酶类制剂
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《中药制剂学》
在人类和动植物活的机体中，普遍存在一类特殊蛋白质。它们参与生化反应，而且使反应进行得极快，这类物质是天然催化剂－－酶类。酶具有高度专一性和极高的活性，使有机化合物在体内以一定的反应顺序转换。酶是生物细胞合成的，存在于细胞内的称为胞内酶；由细胞内合成而分泌到细胞外起作用的酶称作胞外酶。各种动物器官、组织和体液中含有酶的种类和数量差别甚大。通常所含酶的总量并不很少，但每一种酶的含量却很少，常在百万分之几至百分之几。因此酶的提取、分离、纯化与确认要靠较高水平的生物化学技术。
酶的发现是十九世纪(1833年)有人从麦芽浸液中提得第一个具有活力的蛋白质－－淀粉酶。到目前科学家们已从生物体内提纯确认出八百多种酶。但是应用到医药方面作为医药用的酶类制剂不过才有几十种。然而，祖国医药学对含酶类药物的记述确很早，如《药品化义》中记载：“大麦芽，炒香开胃，以除烦闷；生用力猛，主消麦面食积，症瘕气结，胸膈胀满，郁结痰涎，小儿伤乳，又能行上焦滞血。若女人气血壮盛，或产后无儿饮乳，乳房胀痛，丹溪用此二两，炒香捣去皮为末，分作四服立消，其性气之锐，散血行气，迅速如此，勿轻视之”。又如《本草蒙荃》中记载：牛肚“健脾胃，免饮积食伤”等等。由于受技术限制，而未能进一步提纯入药。但由此说明，酶类制剂与中药己早有渊源关系，现在我们讨论酶类制剂，也可认为是中药制剂的发展。
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酶类制剂的分类
酶制剂按其临床应用来分类，主要有以下几种：
消化类：这类酶研究最早，是品种最多的一类酶。它们的作用是消化和分解食物中各种成分，如淀粉、脂肪、蛋白质等使变成比较简单的物质，便利肠胃道的吸收。当体内消化系统失调，消化液分泌不足时，服用这一类酶就能够补充和纠正体内消化酶的不足，恢复正常消化机能。在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。
抗炎净创类：这一类酶是目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。这种酶大多数都是蛋白质水解酶，能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。在这一类酶中，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，α一淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。给药的方法有外敷、喷雾、灌注、注射、口服等。它们可以单独使用，也可以与抗菌素等合用，治疗各种溃疡、炎症、血肿、脓胸、肺炎、支气管扩张、气喘等症。
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血凝和解凝类：这一类酶都是从血液中提取出来的，有的能促使血液凝固，有的却能溶解血块。凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品……
治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。
解毒类：这一类酶的主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等。青霉素酶能够分解青霉素分子中的β一内酰胺环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应。
诊断类：这一类酶是用作临床上各种生化检查的试剂，帮助临床诊断。最常用的有葡萄糖氧化酶，β一葡萄糖苷酸酶和尿素酶。如尿素酶是测定血液中尿素的浓度和尿中尿素的含量的，从而可检查肾功能。
酶制剂的一般提取方法:
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酶的制备一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和结晶(或制剂)。首先将所需要的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地要夹带着一些杂质，而后再将酶从溶液中选择地分离出来，或者从酶溶液中选择地除去杂质，最后制成纯净的酶制剂。
1)酶的提取
胞外酶可以直接进行提取分离；胞内游离存在的“离酶”以及与颗粒体(如细胞核、线粒体、微粒体、质膜)结合的“结酶”都有一个破碎细胞过程，“结酶”还有一个转变成水溶液的问题。因此对酶类的提取要采用多种方法，常用的细胞破碎法如下：
机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。
化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用；用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。
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酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。而用纯的工具酶降解法是无此缺点，但成本较高。
冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。
酶的提取溶剂可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等；也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。溶剂用量一般为原料重量的1～5倍。搅拌可加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。多数酶的提取要在50C以下操作，但有的酶在较高温度下提取更好，如胃蛋白酶在450C提得收率较高，一般可在一5～＋400C间适当选择。提取液的pH应在酶的稳定pH范围内，并应远离其等电点的pH为宜，如蛋白酶选用pH
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2.5～3，0，胰蛋白酶和α一糜蛋白酶则用0.25 N硫酸提取。若在中性或碱性提取时，最常用的是0.15 mol/L氯化钠、0.02～0.05mol/L磷酸缓冲液、0.02-0.05
mol/L焦磷酸缓冲液。正丁醇的亲脂性强，能透入酶的脂质结合物中，又兼有亲水性，有类似表面活性剂的作用，适用于提取“结酶”。
为了减少提取液体积，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分离可用过滤法(如板框压滤、旋转真空过滤)或离心法。过滤时可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。离心时可加入氢氧化铝凝胶、磷酸钙凝胶等以除去悬浮的胶体物质。
2)酶液的浓缩
提取的酶液为减少纯化操作容积，通常先进行浓缩。工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。对于少量酶液下述方法浓缩更合适：
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用葡聚糖凝胶(分子筛)浓缩：取相当于酶液量1/5的干葡聚糖凝胶G15或G25，分次加入酶液中，搅拌30
min，使凝胶吸水膨胀，进行吸滤。经重复数次操作即可在短时间内把酶液浓缩至所需的体积。也可将酶液装于透析袋内，埋入干凝胶中，袋内酶液也可得到浓缩。
用聚乙二醇浓缩：将稀酶液装入透析袋内，袋外复以聚乙二醇，袋内水份被袋外的聚乙二醇所吸收，在短时间内可以达到浓缩的目的，得到所需的浓酶液。
用超滤法浓缩：超滤技术在其可筛分范围内分离酶分子时不发生“相态”变化，可以避免酶蛋白变性，且分离度快，所以愈来愈被广泛采用。各种不同孔径的超滤膜，适用于实验室规模及一定工业规模的酶液浓缩。如国产二醋酸纤维素制成10～200埃孔径的超滤膜，用于实验室规模固氮酶液的脱盐和浓缩，效果良好。
3)杂质的去除
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酶提取液中常含有杂蛋白、多糖、脂类及核酸等杂质，可用下述方法去除：
调PH和加热法：利用蛋白质对酸、碱和热变性方面性质的差异，可去除非活性杂蛋白。如制备脂肪酶时，在pH
3、4时以400C温度加热150 min，淀粉酶活力可丧失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80%以上。
蛋白质表面变性法：蛋白质表面变性后其性质有所不同，借以去除杂蛋白。如制备过氧化氢酶时，加入氯仿和乙醇进行振荡可以将杂蛋白变性而去除。。
蛋白质沉淀剂法：利用醋酸铝、利凡诺、单宁酸、离子型表 面活性剂等蛋白质沉淀剂可以去除杂蛋白及粘多糖类杂质。使用时要注意这类试剂常可引起酶变性失活，因此应迅速除去。
选择性变性法：各种蛋白质对变性剂的稳定性不同，可以用选择性变性剂去除杂蛋白。如细胞色素丙对三氯醋酸较稳定，所以在制备时可用2.5%三氯醋酸使其他杂蛋白变性使
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沉淀除去。。
加保护剂热变性法：酶与底物或竞争性抑制剂结合后，其稳定性常显著增加。所以常用它们为保护剂，再用一些剧烈手段破坏杂蛋白，如用D-甲基苯甲酸为D-氨基酸氧化酶的保护剂，经加热除去杂蛋白，使该酶得到很好的提纯。
核酸沉淀剂法：酶液中的核酸类杂质，可以用氯化锰、鱼精蛋白硫酸盐等沉淀剂使其沉淀而除去。必要时，也可用核糖核酶将核酸降解后除去。
4)酶的纯化
酶是蛋白质，因此凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化，如盐析法、聚乙二醇沉淀法、有机浴剂分级沉淀法、等电点法、选择性沉淀法、各种柱层析法(吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤)、各种电泳法及亲和层析等。不同之处是酶的纯化过程尚需选用迅速简便的活力测定方法，以追踪酶的去向。在选用酶的活力测定方法时，分析方法的迅速要比其精确度更为重要。如宁可要一个需时5min，准确度为5%的方法；也不要一个需时30
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min，准确度为0.5%的方法。在建立活力测定法之后，再根据各单元纯化步骤及活力分布情况用列表形式表达，表的内容包括：操作步骤、总体积、酶浓度(每毫升酶活力)、总活力、蛋白质浓度mg/ml)、比活力(即纯度、酶活力单位/毫克蛋白)、产率%(每步总活力除以第一步的总活力)和纯化倍数(每步比活力除以第一步比活力)。
一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作，各单元操作如何串联，需靠实践摸索。每经过一个步骤一般可提高酶纯度2一3倍，总纯度可提高数千倍，而总产率常仅百分之几或十几。总的原则是选用最少的步骤而能取得最好的纯化效果、因为增加步骤势必增加酶的丢失。通常对于含盐浓度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用盐析法；对于低离子强度的酶溶液则可用吸附法或离子交换法。交替使用不同分级沉淀法常比单独重复同一类型方法更能奏效。所以常将吸附法、盐折法和有机溶剂分级沉淀法串联起来进行纯化。当这些方法仍达不到要求时，还可以采用一些包括电泳、层析法在内的其他类型纯化方法。
当酶达到一定纯度时，便可以进行结晶，结晶也是纯化酶的有效手段之一。但应注意的是药用酶有些并不需要结晶。酶的第一次结晶纯度有时仍低于50%。酶的结晶通常可以在较纯的酶液中添加硫酸铵、氯化钠等盐达到一定饱和度，使酶慢慢结晶出来。此时必须控制温度和pH值。盐浓度要逐渐提高，添加速度要慢，才能得到较好的结晶。有时在低温下，用丙酮、乙醇等有机溶剂进行结晶。近年来采用平衡透析法，即将酶液装人透析袋中，置于一定饱和度的盐溶液中进行透折，这种操作可以获得大量结晶。, 百拇医药
酶的发现是十九世纪(1833年)有人从麦芽浸液中提得第一个具有活力的蛋白质－－淀粉酶。到目前科学家们已从生物体内提纯确认出八百多种酶。但是应用到医药方面作为医药用的酶类制剂不过才有几十种。然而，祖国医药学对含酶类药物的记述确很早，如《药品化义》中记载：“大麦芽，炒香开胃，以除烦闷；生用力猛，主消麦面食积，症瘕气结，胸膈胀满，郁结痰涎，小儿伤乳，又能行上焦滞血。若女人气血壮盛，或产后无儿饮乳，乳房胀痛，丹溪用此二两，炒香捣去皮为末，分作四服立消，其性气之锐，散血行气，迅速如此，勿轻视之”。又如《本草蒙荃》中记载：牛肚“健脾胃，免饮积食伤”等等。由于受技术限制，而未能进一步提纯入药。但由此说明，酶类制剂与中药己早有渊源关系，现在我们讨论酶类制剂，也可认为是中药制剂的发展。
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酶类制剂的分类
酶制剂按其临床应用来分类，主要有以下几种：
消化类：这类酶研究最早，是品种最多的一类酶。它们的作用是消化和分解食物中各种成分，如淀粉、脂肪、蛋白质等使变成比较简单的物质，便利肠胃道的吸收。当体内消化系统失调，消化液分泌不足时，服用这一类酶就能够补充和纠正体内消化酶的不足，恢复正常消化机能。在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。
抗炎净创类：这一类酶是目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。这种酶大多数都是蛋白质水解酶，能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。在这一类酶中，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，α一淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。给药的方法有外敷、喷雾、灌注、注射、口服等。它们可以单独使用，也可以与抗菌素等合用，治疗各种溃疡、炎症、血肿、脓胸、肺炎、支气管扩张、气喘等症。
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血凝和解凝类：这一类酶都是从血液中提取出来的，有的能促使血液凝固，有的却能溶解血块。凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品……
治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。
解毒类：这一类酶的主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等。青霉素酶能够分解青霉素分子中的β一内酰胺环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应。
诊断类：这一类酶是用作临床上各种生化检查的试剂，帮助临床诊断。最常用的有葡萄糖氧化酶，β一葡萄糖苷酸酶和尿素酶。如尿素酶是测定血液中尿素的浓度和尿中尿素的含量的，从而可检查肾功能。
酶制剂的一般提取方法:
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酶的制备一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和结晶(或制剂)。首先将所需要的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地要夹带着一些杂质，而后再将酶从溶液中选择地分离出来，或者从酶溶液中选择地除去杂质，最后制成纯净的酶制剂。
1)酶的提取
胞外酶可以直接进行提取分离；胞内游离存在的“离酶”以及与颗粒体(如细胞核、线粒体、微粒体、质膜)结合的“结酶”都有一个破碎细胞过程，“结酶”还有一个转变成水溶液的问题。因此对酶类的提取要采用多种方法，常用的细胞破碎法如下：
机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。
化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用；用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。
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酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。而用纯的工具酶降解法是无此缺点，但成本较高。
冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。
酶的提取溶剂可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等；也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。溶剂用量一般为原料重量的1～5倍。搅拌可加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。多数酶的提取要在50C以下操作，但有的酶在较高温度下提取更好，如胃蛋白酶在450C提得收率较高，一般可在一5～＋400C间适当选择。提取液的pH应在酶的稳定pH范围内，并应远离其等电点的pH为宜，如蛋白酶选用pH
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2.5～3，0，胰蛋白酶和α一糜蛋白酶则用0.25 N硫酸提取。若在中性或碱性提取时，最常用的是0.15 mol/L氯化钠、0.02～0.05mol/L磷酸缓冲液、0.02-0.05
mol/L焦磷酸缓冲液。正丁醇的亲脂性强，能透入酶的脂质结合物中，又兼有亲水性，有类似表面活性剂的作用，适用于提取“结酶”。
为了减少提取液体积，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分离可用过滤法(如板框压滤、旋转真空过滤)或离心法。过滤时可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。离心时可加入氢氧化铝凝胶、磷酸钙凝胶等以除去悬浮的胶体物质。
2)酶液的浓缩
提取的酶液为减少纯化操作容积，通常先进行浓缩。工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。对于少量酶液下述方法浓缩更合适：
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用葡聚糖凝胶(分子筛)浓缩：取相当于酶液量1/5的干葡聚糖凝胶G15或G25，分次加入酶液中，搅拌30
min，使凝胶吸水膨胀，进行吸滤。经重复数次操作即可在短时间内把酶液浓缩至所需的体积。也可将酶液装于透析袋内，埋入干凝胶中，袋内酶液也可得到浓缩。
用聚乙二醇浓缩：将稀酶液装入透析袋内，袋外复以聚乙二醇，袋内水份被袋外的聚乙二醇所吸收，在短时间内可以达到浓缩的目的，得到所需的浓酶液。
用超滤法浓缩：超滤技术在其可筛分范围内分离酶分子时不发生“相态”变化，可以避免酶蛋白变性，且分离度快，所以愈来愈被广泛采用。各种不同孔径的超滤膜，适用于实验室规模及一定工业规模的酶液浓缩。如国产二醋酸纤维素制成10～200埃孔径的超滤膜，用于实验室规模固氮酶液的脱盐和浓缩，效果良好。
3)杂质的去除
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酶提取液中常含有杂蛋白、多糖、脂类及核酸等杂质，可用下述方法去除：
调PH和加热法：利用蛋白质对酸、碱和热变性方面性质的差异，可去除非活性杂蛋白。如制备脂肪酶时，在pH
3、4时以400C温度加热150 min，淀粉酶活力可丧失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80%以上。
蛋白质表面变性法：蛋白质表面变性后其性质有所不同，借以去除杂蛋白。如制备过氧化氢酶时，加入氯仿和乙醇进行振荡可以将杂蛋白变性而去除。。
蛋白质沉淀剂法：利用醋酸铝、利凡诺、单宁酸、离子型表 面活性剂等蛋白质沉淀剂可以去除杂蛋白及粘多糖类杂质。使用时要注意这类试剂常可引起酶变性失活，因此应迅速除去。
选择性变性法：各种蛋白质对变性剂的稳定性不同，可以用选择性变性剂去除杂蛋白。如细胞色素丙对三氯醋酸较稳定，所以在制备时可用2.5%三氯醋酸使其他杂蛋白变性使
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沉淀除去。。
加保护剂热变性法：酶与底物或竞争性抑制剂结合后，其稳定性常显著增加。所以常用它们为保护剂，再用一些剧烈手段破坏杂蛋白，如用D-甲基苯甲酸为D-氨基酸氧化酶的保护剂，经加热除去杂蛋白，使该酶得到很好的提纯。
核酸沉淀剂法：酶液中的核酸类杂质，可以用氯化锰、鱼精蛋白硫酸盐等沉淀剂使其沉淀而除去。必要时，也可用核糖核酶将核酸降解后除去。
4)酶的纯化
酶是蛋白质，因此凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化，如盐析法、聚乙二醇沉淀法、有机浴剂分级沉淀法、等电点法、选择性沉淀法、各种柱层析法(吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤)、各种电泳法及亲和层析等。不同之处是酶的纯化过程尚需选用迅速简便的活力测定方法，以追踪酶的去向。在选用酶的活力测定方法时，分析方法的迅速要比其精确度更为重要。如宁可要一个需时5min，准确度为5%的方法；也不要一个需时30
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min，准确度为0.5%的方法。在建立活力测定法之后，再根据各单元纯化步骤及活力分布情况用列表形式表达，表的内容包括：操作步骤、总体积、酶浓度(每毫升酶活力)、总活力、蛋白质浓度mg/ml)、比活力(即纯度、酶活力单位/毫克蛋白)、产率%(每步总活力除以第一步的总活力)和纯化倍数(每步比活力除以第一步比活力)。
一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作，各单元操作如何串联，需靠实践摸索。每经过一个步骤一般可提高酶纯度2一3倍，总纯度可提高数千倍，而总产率常仅百分之几或十几。总的原则是选用最少的步骤而能取得最好的纯化效果、因为增加步骤势必增加酶的丢失。通常对于含盐浓度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用盐析法；对于低离子强度的酶溶液则可用吸附法或离子交换法。交替使用不同分级沉淀法常比单独重复同一类型方法更能奏效。所以常将吸附法、盐折法和有机溶剂分级沉淀法串联起来进行纯化。当这些方法仍达不到要求时，还可以采用一些包括电泳、层析法在内的其他类型纯化方法。
当酶达到一定纯度时，便可以进行结晶，结晶也是纯化酶的有效手段之一。但应注意的是药用酶有些并不需要结晶。酶的第一次结晶纯度有时仍低于50%。酶的结晶通常可以在较纯的酶液中添加硫酸铵、氯化钠等盐达到一定饱和度，使酶慢慢结晶出来。此时必须控制温度和pH值。盐浓度要逐渐提高，添加速度要慢，才能得到较好的结晶。有时在低温下，用丙酮、乙醇等有机溶剂进行结晶。近年来采用平衡透析法，即将酶液装人透析袋中，置于一定饱和度的盐溶液中进行透折，这种操作可以获得大量结晶。, 百拇医药
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