第五节免疫复合物的检测
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《免疫学和免疫学检验》
免疫复合物在体内存在有两种方式，一是存在于血液中的循环免疫复合物(CIC)，一是组织中固定的免疫复合物。免疫复合物的检测技术可分为抗原特异性方法和非抗原特异性方法。在大多数情况下，免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。
一、循环免疫复合物的检测
根据免疫复合物的物理学、免疫学和生物学特性，已经设计出很多检测CIC的方法(表24-4)，本章只述及常用的代表性方法。
表24-4 循环免疫复合物的常用检测方法
类别
原理
方法
敏感性
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备注
物理法
分子大小
1.超速离心
－
适于研究
2.分子超滤
－
适于研究
3.凝胶过滤
30μg
适于研究
溶解度
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1.PEG沉淀
20μg
粗定量,易推广
2.冷沉淀
－
定性,临床应用
补体法
固定补体,结合C1q
抗补体试验
0.1μg
常用,特异性差
1.C1q凝胶沉淀试验
, http://www.100md.com 100μg
定性,不易普及
2.C1q偏离试验
4μg
不易普及
3.液相法
10μg
不易普及
4.固相法
1μg
不易普及
胶固素
胶固素结合试验
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3μg
敏感,稳定
抗Ig法
结合RF
1.RF凝胶沉淀试验
100G
定性,不敏感
2.mRF固相抑制试验
1～20μg
不易普及
3.PRF凝集抑制试验
1～10μg
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不易普及
结合Ig
抗抗体法
2～3μg
不易普及
细胞法 Fc受体
1.血小板凝集试验
1～4μg
需新鲜制备
2.ADCC抑制试验
5～10μg
细胞活性质控难
, http://www.100md.com 3.Mφ吞噬抑制试验
0.03μg
细胞活性质控难
补体受体
1.Raji细胞法
6μg
需维持细胞株
2.花环抑制试验
10μg
影响因素多
(一)物理测定法
1．聚乙二醇法 聚乙二醇(PEG)是乙二醇聚合而成的无电荷形多糖分子，分子量变化范围较大，常用的分子量是6000。用3%～4%浓度的PEG可以选择性地将大分子免疫复合物沉淀下来，其作用机制尚不甚清楚。将PEG溶液与待检血清混合，置4℃冰箱过夜后离心，将沉淀物用PEG溶液充分洗涤，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波长280nm下测量溶液的吸光度；也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物；以不同浓度的热聚合IgG作为参考标准来计算CIC的含量。
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聚乙二醇法简单易行，可在临床工作中推广。但此法易受多种大分子蛋白和温度的干扰，特异性稍差。PEG法还特别适用于沉淀获得CIC，再进行解离分析其中的抗原与抗体。
2．冷球蛋白测定
在某些病理情况下，血清中的免疫复合物具有可逆性冷沉淀的特性，于4℃冰箱中放置1～3天可自发地沉淀下来(参见第二十六章)；此种情况多见于冷球蛋白血症，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、肿瘤相关抗原、肾小管上皮、甲状腺球蛋白、红细胞基质等，还有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒、牛白蛋白和马蛋白等。
(二)补体相关测定法 IgG和IgM类抗体与抗原结合后，重链CH2区的补体结合点暴露，可以固定C1q并激活补体的系列反应，这是利用补体有关技术检测免疫复合物的基础。
1．C1q结合试验 将待检血清先行加热56℃30min，以灭活其中的补体和破坏已与CIC结合的C1q，空出补体结合点。CIC与C1q的结合可用多种方法进行检测，常用的有以下3种。
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(1)液相法：先将同位素标记的C1q与灭活过的血清标本混合作用，再加入0.5%(终浓度)的PEG将结合了C1q的CIC沉淀下来，通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC的含量。
(2)固相法：先将C1q吸附于固相载体表面，加入待检血清使CIC与C1q结合，再加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA，最后检测其放射活性或酶活性。
(3)C1q偏离试验：先将同位素标记的C1q与灭活的血清标本混合，再加抗体致敏的绵羊红细胞，温育后离心，检测红细胞上的放射活性。红细胞的放射活性与免疫复合物的量呈负相关。
2．补体试验
本法的原理类似补体结合试验。将一定量的补体(多为混合豚鼠血清)与灭活的待检血清混合温育，反应后加入致敏绵羊红细胞。如出现溶血表示血清中没有CIC存在；不溶血说明标本中有CIC存在。将血清标本做不同稀释，并与已知的热聚合IgG作对照，可以计算出CIC的含量。本方法的灵敏度较高，且易于在一般实验室开展，不足之处是特异性较差。
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3．胶固素结合试验 胶固素(conglutinin)是牛血清中的一种正常蛋白，能与C3d特异性结合；体内与补体结合的CIC都带有C3d，因此胶固素可与CIC结合。用一定量的胶固素包被塑料管，往管中加入稀释的血清标本，温育后再加入同位素标记或酶标记的抗人IgG抗体，最后检测各管的放射活性或酶活性，计算CIC的含量。
胶固素性质稳定、容易保存、来源方便、价格便宜，检测方法也不复杂，便于推广。本法的不足是只能检出已结合补体的CIC，但不论何种激活途径都一样检出，并可用作CIC分离。
(三)抗球蛋白测定法
类风湿因子(RF)为抗IgG的自身抗体，与变性IgG、热聚合IgG和IC都有较强的亲和力。单克隆RF(mRF)可从待发性冷球蛋白血症的血清中提取，多克隆RF(pRF)可从类风湿性关节炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。
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1．mRF固相抑制试验 将mRF吸附于固相载体上，随后加入血清标本，再加入同位素标记的可溶性热聚合IgG。如果标本中含有IC，固相mRF已与IC结合，热聚合IgG与mRF的结合使被抑制，所以固相中的放射活性与CIC的含量呈负相关。
也可用同位素标记的mRF先与血清标本反应，再加入热聚合IgG附着的琼脂糖珠，温育并离心洗涤后测量沉淀物的放射强度，测定值与CIC的含量呈负相关。此法的敏感性比前法更高一些。
2．pRF胶乳凝集抑制试验 将pRF与血清标本混合，再加入IgG致敏的胶乳悬液。如果标本中有CIC存在，则pRF先与之结合，凝集反应呈阴性。
3．抗抗体法
抗抗体可存在于极个别的健康人血清中，是一种抗IgG F(ab＇)2的IgM类抗体，能与已结合抗原的IgG反应，但不与游离的IgG或热聚合IgG反应，因而特异性较高。先将抗抗体与待检血清混合，再加入IgG致敏的人O型Rh+红细胞；如标本中有CIC存在，抗抗体被中和，致敏红细胞不出现凝集。
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以上各种抗球蛋白试验以mRF法敏感性最高，但是mRF较难寻找。这类方法易受内源性RF的干扰，最好先行检查并除去标本中的内源性RF后再行试验。若遇标本中有聚合Ig，RF法也易出现假阴性；改用抗抗体法可避免这种现象，但是抗抗体的来源困难。
(四)细胞技术测定
有些细胞表面具有Fc受体和(或)补体受体，可与免疫复合物相应成分特异性结合，因而可用来对免疫复合物进行检测。
1．Raji细胞试验 Raji细胞是从Burkin淋巴瘤患者分离的一种B细胞株，表面有大量C1q、C3b和C3d受体，但无表面免疫球蛋白；因此Raji细胞能与带有补体的免疫复合物结合。先在塑料管中加处一定量的Raji，再加入待检血清，充分作用后离心洗涤；最后加入荧光素标记的抗人IgG，洗涤后细胞表面显现荧光为试验阳性；但荧光法只能做定性检测。或加入同位素标记的抗人IgG，离心洗涤后检测沉淀细胞的放射活性；以热聚合IgG作参考标准，可绘制出CIC含量与放射活性的标准曲线，从而求得待测标本中CIC的含量。 Raji细胞法敏感性高、特异性强、方法简单、不受DNA与内毒素的影响；但Raji细胞表面还有Fc受体，因此被检血清中的游离IgG通过Fc段与Raji细胞结合，造成假阳性。在待检标本中有抗淋巴细胞抗体时也可导致假阳性。再则，维持Raji细胞的培养较困难，培养条件的变化可改变Raji细胞表面受体的数目及亲和性，影响检测敏感性。
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2．人红细胞法 人红细胞表面具有C3b受体，可与带有补体成分的CIC相结合。将待检血清与4%的人O型红细胞悬液等量混合，37℃温育后离心洗涤；加入同位素标记的抗人IgG抗体，再温育洗涤后测定红细胞的放射活性；以热聚合IgG作参考标准计算出标本中CIC含量。但该法只能检测已结合补体的CIC。
其他细胞法如血小板凝集试验、玫瑰花环形成抑制试验、ADCC抑制试验、巨噬细胞吞噬抑制试验和中性粒细胞游走抑制试验等，也都可用来检测CIC，方法的敏感性也都很高，但这些方法的影响因素多，可重复性差，所以实际中工作并不多用。
(五)免疫复合物的成分检测
免疫复合物中抗原和抗体的性质及各类的检测对临床诊治疾病及深入研究疾病的免疫病理机制有一定价值。但是由于所涉及的抗原种类很多，例如病原微生物、自身物质、各类同种抗原等，检测方法可分别参见各种抗原的检测技术。免疫复合物中的抗体主要涉及IgG及其亚类、IgM和IgA；方法是将血清中免疫复合物分离出来，再用双抗体ELISA夹心法等方法分析抗体的类别。
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循环免疫复合物的理想检测方法应具备以下特点：①敏感性高，②特异性强，可重复性好，④操作简便，⑤适用面广。目前检测免疫复合物的方法虽发展到几十种，但还没有一种方法具备上述所有的特点，综合相比之下，C1q结合试验、胶固素结合试验、Raji细胞试验和RF抑制试验等方法比较好些。如果方法得当、试剂合格、标本新鲜、操作小心、分析谨慎、CIC测定就会有较大的参考价值。
二、组织固定免疫复合物的检测
确定免疫复合物病的直接证据不是检出CIC，而是在病变部位查到固定的IC沉积。在一些自身免疫病和免疫复合物病，例如系统性红斑狼疮、部分肾小球肾炎、类风湿性关节炎、结节性多动脉炎和寻常型天疱疮等，组织沉积免疫复合物的检出对疾病的诊断和发病机制的研究都比CIC的检出更有意义。
检测组织沉淀免疫复合物常用免疫组织化学技术，首先从适当的病理部位采取组织标本做冰冻切片，用荧光标记物的抗人IgG或抗人C3染色，在荧光显微镜下见到相应部位显示荧光为阳性反应(详见第十七章)；也可用酶标抗人IgG或抗人C3与标本切片反应，再用酶的底物溶液显色，用普通生物显微镜即可观察到相应部位被染色(详见第十五章)。
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三、免疫复合物检测的意义及应用
判定免疫复合物为发病机制的证据有三：①病变局部有IC沉积；②CIC水平显著升高；③明确IC中的抗原性质。第三条证据有时很难查到，但至少要具备前两条，单独CIC的测定不足为凭。人体在健康状态下也存在少量的CIC(大约10～20μg/ml)，其生理与病理的界限不易区分。另外，CIC检测的方法太多，其原理各不相同，用一种方法测定为阳性，另一种方法检测可能为阴性；但与免疫组化法一起检测，其意义就大得多。
目前已经明确系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、部分肾小球肾炎和血管炎等疾病为免疫复合物病，CIC检测对这些疾病仍是一种辅助诊断指标，对判断疾病活动和治疗效果也有一定意义。在发现紫癜、关节痛、蛋白尿、血管炎和浆膜炎等情况时，可考虑免疫复合物病的可能性，进行CIC和组织沉积IC的检测。另外，患有恶性肿瘤时CIC检出率也增高，但不出现Ⅲ型变态反应的损伤症状，称之为临床隐匿的IC病，然而这种状态常与肿瘤的病情和预后相关。, 百拇医药
一、循环免疫复合物的检测
根据免疫复合物的物理学、免疫学和生物学特性，已经设计出很多检测CIC的方法(表24-4)，本章只述及常用的代表性方法。
表24-4 循环免疫复合物的常用检测方法
类别
原理
方法
敏感性
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备注
物理法
分子大小
1.超速离心
－
适于研究
2.分子超滤
－
适于研究
3.凝胶过滤
30μg
适于研究
溶解度
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1.PEG沉淀
20μg
粗定量,易推广
2.冷沉淀
－
定性,临床应用
补体法
固定补体,结合C1q
抗补体试验
0.1μg
常用,特异性差
1.C1q凝胶沉淀试验
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定性,不易普及
2.C1q偏离试验
4μg
不易普及
3.液相法
10μg
不易普及
4.固相法
1μg
不易普及
胶固素
胶固素结合试验
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3μg
敏感,稳定
抗Ig法
结合RF
1.RF凝胶沉淀试验
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定性,不敏感
2.mRF固相抑制试验
1～20μg
不易普及
3.PRF凝集抑制试验
1～10μg
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结合Ig
抗抗体法
2～3μg
不易普及
细胞法 Fc受体
1.血小板凝集试验
1～4μg
需新鲜制备
2.ADCC抑制试验
5～10μg
细胞活性质控难
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0.03μg
细胞活性质控难
补体受体
1.Raji细胞法
6μg
需维持细胞株
2.花环抑制试验
10μg
影响因素多
(一)物理测定法
1．聚乙二醇法 聚乙二醇(PEG)是乙二醇聚合而成的无电荷形多糖分子，分子量变化范围较大，常用的分子量是6000。用3%～4%浓度的PEG可以选择性地将大分子免疫复合物沉淀下来，其作用机制尚不甚清楚。将PEG溶液与待检血清混合，置4℃冰箱过夜后离心，将沉淀物用PEG溶液充分洗涤，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波长280nm下测量溶液的吸光度；也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物；以不同浓度的热聚合IgG作为参考标准来计算CIC的含量。
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聚乙二醇法简单易行，可在临床工作中推广。但此法易受多种大分子蛋白和温度的干扰，特异性稍差。PEG法还特别适用于沉淀获得CIC，再进行解离分析其中的抗原与抗体。
2．冷球蛋白测定
在某些病理情况下，血清中的免疫复合物具有可逆性冷沉淀的特性，于4℃冰箱中放置1～3天可自发地沉淀下来(参见第二十六章)；此种情况多见于冷球蛋白血症，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、肿瘤相关抗原、肾小管上皮、甲状腺球蛋白、红细胞基质等，还有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒、牛白蛋白和马蛋白等。
(二)补体相关测定法 IgG和IgM类抗体与抗原结合后，重链CH2区的补体结合点暴露，可以固定C1q并激活补体的系列反应，这是利用补体有关技术检测免疫复合物的基础。
1．C1q结合试验 将待检血清先行加热56℃30min，以灭活其中的补体和破坏已与CIC结合的C1q，空出补体结合点。CIC与C1q的结合可用多种方法进行检测，常用的有以下3种。
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(1)液相法：先将同位素标记的C1q与灭活过的血清标本混合作用，再加入0.5%(终浓度)的PEG将结合了C1q的CIC沉淀下来，通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC的含量。
(2)固相法：先将C1q吸附于固相载体表面，加入待检血清使CIC与C1q结合，再加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA，最后检测其放射活性或酶活性。
(3)C1q偏离试验：先将同位素标记的C1q与灭活的血清标本混合，再加抗体致敏的绵羊红细胞，温育后离心，检测红细胞上的放射活性。红细胞的放射活性与免疫复合物的量呈负相关。
2．补体试验
本法的原理类似补体结合试验。将一定量的补体(多为混合豚鼠血清)与灭活的待检血清混合温育，反应后加入致敏绵羊红细胞。如出现溶血表示血清中没有CIC存在；不溶血说明标本中有CIC存在。将血清标本做不同稀释，并与已知的热聚合IgG作对照，可以计算出CIC的含量。本方法的灵敏度较高，且易于在一般实验室开展，不足之处是特异性较差。
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3．胶固素结合试验 胶固素(conglutinin)是牛血清中的一种正常蛋白，能与C3d特异性结合；体内与补体结合的CIC都带有C3d，因此胶固素可与CIC结合。用一定量的胶固素包被塑料管，往管中加入稀释的血清标本，温育后再加入同位素标记或酶标记的抗人IgG抗体，最后检测各管的放射活性或酶活性，计算CIC的含量。
胶固素性质稳定、容易保存、来源方便、价格便宜，检测方法也不复杂，便于推广。本法的不足是只能检出已结合补体的CIC，但不论何种激活途径都一样检出，并可用作CIC分离。
(三)抗球蛋白测定法
类风湿因子(RF)为抗IgG的自身抗体，与变性IgG、热聚合IgG和IC都有较强的亲和力。单克隆RF(mRF)可从待发性冷球蛋白血症的血清中提取，多克隆RF(pRF)可从类风湿性关节炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。
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1．mRF固相抑制试验 将mRF吸附于固相载体上，随后加入血清标本，再加入同位素标记的可溶性热聚合IgG。如果标本中含有IC，固相mRF已与IC结合，热聚合IgG与mRF的结合使被抑制，所以固相中的放射活性与CIC的含量呈负相关。
也可用同位素标记的mRF先与血清标本反应，再加入热聚合IgG附着的琼脂糖珠，温育并离心洗涤后测量沉淀物的放射强度，测定值与CIC的含量呈负相关。此法的敏感性比前法更高一些。
2．pRF胶乳凝集抑制试验 将pRF与血清标本混合，再加入IgG致敏的胶乳悬液。如果标本中有CIC存在，则pRF先与之结合，凝集反应呈阴性。
3．抗抗体法
抗抗体可存在于极个别的健康人血清中，是一种抗IgG F(ab＇)2的IgM类抗体，能与已结合抗原的IgG反应，但不与游离的IgG或热聚合IgG反应，因而特异性较高。先将抗抗体与待检血清混合，再加入IgG致敏的人O型Rh+红细胞；如标本中有CIC存在，抗抗体被中和，致敏红细胞不出现凝集。
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以上各种抗球蛋白试验以mRF法敏感性最高，但是mRF较难寻找。这类方法易受内源性RF的干扰，最好先行检查并除去标本中的内源性RF后再行试验。若遇标本中有聚合Ig，RF法也易出现假阴性；改用抗抗体法可避免这种现象，但是抗抗体的来源困难。
(四)细胞技术测定
有些细胞表面具有Fc受体和(或)补体受体，可与免疫复合物相应成分特异性结合，因而可用来对免疫复合物进行检测。
1．Raji细胞试验 Raji细胞是从Burkin淋巴瘤患者分离的一种B细胞株，表面有大量C1q、C3b和C3d受体，但无表面免疫球蛋白；因此Raji细胞能与带有补体的免疫复合物结合。先在塑料管中加处一定量的Raji，再加入待检血清，充分作用后离心洗涤；最后加入荧光素标记的抗人IgG，洗涤后细胞表面显现荧光为试验阳性；但荧光法只能做定性检测。或加入同位素标记的抗人IgG，离心洗涤后检测沉淀细胞的放射活性；以热聚合IgG作参考标准，可绘制出CIC含量与放射活性的标准曲线，从而求得待测标本中CIC的含量。 Raji细胞法敏感性高、特异性强、方法简单、不受DNA与内毒素的影响；但Raji细胞表面还有Fc受体，因此被检血清中的游离IgG通过Fc段与Raji细胞结合，造成假阳性。在待检标本中有抗淋巴细胞抗体时也可导致假阳性。再则，维持Raji细胞的培养较困难，培养条件的变化可改变Raji细胞表面受体的数目及亲和性，影响检测敏感性。
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2．人红细胞法 人红细胞表面具有C3b受体，可与带有补体成分的CIC相结合。将待检血清与4%的人O型红细胞悬液等量混合，37℃温育后离心洗涤；加入同位素标记的抗人IgG抗体，再温育洗涤后测定红细胞的放射活性；以热聚合IgG作参考标准计算出标本中CIC含量。但该法只能检测已结合补体的CIC。
其他细胞法如血小板凝集试验、玫瑰花环形成抑制试验、ADCC抑制试验、巨噬细胞吞噬抑制试验和中性粒细胞游走抑制试验等，也都可用来检测CIC，方法的敏感性也都很高，但这些方法的影响因素多，可重复性差，所以实际中工作并不多用。
(五)免疫复合物的成分检测
免疫复合物中抗原和抗体的性质及各类的检测对临床诊治疾病及深入研究疾病的免疫病理机制有一定价值。但是由于所涉及的抗原种类很多，例如病原微生物、自身物质、各类同种抗原等，检测方法可分别参见各种抗原的检测技术。免疫复合物中的抗体主要涉及IgG及其亚类、IgM和IgA；方法是将血清中免疫复合物分离出来，再用双抗体ELISA夹心法等方法分析抗体的类别。
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循环免疫复合物的理想检测方法应具备以下特点：①敏感性高，②特异性强，可重复性好，④操作简便，⑤适用面广。目前检测免疫复合物的方法虽发展到几十种，但还没有一种方法具备上述所有的特点，综合相比之下，C1q结合试验、胶固素结合试验、Raji细胞试验和RF抑制试验等方法比较好些。如果方法得当、试剂合格、标本新鲜、操作小心、分析谨慎、CIC测定就会有较大的参考价值。
二、组织固定免疫复合物的检测
确定免疫复合物病的直接证据不是检出CIC，而是在病变部位查到固定的IC沉积。在一些自身免疫病和免疫复合物病，例如系统性红斑狼疮、部分肾小球肾炎、类风湿性关节炎、结节性多动脉炎和寻常型天疱疮等，组织沉积免疫复合物的检出对疾病的诊断和发病机制的研究都比CIC的检出更有意义。
检测组织沉淀免疫复合物常用免疫组织化学技术，首先从适当的病理部位采取组织标本做冰冻切片，用荧光标记物的抗人IgG或抗人C3染色，在荧光显微镜下见到相应部位显示荧光为阳性反应(详见第十七章)；也可用酶标抗人IgG或抗人C3与标本切片反应，再用酶的底物溶液显色，用普通生物显微镜即可观察到相应部位被染色(详见第十五章)。
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三、免疫复合物检测的意义及应用
判定免疫复合物为发病机制的证据有三：①病变局部有IC沉积；②CIC水平显著升高；③明确IC中的抗原性质。第三条证据有时很难查到，但至少要具备前两条，单独CIC的测定不足为凭。人体在健康状态下也存在少量的CIC(大约10～20μg/ml)，其生理与病理的界限不易区分。另外，CIC检测的方法太多，其原理各不相同，用一种方法测定为阳性，另一种方法检测可能为阴性；但与免疫组化法一起检测，其意义就大得多。
目前已经明确系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、部分肾小球肾炎和血管炎等疾病为免疫复合物病，CIC检测对这些疾病仍是一种辅助诊断指标，对判断疾病活动和治疗效果也有一定意义。在发现紫癜、关节痛、蛋白尿、血管炎和浆膜炎等情况时，可考虑免疫复合物病的可能性，进行CIC和组织沉积IC的检测。另外，患有恶性肿瘤时CIC检出率也增高，但不出现Ⅲ型变态反应的损伤症状，称之为临床隐匿的IC病，然而这种状态常与肿瘤的病情和预后相关。, 百拇医药