内各个单位所选的药用蛋白来看，基本上都是选择已经成熟有产品的药用蛋白如EPO，HSA等。目前尚未听说有开发类似国外的新品种，如药用单抗，抗HIV类蛋白等。
目前中国的国情，政府不会投资很多的钱完成这一项目，而且在现有的体制下，就是投了钱，效果也不会很好，对于这种资金小，风险大回报高的项目，适合以所有人和人格化色彩比较高的企业形式参与开发。从目前企业参与介入的时机来讲，现以有了多家民营企业如浙江超凡，绿鹏，中路，海王，锦绣大地，复星和华东制药等开始进行开发，因此不存在市场准入成本太高的问题。另一方面，我在这一领域已做7-8年的基础准备工作。因此，只要有适当资金投入，我们最终的结果绝对不会晚于别人，往往在每当出现新的技术进步和变革时，抓住这一时机是实现企业超常规发展的最佳时机。北大方正的王选教授讲曾经讲过："一个企业最可怕的是在技术上错过一个时代。"
转基因动物制作简框图(见下页)
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三. 转基因动物的 制作过程及所需条件
1. 转基因动物的 制作过程大致可划分为三个步骤,
A.重组元件的构建
此步骤是转基因动物制作的核心技术，构建的有效和合理与否至为重要和关键,它决定了表达的特异性和表达水平的高低.
此步骤就是将某一特异性组织(如乳腺,血液等)的调控区基因和目的基因(如EPO, GH, HSA, Hb等)的结构基因按照正确的读码框架拼接.HSA和Hb项目此步骤已经接近完成,调节基因已准备好.
B. 小鼠的模型确证:
利用小鼠这一简单的实验动物验证所构建基因元件的正确性这一过程约需半年.hEPO和hGH项目已完成此项工作,直接制作大动物即可.
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C. 经过验证正确的基因元件,制作生产用转基因动物(牛,羊,猪等)
从技术手段上讲转基因动物目前的实际制作方法有三种可供选择:
a)逆转录病毒转染
b)ES细胞转染
c)受精卵的显微注射
对于我们的制作只能采用显微注射的方法
取经过激素超排处理过的动物的受精卵,用显微操作仪注射100-200个copy的重组基因原件进入受精卵的雄性原核.随即将注射过的受精卵移入经同步处理的假孕母畜的子宫或输卵管内,在一般情况下经过注射过的受精卵约有60-80%的成活率,经移植后的受精卵的受孕率约25-50%,而所出生的动物中整合外源基因的约占10-30%(小鼠) ,8-10% (羊).在这些整合有外源基因的阳性动物中有一定比例的高表达动物(这一比例越为1/20).总体情况可见下页所画简图.
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2. 转基因动物制作工作所需设备,条件,场地和人员
a.基因工程实验室
用于完成重组基因元件的构建,分离,纯化和阳性动物的筛选,检测.所需面积约15M2,所需仪器设备有:
超净工作台 冰箱 天平 紫外检测仪 高速离心机(台式) 电泳仪 PH计
紫外分光光度计 培养箱 水浴箱 摇床 PCR仪
等共计约需仪器费用20万人民币
b.清洁动物房9-12M2饲养小鼠(仅用半年左右可租借)
c.显微注射室约15M2,需装修,装紫外灯
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倒置显微镜 $15000 拉针仪 $3800
显微操作Leica $18000 煅针仪 $3500
CO2培养箱 $3600 注射仪 $ 4500
共计约需仪器费用$ 45000(不考虑打折因素)
d.大动物外科手术室：
约需20M2 1-2张台子，一些手术器械即可
e. 需要租借一个约15亩大能饲养500头羊和100-200头猪的农场，条件除要求干燥不潮湿，距离公路大于1000米，有水，有电外无特殊要求。
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3. 制作转基因动物所需要人员的专业领域要求及拟成立的项目组成员：
制作转基因动物所需要下述三种专业技术领域的专门技术人员专门协同完成：
a)基因重组技术：负责所转移重组原件的克隆，构建，纯化及所制作转基因动物的筛选，检测，鉴定。
b)显微操作技术：负责手术取卵和卵子的显微注射。
c)动物繁殖技术领域：负责动物超排取卵同步发情和胚胎移植
我们拟成立的项目组成员是：中科院上海细胞所周筱刚和徐国江负责显微注射和手术取卵工作。上海细胞所是国内开展转基因动物技术方面较早的单位，国内目前许多从事此领域工作的人曾在细胞所学习。徐国江老师和周筱刚老师在显微注射技术操作方面有着丰富的经验和扎实的理论基础。我和他们合作。完成了转基因小鼠制作。奶山羊(猪)的超数排卵和胚胎移植工作是西北农业大学的窦忠英先生，窦先生许多年一直从事此领域的的工作。至于开发转基因动物制药技术的核心技术，重组原件的构建，在这方面我已有7年的工作基础，已完成奶山羊乳蛋白调节基因的分离，克隆，分析，测序，并完成猪血液特异性调节蛋白基因的分离，克隆，分析，测序，优化；同时分离克隆了消除位置效应的元件，重组了药物目的基因hEPO,hGH和调节基因。如此大量细致的基础工作，国内没有其他实验室开展过，而且我们所构建的基因原件已经经过了小鼠模型的验证。
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在决定参与投资和合作的个人和单位有：
1.我的一个同学决定以我个人名义投资50-100万
2.我所在的泽生公司将投资100-200万
3.中科院上海细胞生物研究所郭礼和先生也表示了投资参与开发的意向
4.中科院生物工程中心也会以实物投资形式参与开发
5.中科院院士刘新垣先生愿意担任所成立公司的顾问或直接出面组织此事
所以综合我们团队的全部优势，一旦开发资金到位，并且理顺体制方面的关系，采取一种能适应高科技开发的管理机制，我们开发的结果和速度在国内绝对不会落后于人的。目前国内虽然已有多家企业开始介入转基因动物制药的开发，然而在此领域介入的强度和深度还远远不够，并且刚刚起步，另一方面，因转基因动物仅仅是一种生产手段和技术，原则上可以生产所有蛋白类药物，因此，只要所开发的药物互不相同，其他企业和我们开发就互不冲突。另外象HSA和血红蛋白类代用品这种市场容量相当大的药品也需要多家生产企业开发才能满足市场需求。
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4. 本项目种子期的完成约需要3-5年共计需要经费500万元人民币(不含场地和实验室)
其中仪器设备费 ：80万
试剂费 40万
动物饲养费 250万
人工及办公费 130万
5.本项目的产业计划和融资方式如下表：
阶段(Ⅰ)创业(或种子)期(Ⅱ)创立期(Ⅲ)成熟(或成长)期
任务指标完成有意义的转基因动物纯化工艺建立临床研究新药报批生产基地建立，市场营销，开发
所需资金500万3－4千万>4610万港元(按香港创业板)
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可供选择投资工具合作伙伴新股，风险投资，公司债券上市或被上市公司收购
期限3－4年2年1－2年
本阶段收入方式接受委托开发或合同研究技术或药证转让药品市场开发或销售
赢利大概能力20－100万/年千万级/年>亿元/年
关于第一阶段收入方式的说明：我已和养生堂徐乃正老师达成协议，在公司建立和正常运转之后，有偿为养生堂进行委托开发(制作模型)和合同研究(为九源生物有限公司建立某种抗体的奶山羊乳腺表达系统)。
我们希望能够找到兼顾专业发展潜力及方向和商业赢利双重要求的合适的进入这一行业切入点。但我现在仍然感到公司初期在短平快，能迎合投资者迅速有所回报方面是欠缺的。
四所拟开发项目的简单评价
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为了开发转基因动物制药这一技术,我们选择了具有不同特点的但市场较为成熟的下列四种产品作为先导产品进行开发:
序号 所拟开发的项目 所需达到的指标
1 转基因奶山羊乳腺特异性表达人红细胞生成素(hEPO) >200mg/L
2转基因奶山羊乳腺特异性表达人生长激素(hGH) >200mg/L
3转基因奶山羊乳腺特异性表达人血白蛋白(HSA) >2g/L
4转基因奶山羊乳腺特异性表达人血红蛋白(human Hemoglobin) >15g/L
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此外在技术领域的拓展上我们将着手：人源化抗体转基因小鼠(泽生公司要求做)和即将完成的抗体通用表达载体，准备用于在奶山羊的乳腺中生产治疗性抗体。
1. EPO：
EPO是由有肾脏合成的一种糖蛋白，作用是刺激人血红细胞的成熟，在临床上用于治疗由于肾衰，放疗，化疗，风湿性关节炎和慢性疾病引起的贫血。EPO在国外自从1989年被美国FDA批准上市以来随着适应症的推广，销售额逐年上升，多年来一直名列生物技术类药物榜首。1998年全球销售额约25亿美元。目前国内的EPO生产，全部为CHO细胞培养技术，只有6家单位得到生产许可，3家获得新药证书。另有几家单位获准进行临床试验，将来最终会有十几家单位获得生产许可，年生产能力将达到500万支，而国内去年(1998年)实际销售量约100万支(约4-5亿RMB)但据医药界人士称，中国每年仅肾衰病人就有50万之多，但其中仅2万病人得到治疗，所以中国实际EPO年需求量为1500-2000万支，然而，市场销量的如何扩大，将受许多种因素，社会经济发展水平，人们认识水平，医疗体制，医疗保险机制和药价水平(现在国内销售价高于国外一倍，EPO在美国$18，在中国国内为325RMB)等多种因素影响。现在CHO培养生产EPO已经不能继续申报，而转基因动物生产做为生产工艺重大改进仍然可以进入这一市场分一杯羹。而转基因动物和CHO相比较就是生产生产成本大大降低，更有利于价格竞争。
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2.人生长激素
在临床上用于治疗侏儒和老年人，更年期妇女的骨质疏松症。与EPO相似，该产品在国外也是相当成功的基因产品之一，1996年在美国销售额达6亿美圆，1997年仅Gentech和 Lili就达4.8亿美圆。目前国内开发或生产该产品的单位有：上海联合赛尔，上海海济(上诉两单位技术均源于上海细胞所)，安徽安科和长春金赛公司。年销售额不详。
3.HSA人血白蛋白
HSA是存在于血液中的非糖基化蛋白，MW65000，血液中浓度为42g/L,它的功能是维持血液通透性(bloodstream osmolarity)，调节血压以及转运脂肪和氨基酸。它在临床上是使用量较大的一个药品，广泛用于外科手术，创伤性失血，水肿和低蛋白等症用于增加血容量同时也被用作基因工程药品的保护剂，我国目前人血白蛋白每年消耗40-50吨，HSA连续五年一直处于国内大中城市医院药品销售额前3位。98年国内销售额为30多亿(这一数据中国药房等杂志均有报道)，单价约3.56$/g。但是目前我国HSA的消费远远低于WHO所规定的0.2-0.5克/人年 的指导标准，目前国内所销售的HAS均为血液制品，来于国内30多家血液制品厂和部分进口，国内血液制品厂最大也不超过市场份额的5%。基因工程产品与传统的血液制品相比较其优点在于 1。没有污染，如肝炎，HIV等病毒 2。来源不受限制，从生产成本方面考虑酵母生产高于血液的低温乙醇法，而转基因动物生产HAS生产成本远远低于从人血中纯化的HSA。最近日本Yoshitami(原绿十字)建立了年生产350万支12g/支的HSA酵母生产线，首期工程100万支商品"Alberc"2000年上市，据说酵母生产纯化要求三个一米的pharmacia的柱，多根1.6米chromaflow,纯度要求达到99.999999%,仅设备投资就达一亿美圆。
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国内华北制药联合军事医学科学院，上海海济，上海医药集团公司，通化金马，和山东格兰百克等单位也在开发Yeast生产HSA此项开发关键在于中试放大和设备投资。这也就是为什么Genetech公司早在1981年就取得HSA在Yeast中表达的专利，而现在仍未开发，日本率先投资重组HAS是因为日本发酵工业实力最为发达和日本财团实力最为雄厚。
国外以色列，美国PPL和美国Genzyme等公司均在开发转基因动物生产HSA这一项技术，其中以色列几年前就完成了转基因奶山羊的制作平均水平为(10g/L奶)。国内北农大(陈永福)和上海儿童医院(曾溢滔)也在开发转基因牛表达HSA。
4人血红蛋白：
利用血红蛋白开发血液代用品，目前尚未成为商品，美国有四家公司利用牛血，过期人血和E.Coli表达的人血红蛋白开发此类产品，目前正处于临床Ⅱ期或Ⅲ期，其中E.Coli表达的重组蛋白处于临床Ⅲ期而结果令人满意。另一方面，美国Prinston大学和DNX公司联合制作的血液系统表达人血红蛋白的转基因猪早已完成实验室工作。国内目前尚未听说那家单位开发此项目。血红蛋白作为血液代用品，其国内的市场销售额被预计高于70亿。98年北京的医疗用血为70吨，上海为80吨，血红蛋白类血液代用品和传统的输血相比较有如下优点：1。没有污染，可以避免传统输血中所造成的乙，丙肝，梅毒，AIDS，等疾病的传播，我国每年约10万人因输血传播丙肝(丙肝有10%的漏检率)。2。无需配型 3。保存期长 4。无需冷藏 。国外关于血液代用品共有两种开发方向，一是"蓝血"，属于氟化物，俄罗斯早期科学家致力于此，优点是不易造成血管堵塞，但成本高于每单位500美圆。另一方面是欧美科学家所致力的基于血红蛋白的"红血"，它优于"蓝血"之处在于它是生化品具有"蓝血"这种化学品所不具有的载氧协同效应。现在世界上开发血液代用品共有9种类型，其中7种是基于血红蛋白的。在美国，一单位血约卖$50,而DNX Henoglobin准备销$250。
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五项目进展和实际情况预计安排：
本项目暂不以项目报批成功，而以获得有生产意义的转基因动物(EPO和GH分别>200mg/L, HSA>2g/L, Hb>15g/L)繁殖若干代，纯化方法初步建立定为本项目第Ⅰ期融资目标的完成，预计约3-5年。
1起点
a.hEPO和hGH已完成基因构建，并且经小鼠模型确证正确，直接制作转基因山羊即可。
b.HSA和Hb所需调节基因已经分离，克隆，优化。
2具体任务
a.制作hEPO和hGH转基因山羊，繁殖若干代，制作群体，建立纯化方法。
b.拼接HSA和Hb重组元件，利用小鼠模型确证。
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c.制作HSA和Hb生产型动物，繁殖1-2代，扩大群体，建立纯化方法。
3实际进展的计划安排以及完成指标考评
第一年度：
上半年：实验室建设，装修，仪器订购，安装，调试
实验牧场的建立
人员适应性训练
羊种的引进，以及引进标准的细化
下半年：EPO，GH转基因奶山羊的制作的开始
a.超排方法的建立 超排卵数：平均每只供体羊应当可获得供注射卵7-8枚
b.受精卵的成活率 注射存活率：应当稳定在70-80%
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c.受孕率 受孕率：应达到30-50%
HSA和Hb完成基因构建工作。 酶切物理图谱和关键部位序列与预计结果及GENEBANK资料一致。
第二年度：
上半年：
a.继续制作转基因山羊，并着手准备筛选阳性动物 阳性率应在5-8%。
b.制作转基因小鼠验证所构建的HSA和Hb重组原件，所制作的转基因小鼠应该得到预期正确的结果。表达专一，稳定，阳性鼠健康，传代稳定。
c.建设一个能饲养200头猪的牧场。
下半年：
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b.开始准备检测阳性山羊的表达
第三，四年度
同第二年度下半年一样，继续制作转基因猪和羊，并且继续筛选和检测。
第五年度：
转基因猪，羊的筛选，检测，纯化方法的建立。
结果验收，新药报批材料准备，股份公司筹备。
第一轮风险投资退出，第二期融资开始。
4转基因动物制作过程简述：
a.基因原件的小鼠验证
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所构建的重组基因元件，虽然已经在分子水平，经电泳酶切，PCR扩增，序列测定等多种手段多次验证，但是仍然需要在小鼠这一易操作，周期短，成本低的试验动物体内观察所构建的元件在个体水平上能否正确表达目的蛋白，表达是否在专一性组织上，对该生物体是否会有病理性影响，能否稳定遗传并在子代中表达。
制作转基因小鼠验证二个基因元件预计约需DBA和C57杂交F1代供体小鼠200只，ICR受体鼠100只，公鼠20-40只(另外供体鼠的饲养状况对供卵数影响较大)，约需6个月即可得到结果。
小鼠怀孕期21天，性成熟期五周，这样一个周期(即从受精卵到G0代产仔泌乳)约3个月)根据劳动强度和所需时间安排为每周做二次，每只10只供体鼠，2.5个月即可完成200只供体鼠。
0.5个月 开始做 1 2 3 4 5 6 月
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约需0.5个月做预实验 开始有小鼠出生 开始可以剪尾巴筛选 开始可以检测 检测工作结束
(同时停止注射)
预实验的主要内容就是试剂和培养液的配制，要求受精卵放入培养基中在CO2培养箱370C培养能继续正常分裂，所配制的试剂必须达到注射受精卵后，受精卵不死，否则重新配制。
6.制作转基因小鼠的具体时间安排：
第一组 小鼠(AM11：00， PMSG)超排
周六
48hr 周日
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AM11：00 HCG 合笼交配 第二组小鼠 (AM11：00， PMSG)
超排
周一
AM8:00取卵注射移植 19hr
周二
第二组HCG 合笼交配
周 三
周 四
取卵注射移植
周 五(继续重复)
小鼠模型意义的评估：：
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小鼠模型对于基因元件在大动物个体中的表现在正确性方面有意义，而对有效性上没有多少相关，也就是小鼠的实验结果只能对基因元件在大动物体能否正确,正常的表达，该元件对生物体是否有病理性影响，能否稳定遗传给一个说明，但是这个说明无法预见，该基因元件在大动物体内表达水平的高低，比如用奶山羊的调节基因元件在小鼠中验证表达水平不高，并不等于在奶山羊中仍然不高，反过来如果使用小鼠的调节元件在小鼠中表达量高，而在山羊中也不一定高。
6. 转基因山羊是制作：
为了适应生产，经小鼠验证能正确表达的基因元件，可进一步制作具有生产价值和意义的大动物，综合考虑生产性能，制作成本和制作周期，转基因奶山羊和转基因猪比较适合。转基因奶山羊制作与转基因小鼠制作基本相似，只是同步发情和显微注射(由于核看不清楚)更难，而且其排卵时间长，发育时相不一致，可供注射的卵数少。所要求的实验条件要求为1500M2羊舍和一间约20M2的外科手术室。此外山羊每年仅5月和11月两个繁殖期(浙江地区)。所以每年可用来操作的时间3-4个月。暂时预定每两个星期做3次，，每次8-10只羊(不排除熟练后重新调整的可能)，总共每季节约75-90只供体羊，还需受体羊100只，公羊3-7只
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每个季节(1.5个月)所操作受体数 75-90只
超排所得卵数 750-1200
可供注射数 300-500
存活数 200-300
所需受体数 100只
山羊胚胎受孕率约30-50%
制作2-3个基因元件的转基因动物至少需要操作8个季节注射约6000枚受精卵才能得到结果，从开始操作第一个月算起，第三个月就能看到怀孕，第五个月生羊羔，第六个月可以筛选阳性动物，十八个月后才能检测乳腺的表达结果。
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奶山羊超排卵数约10枚卵，可供注射的50-60%，注射后存活率约70%，出生率约30-40%，所生动物阳性率~5%。在阳性动物中因位置效应每20头中才有一头表达量高的，故制作3个基因元件的转基因奶山羊约需1000-1500头山羊。另我虽有可以消除位置效应的基因元件，但因没有任何大动物使用结果的科学论文，只能试试看。如有效，可节约动物成本1/3左右。
7转基因猪的制作：
相似于奶山羊，但由于猪的自然繁殖期不明显，又是多胎动物，故制作上比奶山羊容易，仅显微注射略难一些。猪舍只需200头规模就行。此处省略不写。
六. 转基因动物个体表达系统的优势和效益分析
医药行业是永远的朝阳产业，许多专家和业内人士也预言，随着传统的化学药品的增长的放慢，天然药品和基因工程药品迅速增长，将来必然是天然药品，生物药品和化学药品三分天下，在医药市场的总量方面，目前我国人均药品消费量偏低(1997年城市人均175元，农村人均25元)这一数值远远低于欧美发达国家的标准(160-300美圆)，因此市场潜力是巨大的。随着经济水平的增长，生物技术药品的增长保持了高过20%较快的增长速度。2000年将达到72亿人民币产值，其中进口药品(生物技术类)自从1996年以来保持逐年下降的趋势，从1996年的60%(1.9亿美圆)下降到1998年的40%(1.6亿美圆)。转基因动物个体表达系统本身固有优于细菌和培养细胞，生产加工能力强(如可生产结构复杂的FⅨ六亚基的Fibrinogen),产量高(每升可达几十克)，管理生产容易，成本低和传代稳定不容易变异等优点。一些现在正在临床应用的药物(如HSA，tPA)现有的细菌或者培养细胞技术无法满足人们的需要，如E.Coli的后加工问题，CHO的生产成本和产量限制。随着人类基因组项目的开展，这一需求将更加明显。据美国权威机构红十字和遗传学会，到2005年转基因动物所生产的药品将达到350亿美圆的销售额，到2010年转基因动物所生产的药物将达到整个基因工程药物的90%以上。就我们所开发的项目的国内情况来看，2007年前后EPO，GH，HSA，和血红蛋白其市场销售额最保守估计也在150亿以上。另一方面，从社会效益角度讲，缓解我国医疗用血紧张的现状，避免患者在输血和使用血制品感染AIDS和肝炎等病毒性疾病的危险。；另外。在我们此项开发完成之后，可如法炮制开发其他类蛋白药物。
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国外的专业文献中有众多不同来源的资料具体的分析比较微生物，哺乳动物细胞培养和转基因动物系统。本项目建议书引用其中之二：(见表Ⅰ和表Ⅱ，见下页)
也可以简单的比较血源HSA和转基因HSA的原料成本：
如每年生产HSA10吨(价值约3亿)，则需血浆400吨，如每吨血浆40万元人民币，则原料费为1.6亿。
如用奶山羊的表达浓度为2g/L(国际上为10g/L的表达水平)，莎能奶山羊的年产奶量 为800-1000kg，暂定生产提纯效率为80%，则每年生产10吨HSA约需6500头山羊，假如每只山羊的每天的饲养管理费高估为10元人民币，则原料成本为2373万元。
至于日本绿十字的Yeast生产系统，我们知道它们通过扩大生产规模，优化工艺，可使Yeast的生产成本不至于太高于血源HSA生产成本。
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表Ⅰ(表中乳腺系统按100头牛计算)
CHO E.Coli Milk
表达浓度mg/L 33.5 460 100
资本投入(百万) $61m $389m $3.3m
年均花费(百万) $117m $242.3m $0.51m
年生产量(kg) 11.4 11.6 51
每克花费 $10,207 $20,192 $10
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(此表引自Theriogenology 45,P51-56 1996)
表Ⅱ 基因工程药物生产三种形式的比较
细菌 CHO 转基因动物
重组原件构建 简单 较简单 复杂
转化 简单 较复杂 难，低效
筛选 简单(1-2天) 复杂(含加压) 复杂
制作成本 低 高 极高
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制作周期 1-2周 1-2年 5-7年
产物后加工 无 有 有
表达产量 100-200mg/L 10-20mg/L >1g/L
生产成本 较低 高 低
纯化成本 高 较高 低
投 生产设施 $25millio $3million
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资 纯化设备 $25million $5million
生产花费(每升培养基) $20-50 $ 2
典型表达水平 250mg/L 1g/L
每克花费 $80-200 $1
(此表综合PPL公司和GENZYME公司资料)
七. 风险分析及防范对策
目前，转基因动物这项技术从技术路线，商业市场准入政策和实用性方面均是无障碍的，而上市潜力巨大，前景异常广阔。
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在此领域中国和国外的差距并不象其他行业中那么巨大。转基因动物的历史也不超过十年。而且中国在实验动物方面也不受限制，较为方便，也没有宗教方面的抵制的影响，但是中国也有投入偏低，从体制上并不激励科研人员从事一些周期较长的开发和研究，在社会文化的影响也好，或经济水平制约也好，中国多数企业较为急功近利。
虽然这一开发工作谈不上什么创造，但是也决不是简单的组织生产。再一点，因为是在有限的经费和有限的时间进行开发，制作出有表达的转基因动物毫无问题。但是有生产意义的高表达将涉及到概率，制作的效率，也涉及到人员之间，人与动物之间的协调配合，最终获得有生产价值的转基因动物的概率，由下述因素决定：每只供体动物所获得的卵数，所得卵的可注射率，存活率，整合率，受孕率，产生率和表达率。故此为留有余地，我们将完成任务的时间预计为3-5年。
由于是开发工作，所以要求必须有生产价值的有效表达，但由于具体涉及到每一种蛋白的特性，所以不能保证每一种蛋白药都能如期达到预计的开发水平。但是由于涉及到了不同类型的蛋白，应该肯定有一种能预期成功。另外，该投资的成功与否，也并非绝对单纯取决于该项工作能否达到预计的表达水平，也取决于该次工作国内其它单位的开发水平和市场对其的需求程度。其实也等于一种社会对开发潜力是否认可和"供求关系"的问题。
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当我们面对国内其它企业的开发，尽量在所开发产品上有所区别，我们在上游构建花了相当的时间因此与别人相比不会有一个本质的晚，再一点，从战略角度讲，国内也不可能独此一家，如果做为第一家也有一个进入成本的因素，最好能做第二，或第三家，把财力和精力花在后续产品或市场营销上。
任何技术开发都存在着所谓的"技术路径"的因素，所以未来技术的发展和进步是值得时刻关注的，诸如ES细胞和克隆的效率。从科研开发角度讲我们希望投资方配合逐渐实行员工持股是管理方式，在组织科研人员实施开发方面，我们已经有过相互合作配合顺利完成hEPO和hGH转基因小鼠的经验。
在我们与企业家接触过程中，一些希望投资的企业家表示他们并不明白风险在什么地方，感觉到对这类事没有任何把握。
事实上，正如本项建议书所提到的那样，对于每一个具体的项目或指标都存在着一个在特定的时间内或者有限的经费的情况下必须高效低成本在企业家还有耐心的情况下，得到高表达个体这种七分靠运气完成开发的概率风险。
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然对于投资转基因动物制药这一项目本身并不存在绝对失败这样的风险，也就是说根本不存在500万给你，5年过去，什么也做不出来，投资打了水漂的问题，因为我构建的原件是经小鼠验证的，必然在2-3年内能够得到特异性表达的转基因奶山羊个体，这是科学规律的必然。
退一万步讲，假如由于种种原因，五年过后，每一个具体的项目都没有达到本项目建议书所定的指标，但这并不等于说我们没有熟练掌握转基因动物制作工艺，并不妨碍我们利用自身优势开展对外合作研究，我们也可以寻求重组元件的更有效的构建。另一方面，一旦乳汁中表达目的蛋白的表达浓度达到可以纯化的水平，即使是距离生产意义有一定的距离，也可以率先申报新药证，申请临床试验。
所有这些无形资产方面的意义和价值都由当时我们所具有的水平和但是国内其他企业所具有的水平来决定。
从投资的回收方式来讲，不外于：
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1创业板上市
2成立公司后，公司贷款分期回购
3整合出售给其他上市公司
一分子水平(基因元件构建)
人 生产动物如猪，羊
分离药用蛋白基因 (如HSA，Hb)并 分离特异性组织(如乳腺，血)
改造 调节基因. 如不适合改造
按正确的读码框架拼接为杂合分子
重组基因分离纯化
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显微注射单细胞受精卵. 雄性原核
二个体水平
供体动物经激素超排
处理，并交配
取受精卵 受体动物经同步发情与阉割过的雄性动物交配
制作假孕
成活率60-80%
胚胎移植
移入代理母动物输卵管或子宫
受孕率25-50%
所出生的动物满月后经分子生物学法如PCR，同位素杂交进行筛选阳性率
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(也是整合率)约(10-30%)
蛋白质方法检测
高表达水平动物(约占1/20)
完成制作转基因动物后
的工作本建议书不做讨论
建立纯系种群
纯化方法建立，临床，药证申请等工作
转基因动物制作的简框 附件
一动物制药的GMP问题
制药业的生产管理是全过程的，生产动物的管理也必将包括在其内，目前国外已建立详细的管理规范，要求略有不同于食品生产大型牧场，但要求物理隔离，生殖隔离和生物安全隔离，并没有要求specific pathogen free
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eg. PPL公司生产动物管理要点如下叙述：
1.sourced from New. Zealand (scrapic free)
2.strict quarantine on facilities with no adjacent stock farm and natural boundary
3.monitored for unusual events by trained & experienced staff
4.feeds free from mammalian derived products
5.allowed access to natural gracing
, 百拇医药 6.nutritional practices are in line with those used in high-quality dairy flocks
7.milking performed on clinically health animals by health operators using automatic milking equipment similar to that employed in bovine dairy industry (一个挤奶机可供2000头羊用)
8.various checks are put in place to prevent animals on medication entering the milking parlour
9.natural variation in volume and expression level of individual animals is minimized by blending milk from multiple animals
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(PPL做过两个说明安全性的试验：①感染羊"用不同水平的病毒"但奶中病毒水平"异乎寻常的"低，②加入病毒于加工过程，终产品中没有。说明加工过程安全可靠)
引自PPL. Address safety issues arising from the products of therapeutic agents in transgenic milk .1996 Developments in Biological standards 88/269-276
二动物制药的药证许可证问题：
目前中国尚未真正面对过这一问题，但是中国生化制药已多年。例如凝血酶就是从猪血中提取的。美国和欧洲早在94年和95年就颁布了针对转基因动物制药的Guideline。美国Genezyme公司的AntithrombinⅢ和英国PPL公司的α－AAT已经完成Ⅲ期临床。于2000年提出新药申请。所以转基因动物制药将来在中国必将获得通过。其次，游戏规则是由最早参与游戏的人制订的，现在国内已有多家企业参与转基因动物制药的开发，到时船到桥头自然直，决不能等有了规则之后在去开发。
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a.Dec.1994 欧洲完成文件points to consider.
b.Food & Drug Adminstation Docket No 95D-0131
c.1996年进入临床Jan .2000年positiveⅢ data for antithrombin Ⅲwere presented at chase H & G conference .年底申请BLA
三关于来源乳汁治疗性蛋白药物的纯化问题
截止现在我没有做任何有关纯化方面的工作，我始终坚持这样的观点，只要"奶里面有"而且量足够大，就总归能够有效的纯化出来，这决不会成为不可解决的障碍，而且一般来说，生产成本和效率起初并不被视为进入市场的障碍。只有经过一段时间之后，市场力量(如竞争性，总需要量)会对药物生产效益有所要求。因此现在过多的要求解决纯化问题，影响主要和关键问题的解决。
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但是在我与企业的接触中此问题被企业做为关心的重点
1.我所看到的所有资料(均为权威杂志而非新闻)都将纯化容易，纯化成本低作为转基因动物生产形式的优点之一，纯化容易的理由是a.乳成分简单，乳蛋白90%为酪蛋白，β－乳球蛋白，和α－乳清蛋白b.乳成分无毒无害，人体对之的相容程度高c.表达浓度高。
其中纯化设备投资与CHO比较为1/5－1/10，纯化成本一般为CHO细胞培养物的纯化成本的几十分之一和十几分之一之间。我无法看到国外公司详细的纯化工艺过程，但从其简单的介绍大致可以了解到一般大致为：
除脂肪/酪蛋白 乳清 色谱层析 等约4－5步
(通过)PH4.6酸性沉淀 (直接进入高效分离纯化，无需富集)
或15%PEG
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或离心
其回收率约为60-80%。纯度为98%
2.我在建议书中举了"绿十字"HSA的例子给我添了不少麻烦去解释
据我所知，无论是中国的先称为药审中心，还是美国的FDA都没有对哪种药品的纯化做过具体的要求。现在市场上的HSA大都是低温乙醇法生产的，其纯化纯度也就95%，也没有听说有谁吃了发烧之类的质量方面的事。也就是一些AIDS，HBV，HCV感染等安全方面的官司而已。国外正在用转基因动物开发的药品α－AAT和AT-Ⅲ其药剂量也很大,多为5－10g的剂量，而起纯度也仅为98%。所以说"绿十字"的HAS纯度为8个9，并非这一种药品的要求，而仅是由其采用的表达系统及HAS剂量所决定的，这种现象所的出的结论只能是利用酵母这种做生物表达系统生产HAS纯化比较麻烦。, 百拇医药
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