第二节 常见的肿瘤标志物及其应用评价
http://www.100md.com
《临床生物化学和生物化学检验》
肿瘤标志物经过一百多年的发展历史,尽管至今为止,具有明确诊断作用的标志物不是很多,但有不少标志物经过临床实践已被大家熟悉和应用。
一、肿瘤胚胎性抗原标志物
在人类发育过程中,许多原本只在胎盘期才具有蛋白类物质,应随胎儿的出生而逐渐停止合成和分泌,但因某种因素的影响,特别是肿瘤状态时,会使得机体一些“关闭”的基因激活,出现了返祖现象,而重新开启并重新生成和分泌这些胚胎、胎儿期的蛋白(表8-3)。
表8-3 胚胎类肿瘤标志物
名称
性质
相关肿瘤
甲胎蛋白
糖蛋白70ku
肝细胞、胚细胞(非精原细胞瘤)
β-癌胚抗原
80ku
结肠
癌胚铁蛋白
糖蛋白600ku
肝
癌胚抗原
糖蛋白22ku
结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺
胰癌胚抗原
糖蛋白40ku
胰腺
鳞状细胞抗原
糖蛋白44-48ku
肺、皮肤、头和颈部
组织多肽抗原
细胞角蛋白8.18.19
乳腺、结肠
这类蛋白虽然与肿瘤组织不一定都具有特定的相关性,但与肿瘤的发生存在着内在的联系,故被作为一种较为常见的肿瘤标志物。
(一)癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)
癌胚抗原是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的,CEA是一种分子量为22ku的多糖蛋白复合物,45%为蛋白质。CEA的编码基因位于19号染色体。一般情况下,CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝的细胞所合成,通常在妊娠前6个月内CEA含量增高,出生后血清中含量已很低下,健康成年人血清中CEA浓度小于2.5μg/L。 CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原,分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器,如胃肠道、呼吸道、泌尿道等。正常情况下,CEA经胃肠道代谢,而肿瘤状态时的CEA则进入血和淋巴循环,引起血清CEA异常增高,使上述各种肿瘤患者的血清CEA均有增高。在临床上,当CEA大于60μg/L时,可见于结肠癌、直肠癌、胃癌和肺癌。CEA值升高,表明有病变残存或进展。如肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌患者血清CEA量会明显升高,大多显示为肿瘤浸润,其中约70%为转移性癌。一般来说,手术切除后6周,CEA水平恢复正常,否则提示有残存肿瘤,若CEA浓度持续不断升高,或其数值超过正常5-6倍者均提示预后不良。连续随访定量检测血清CEA含量,对肿瘤病情判断更具有意义。
有报道在胃肠道恶性肿瘤患者体内存在着CEA的异质体,经等电聚焦电泳检测可显示8-12个CEA峰,已知其中三个峰为癌特异峰,称CEA-S,其余可能属于正常的结肠交叉反应抗原簇或致癌过程中的其它过量产物。
除血液之外,其它生物液体,如胰液和胆汁内CEA定量可用于诊断胰腺或胆道癌;浆液性渗出液的CEA定量可作为细胞学检查的辅助手段;尿液CEA定量可作为判断膀胱癌预后的参考。血清CEA定量结合甲状腺降钙素测定,有助于甲状腺髓样癌的诊断和复发的估计。
(二)甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)
甲胎蛋白是1956年Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种专一性的甲种球蛋白。1963年G. I. Abelev首先发现AFP主要是由胎盘层其次是卵黄囊合成,胃肠道粘膜和肾脏合成较少。1964年Tatarinov发现肝细胞癌患者血清中检测到AFP。AFP是一种在电场中泳动于α-球蛋白区的单一多聚体肽链的糖蛋白,其分子量平均为70ku,含糖4%,AFP的编码基因位于4号染色体4q11-12,与血清白蛋白、维生素D结合蛋白同属一大家族。近年来已发现了AFP的异质体。妊娠的妇女的血和尿中的AFP含量会持续增高,从妊娠6周开始合成,至12-15周达高峰。胎儿血浆中的AFP值可达到3mg/ml,随后即逐渐降低,出生后,AFP合成很快受抑制,其含量降至50μg/L,周岁末婴儿的浓度接近成人水平,一般健康成人血浆AFP浓度低于25μg/L。 AFP是原发性肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志,血清AFP测定结果大于500μg/L以上,或含量有不断增高者,更应高度警惕。肝癌患者血清AFP含量变化的速率和程度与肿瘤组织分化程度高低有一定相关性,分化程度较高的肿瘤AFP含量常大于200μg/L。
检测AFP的免疫学方法主要有免疫扩散电泳(火箭电泳)、γ-射线计数125I标记检测法和定性、定量酶免疫方法。用不同的植物凝集素可以检测和鉴别不同组织来源的AFP的异质体。如用小扁豆凝集素(LCA)亲和交叉免疫电泳自显影法,可以检测LCA结合型AFP异质体。
血清AFP含量的检测对其它肿瘤的监测亦有重要临床价值。如睾丸癌、畸胎瘤、胃癌、胰腺癌等患者血清AFP含量可以升高。某些非恶性肝脏病变,如病毒性肝炎、肝硬化,AFP水平亦可升高,故必须通过动态观察AFP含量和ALT酶活性的变化予以鉴别诊断。
(三)胰胚胎抗原(pancreatic oncofetal antigen,POA)
胰胚胎抗原是1974年Banwo等人自胎儿胰腺抽提出的抗原,1979年被国际癌症生物学和医学会正式命名。POA是一种糖蛋白,分子量为40ku,在血清中以分子量900ku复合形式存在,但可降解为40ku。正常人群血清中RIA法测定小于7ku/L。
胰腺癌的POA的阳性率为95%,其血清含量大于20ku/L,当肝癌、大肠癌、胃癌等恶性肿瘤时也会使POA升高,但阳性率较低。
二、糖类抗原标志物
肿瘤标志物相关物质是指由肿瘤细胞表面的抗原物质或者是肿瘤细胞所分泌的物质,这类物质又是单克隆抗体,故又称为糖类抗原(carbohydrate antigen,CA)。这类标志物出现为临床肿瘤的诊断带来方便,糖类抗原标志物产生又可分为两大类,为高分子粘蛋白类(表8-4)和血型类抗原(表8-5)。
表8-4 糖类高分子粘蛋白抗原肿瘤标志物
名称
性质
癌肿
常用单克隆抗体 CA125
糖蛋白>200ku
卵巢、子宫内膜 OC125 CA15-3
糖蛋白400ku
乳腺、卵巢 DF3和115D3 CA549
高分子量糖蛋白
乳腺、卵巢 BC4E549 BC4n154 CA27.29
高分子量糖蛋白
乳腺 B27.29
类粘蛋白
糖蛋白350ku b-12
肿瘤相关抗原 DU-PAN-2
粘蛋白100-500ku
胰腺、卵巢、胃 DU-PAN-2
表8-5 血型类抗原肿瘤标志物
名称
性质
癌肿
常用单克隆抗体 CA19-9
唾液酸化Lexa
胰腺、胃肠、肝
116NS19-9 CA19-5
唾液酸化Lea和Leag
胃肠、卵巢
116NS19-5 CA50
唾液酸化Lea
胰腺、胃肠、结肠 Colo-50 CA72-4
唾液酸化Tn
卵巢、乳腺、胃肠、结肠 B27.3.cc49 CA242
唾液酸化CHO
结肠、直肠、胰腺 C242
鳞状细胞抗原
糖蛋白
子宫颈、肺、皮肤、头颈部 SCC
这类抗原标志物的命名是没有规律的,有些是肿瘤细胞株的编号,有些是抗体的物质编号,常用检测方法是单克隆抗体法,有的还同时用两种不同位点的单抗做成双位点固相酶免疫法,这些比一般化学法测定的特异性有很大的提高。而对一些糖类抗原的异质体,则通常用不同的植物凝集素来进行分离检测。
(一)CA125
1983年由Bast等从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白。分子量为200ku,加热至100℃时CA125的活性破坏,正常人血清CA125中的(RIA)阳性临界值为35ku/L。 CA125是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物,浆液性子宫内膜样癌、透明细胞癌、输卵管癌及未分化卵巢癌患者的CA125含量可明显升高。当卵巢癌复发时,在临床确诊前几个月便可呈现CA125增高,尤其卵巢癌转移患者的血清CA125更明显高于正常参考值。CA125测定和盆腔检查的结合可提高试验的特异性。动态观察血清CA125浓度有助于卵巢癌的预后评价和治疗控制,经治疗后,CA125含量可明显下降,若不能恢复至正常范围,应考虑有残存肿瘤的可能。95%的残存肿瘤患者的血清CA125浓度大于35kU/L。然而,CA125血清浓度轻微上升还见于1%健康妇女,3%-6%良性卵巢疾患或非肿瘤患者,包括孕期起始3个月、行经期、子宫内膜异位、子宫纤维变性、急性输卵管炎、肝病、胸腹膜和心包感染等。
(二)CA15-3 CA15-3是1984年Hilkens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的小鼠单克隆抗体(115-DB);1984年Kufu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体(DF-3),故被命名为CA15-3。CA15-3分子量为400ku,分子结构尚未清楚。正常健康者血清CA15-3含量(RIA法)小于28kU/L。
30%-50%是乳腺癌患者的CA15-3明显升高,它也是监测乳腺癌患者术后复发的最佳指标,当CA15-3大于100kU/L时,可认为有转移性病变,其含量的变化与治疗结果密切相关。肺癌、胃肠癌、卵巢癌及宫颈癌患者的血清CA15-3也可升高,应予以鉴别,特别要排除部分妊娠引起的含量升高。
(三)CA19-9 CA19-9是1979年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠,并与骨髓瘤杂交所得116NS19-9单克隆抗体,它是一种分子量为5000ku的低聚糖类肿瘤相关糖类抗原,其结构为Lea血型抗原物质与唾液酸Lexa的结合物。正常人群的CA19-9血清含量为(RIA法)2-16kU/L。 CA19-9是胰腺癌和结、直肠癌的标志物。血清CA19-9阳性的临界值为37kU/L。胰腺癌患者85%-95%为阳性。当CA19-9小于1000kU/L时,有一定的手术意义,肿瘤切除后CA19-9浓度会下降,如再上升,则可表示复发。结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也会很高,若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率。良性疾患时如胰腺炎和黄疸,CA19-9浓度也可增高,但往往呈“一过性”,而且其浓度多低于120kU/L,必须加以鉴别。
(四)CA50 CA50是1983年Lindholm等从抗人结、直肠癌Colo-205细胞株的一系列单克隆抗体中筛选出的一株对结、直肠癌有强烈反应,但不与骨髓瘤细胞及血淋巴细胞反应的单克隆抗体,所能识别的抗原称CA50。Ca50存在于细胞膜内,其抗原决定簇为唾液酸Lea血型物质与唾液酸-N-四氧神经酰胺。在正常人群,CA50血清浓度(RIA法)小于20kU/L。
一般认为,CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物,因CA50广泛存在胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫,当细胞恶变时,由于糖基转化酶的失活或胚胎期才能活跃的某些转化酶被激活,造成细胞表面糖类结构性质改变而形成CA50,因此,它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原,而不是特指某个器官的肿瘤标志物。所以在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率。1983年,建立了放射免疫分析法,1987年应用CA50单抗,在国内建立了IRMA技术用于肿瘤的早期诊断,胰腺癌、胆囊癌的阳性检测率达90%,对肝癌、胃癌、结直肠癌及卵巢肿瘤诊断亦有较高价值,在胰腺炎、结肠炎和肺炎发病时,CA50也会升高,但随炎症消除而下降。
三、酶类标志物
酶及同工酶是最早出现和使用的肿瘤标志物之一(表8-6)。肿瘤状态时,机体的酶活力就会发生较大变化,这是因为:①肿瘤细胞或组织本身诱导其它细胞和组织产生异常含量的酶;②肿瘤细胞的代谢旺盛,细胞通透性增加,使得肿瘤细胞内的酶进入血液,或因肿瘤使得某些器官功能不良,导致各种酶的灭活和排泄障碍;③肿瘤组织压迫某些空腔而使某些通过这些空腔排出的酶返流回血液。
在肿瘤标志酶中根据来源可将其分为两类:①组织特异性酶,因组织损伤或变化而使储存在细胞中的酶释放,如前列腺特异性抗原等;②非组织特异性酶,主要是肿瘤细胞代谢加强,
表8-6 酶类肿瘤标志物
名称
分子量及同工酶
相关肿瘤
醛缩酶
160ku
3个
肝
碱性磷酸酶
95ku
7个
骨、肝、白血病、肉瘤、卵巢等
淀粉酶
45ku
胰腺等
谷胱甘肽转移酶
80ku
多种
肝、胃、结肠
肌酸激酶
83ku
4个
前列腺、肺、结肠、卵巢等
γ-谷氨酰转移酶
90ku
12个
肝
乳酸脱氢酶
135ku
5个
肝、淋巴瘤、白血病
神经原特异性烯醇化酶
73ku
2个
肺(小细胞)、神经母细胞瘤、类癌、黑色素瘤、嗜铬细胞瘤
5-核苷酸酶
6区带
肝
α-L岩藻糖苷酶
230ku
8个
肝
核糖核酸酶
2个
卵巢、肺、大肠等
前列腺特异性抗原
34ku
前列腺
特别是无氧酵解增强,大量酶释放到血液中,如已糖激酶等。
在酶标志物分析中,同工酶的分辨和检出是提高标志物临床应用的重要的环节,从目前所知的肿瘤标志同工酶可分为三大类型:①异位型同工酶:指某种瘤组织改变了自己的分泌特性,而去分泌表达了其它成年组织的同工酶的类型;②胚胎型同工酶,某些组织在肿瘤状态时,使酶的同工酶谱退化到胚胎时未分化状态,而分泌出大量的胚胎期的同工酶,这种变化往往与肿瘤的恶性程度成正比;③胎盘型同工酶,有些肿瘤组织会分泌出某些原属胎盘阶段的同工酶谱。从目前的资料分析,这类胎盘型同工酶已达20余种。酶的活性变化常常与组织器官的损伤有密切关系。在机体中,能造成酶活性变化的因素太复杂,从而使在诊断肿瘤时特异性受到很大影响。
(一)前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)
1971年,Hara等首先发现PSA是由前列腺上皮细胞合成分泌至精液中,是精浆的主要成分之一;1979由Wang等从前列腺肥大症患者的前列腺组织中分离出来的丝氨酸蛋白酶,分子量34ku,编码基因定位于19q13,PSA仅存在于前列腺上皮细胞的胞质、导管上皮和粘液内,具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性,PSA在正常男性(RIA法、ElA法)含量小于2.5μg/L。 PSA是前列腺癌的特异性标志物,也是目前少数器官特异性肿瘤标志物之一。前列腺癌是男性泌尿系统的主要囊性肿瘤,血清PSA定量的阳性临界值为大于10μg/L,前列腺癌的诊断特异性达90%-97%。
血清PSA除了作为检测和早期发现前列腺癌,还可用于治疗后的监控,90%术后患者的血清PSA值可降至不能检出的痕量水平,若术后血清PSA值升高,提示有残存肿瘤。放疗后疗效显著者,50%以上患者在2个月内血清PSA降至正常。
(二)α-L岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase,AFU)
1980年由Deugnier等首先在3例原发性肝癌患者血清中发现AFU活性升高。AFU是存在于血清中的一种溶酶体酸性水解酶,分子量230ku,单个亚基分子量50ku。AFU正常参考值(化学法)为324±90μmol/L。 AFU是原发性肝癌的一种新的诊断标志物,广泛分布于人体组织细胞、血液和体液中,参与体内糖蛋白、糖脂和寡糖的代谢。原发性肝癌患者血清AFU活力显著高于其它各类疾患(包括良、恶性肿瘤)。虽然AFU升高的机制不甚明了,但可能有以下几种:①肝细胞和肿瘤细胞的坏死使溶酶体大量释放入血;②正常肝细胞的变性坏死可使摄取和清除糖苷酶的功能下降;③肿瘤细胞合成糖苷酶的功能亢进;④肿瘤细胞可能分泌某种抑制因子,抑制肝细胞对糖苷酶的清除能力或释放某些刺激因子,促进肝细胞或肿瘤细胞本身合成糖苷酶。总之,血清AFU活性升高可能是由多种因素综合作用的结果,是对原发性肝细胞性肝癌检测的又一敏感、特异的新标志物。
血清AFU活性动态曲线对判断肝癌治疗效果、估计预后和预报复发有着极其重要的意义,甚至优于AFP。但是,值得提出的是,血清AFU活力测定在某些转移性肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢或子宫癌之间有一些重叠,甚至在某些非肿瘤性疾患如肝硬化、慢性肝炎和消化道出血等也有轻度升高,在使用AFU时应与AFP同时测定,可提高原发性肝癌的诊断率,有较好的互补作用。
现发现AFU在用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳分析时存在8种不同等电点的同工酶,其范围在3.5-6.5之间,正常人的AFU同工酶有两种类型:低峰值型和Ⅳ主峰型。乙型肝炎患者出现3种AFU同工酶谱:Ⅷ主峰型,Ⅳ、Ⅷ双峰型和Ⅳ主峰、Ⅴ次峰型。原发性肝癌患者血清AFU同工酶变化复杂,有5种类型:低峰值型,Ⅳ、Ⅴ双峰型,Ⅲ、Ⅳ双峰型,Ⅴ型和Ⅵ型。根据各自的峰型特点,AFU同工酶对正常人、肝炎和原发性肝癌患者的鉴别诊断具有一定的临床应用价值。
(三)神经原特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)
烯醇化酶是催化糖原酵途径中甘油分解的最后的酶。由3个独立的基因片段编码3种免疫学性质不同的亚基α、β、γ,组成5种形式的同工酶αα、ββ、γγ、αγ、βγ。二聚体是该酶分子的活性形式,γ亚基同工酶存在于神经原和神经内分泌组织,称为NSE。α亚基同工酶定位于胶质细胞,称为非神经原特异性烯醇化酶(NNE)。NSE和NNE的分子量分别为78ku和87ku,正常参考范围为0.6-5.4μg/L。 NSE是神经母细胞瘤和小细胞肺癌的标记物。神经母细胞瘤是常见的儿童肿瘤,占1-14岁儿童肿瘤的8%-10%。NSE作为神经母细胞瘤的标志物,对该病的早期诊断具有较高的临床应用价值。神经母细胞瘤患者的尿中NSE水平也有一定升高,治疗后血清NSE水平降至正常。血清NSF水平的测定对于监测疗效和预报复发均具有重要参考价值,比测定尿液中儿茶酚胺的代谢物更有意义,小细胞肺癌(SCLC)是一种恶性程度高的神经内分泌系统肿瘤,约占肺癌的25%-30%,它可表现神经内分泌细胞的特性,有过量的NSE表达,比其它肺癌和正常对照高5-10倍以上。SCLC患者血清NSE检出的阳性率可高达65%-100%,目前已公认为NSE可作为SCLC高特异性、高灵敏性的肿瘤标志物,有报道,NSE水平与SCLC转移程度相关,但与转移的部位无关,NSE水平与其对治疗的反应性之间也有一个良好的相关性。
四、激素类标志物
激素是一类由特异的内分泌腺体或散在体内的分泌细胞所产生的生物活性物质,当这类具有分泌激素功能的细胞癌变时,就会使所分泌的激素量发生异常。常称这类激素为正位激素异常。而异位激素则是指在正常情况下不能生成激素的那些细胞,转化为肿瘤细胞后所产生的激素,或者是那些能产出激素的细胞癌变后,分泌出的是其它激素细胞所产生的激素(表8-7)。衡量异位激素的条件是:①有非内分泌腺细胞合成的激素;②某种内分泌细胞却分泌其他分泌腺细胞的激素;③肿瘤患者同时伴有分泌异常综合征;④这类肿瘤细胞在体外培养时也能产生激素;⑤肿瘤切除或经治疗肿瘤消退时,此种激素含量下降,内分泌综合征的症状改善。
表8-7 激素类肿瘤标志物
激素
性质
相关肿瘤
儿茶酚胺类
嗜铬细胞
促肾上腺皮质激素
4.5ku
库欣综合征、肺(小细胞)
抗利尿激素
肺(小细胞)、原发性类癌等
降钙素
3.5ku
甲状腺髓质
生长激素
21ku
垂体腺瘤、肾、肺 hGG
45ku
胚胎绒毛膜、睾丸(非精原细胞癌)
人胎盘催乳素
22ku
滋养层、性腺、肺、乳腺
甲状旁腺素
肝、肾、乳腺、肺等
催乳素
22ku
垂体腺瘤、肾、肺
胰高糖素
3ku
胰高糖素瘤、嗜铬细胞瘤
转化生长因子
鳞瘤、肾、乳腺
一般来讲,异位激素的化学本质与正位激素相似,不同类型的恶性肿瘤可分泌不同种类的异生性激素或分泌出同一种的激素,而同一种肿瘤细胞可分泌一种或多种不同的异生性激素。这给检查带来了难度,常见的可分泌异生性激素的恶性肿瘤是肺未分化小细胞癌、神经外胚层肿瘤及类癌等。根据肿瘤状态、机体内的激素含量的变化,观察这些激素动态变化,无疑会给临床诊断带来标志性的依据。
(一)降钙素(calcitonin,CT) CT是由甲状腺滤泡细胞C细胞合成、分泌的一种单链多肽激素,故又称甲状腺降钙素,是由32个氨基酸组成,分子量3.5ku。CT的前体物是一个由136个氨基酸残基组成大分子无活性激素原,分子量为15ku,可迅速水解成有活性的CT,人类CT的半寿期只有4-12min,正常情况下它的靶器官是骨、肾和小肠,主要作用是抑制破骨细胞的生长,促进骨盐沉积,增加尿磷,降低血钙和血磷。放射免疫测定为常用方法,正常参考值为小于100ng/L。
目前,甲状腺髓样癌患者的CT一定会升高,因为降钙素的半寿期较短,所以降钙素可作为观察临床疗效的标志物。
肺癌、乳腺癌、胃肠道癌以及嗜铬细胞瘤患者可因高血钙或异位分泌而使血清CT增加,另外,肝癌和肝硬化患者也偶可出现血清CT增高。
(二)人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonagotropin,hCG) hCG是由胎盘滋养层细胞所分泌的一类糖蛋白类激素,在正常妊娠妇女血中可以测出hCG。hCG有α、β两个亚基,α-亚基的分子量约为13000,α-亚基的生物特性与卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)的α-亚基相同。β-亚基的分子量约15000,β-亚基为特异性链,可被单克隆抗体检测,也是一个较好的标志物。在每个亚基上有两条N-糖链,其中3/4是复杂型双天线,1/4是以单天线的形式出现。由此决定了各类hCG激素的生物特性。通常情况下,尿中的hCG的总量(ELISA法)小于30μg/L,血清hCG小于10μg/L,β-hCG小于3.0μg/L。当胎盘绒毛膜细胞恶变为恶性葡萄胎后,hCG会明显增高,这时hCG糖链结构有部分转为三天线和四天线的结构。当发生绒毛膜上皮癌后,除有三、四天线外,还出现更为异常的偏二天线的糖链结构,而且这些异常糖链结构具有与曼陀罗凝集素(DSA)特异的亲和力。正常情况下,结合率为42.3%-72.4%,绒毛膜上皮癌的结合率为53.5%-87.1%。hCG还会在乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌增高。当子宫内膜异位症、卵巢囊肿等非肿瘤状态时,hCG也会增高。
(三)儿茶酚胺类及其衍生物
儿茶酚胺类激素是以其结构中均含儿茶酚又属于胺类而得名。正常情况下,它是由肾上腺髓质中的一些交感神经节纤维末梢终止髓质细胞(又称嗜铬细胞)产生和分泌,包括肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)等,它们既是激素又是神经递质。
⒈变肾上腺素(metanephrine)变肾上腺素是儿茶酚胺的甲氧化代谢产物,由于甲基化是在肝脏内微粒体中进行,而儿茶酚胺的形成都是在肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经末梢处形成,所以,从检测尿中的变肾上腺素浓度可间接地了解儿茶酚胺的分泌。
目前使用高效液相的紫外检测仍是最为有效的方法之一,正常值为0.30-1.50μmol/24h尿。变肾上腺素浓度增高是分泌型嗜铬细胞瘤的主要标志物,它比儿茶酚胺和香草扁桃酸更稳定。
⒉垂草扁桃酸(VMA)香草扁桃酸(3-甲氧-4羟苦杏仁酸,VMA)是肾上腺素和去甲肾上腺素经单胺氧化酶(MAO)和儿茶酚胺-0-甲基转移酶(COMT)的作用下,甲基化和脱氨基而产生的降解产物。VMA主要是从尿中排出。
高效液相电化学检测是常用的方法,正常参考值随年龄增长而增加,成人为5.0-35.0μmol/24h尿。
能合成儿茶酚胺类的肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经细胞末梢,均源于胚胎期神经嵴,这两种组织含有相同的酶。一旦这类组织增殖,则尿中VMA就会增高,所以它常被认为是神经母细胞瘤、神经节瘤和嗜铬细胞瘤的标志物。
约有70%神经母细胞瘤的患者均有VMA增高,在IV期神经瘤患者VMA/HVA的比值可作为预后评价指标,在儿童的神经母细胞瘤患者中,VMA也是一项重要指标。 VMA又可作为嗜铬细胞瘤的诊断首选标志物,但有时增高程度不稳定,宜同时测定尿中儿茶酚胺和变肾上腺素。
⒊高香草酸(HVA)高香草酸(3-甲氧-4-羟苯乙酸,HVA)是多巴胺的主要代谢产物,儿茶酚在肝脏内经羧化和氨基氧化而成。
常采用高效液相电化学检测方法,正常参考值与VMA相似,也随年龄增长而增加,成人为15-40μmol/24h尿。尿中HVA增加与多巴合成量有关。在神经母细胞瘤、儿童交感神经肿瘤时,常选用HVA作为诊断和随访的一种主要的标志物。
五、其它蛋白质类标志物
蛋白质肿瘤标志是最早发现的标志物(表8-8)。在现有的标志物中,如β2微球蛋白、免疫球蛋白。一般来讲这类标志物特异性稍差,但检测方法相对比较容易,常作常规检测项目。
表8-8 蛋白质类肿瘤标志物
名 称
性 质
相关肿瘤
β2-微球蛋白
12ku
多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、Waldenstrom’s巨球蛋白血症 C多肽
3.6ku
胰岛素瘤
铁蛋白
450ku
肝、肺、乳腺、白血病
本周蛋白
22.5-45ku
游离轻链病、多发性骨髓病
免疫球蛋白
160-900ku
多发性骨髓瘤、淋巴瘤
铜蓝蛋白
126-160ku
肝、胃肠、胰腺
甲状腺球蛋白
670ku
甲状腺癌
(一)β2-微球蛋(β2-microglobulin。β2m)
β2m由Berggard和Bearn于1996年从肾脏患者尿中分离出的一种蛋白质,由于它的分子量仅为1.2ku,电泳时显于β2m区带,故被命名为β2-微球蛋白。β2m是人体有核细胞产生的一种由100个氨基酸残基组成的单链多肽低分子蛋白。β2m血中含量(RIA、EIA法)正常参考范围为3.1±0.96mg/L,尿β2m为0.31±0.34mg/L;脑脊液β2m为1.27±0.11mg/L。
β2m是恶性肿瘤的辅助标志物,也是一些肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原。β2m是人类白细胞抗原(HLA)的轻链部分,链内含有一对二硫键,β2m与HLA-A、B、C抗原的重链非共价地相结合而存在于细胞膜上。一般认为除成熟红细胞和胎盘滋养层细胞外,其它细胞均含有β2m。因此,起源于人体间质细胞上皮和造血系统的正常细胞和恶性细胞均能合成β2m。它可从有核细胞中脱落进入血循环,使血液中的β2m升高。血清β2m不但可以在肾功能衰竭、多种血液系统疾病及炎症时升高,而且在多种疾病中均可增高,故应排除由于某些炎症性疾病或肾小球滤过功能减低所致的血清β2m增高。肿瘤患者血清β2m含量异常增高,在淋巴系统肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、淋巴细胞肉瘤、多发性骨髓瘤等中尤为明显,在肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及子宫颈癌等中也可见增高。由于在肿瘤早期,血清β2m可明显高于正常值,故有助于鉴别良、恶性口腔肿瘤。脑脊液中β2m的检测对脑膜白血病的诊断有特别的意义。
(二)铁蛋白(ferritin,Fer)
铁蛋白是1884年Schmiedeber所发现的水溶性铁贮存蛋白,1937年被Laufberger命名为铁蛋白,1965年Richter等从恶性肿瘤细胞株中分离出铁蛋白,并发现铁蛋白存在于各种组织和体液中。铁蛋白是一种脱铁蛋白组成的具有大分子(450ku)结构的糖蛋白,由24个亚单位聚集而成,每个铁蛋白分子可贮存4500个铁原子。正常血清中含量(RIA法、EIA法)男性为20-250μg/L,女性为10-120μg/L。
铁蛋白具有两个亚基,为肝脏型(L型)和心脏型(H型),不同比例的亚基聚合而成纯聚体和杂合体,可得到不同的同工铁蛋白图谱。在肿瘤状态时,酸性同分异构体铁蛋白增高,一般情况下与白血病、肺癌、乳腺癌有关,当肝癌时,AFP测定值较低的情况下,可用铁蛋白测定值补充,以提高诊断率。在色素沉着、炎症、肝炎时铁蛋白也会升高。
(三)本周蛋白(Bence-Jones protein,BJP)
早在1845年由一位内科医生兼化学病理学家Henry Bence Jones首次描述了这种蛋白,它可被氨基水杨酸、三氯醋酸、硝酸和盐酸沉淀,加热到45-60℃时,沉淀又再现,故又名为凝溶蛋白。1963年,Schwary和Edelman对骨髓瘤球蛋白轻链的胰蛋白酶水解产物和同一患者的本周蛋白进行比较,结果表明本周蛋白由完整的轻链组成,在大多数病例中,本周蛋白的沉淀系数为3.6s,分子量为45000u,属于游离轻链的双体,当沉淀系数为1.8s时,分子量为22500u,多属于单体。
本周蛋白是多发性骨髓瘤的典型标志物,或称其为“免于球蛋白轻链”标志物。免疫球蛋白的轻链可分为Kappa(κ-Ig)和Lambda(λ-Ig)两类,然而,一个克隆的浆细胞中能产生两种轻链混存于单一抗体分子中。慢性淋巴瘤、骨肉瘤等均会引起本周蛋白阳性,肾病时也会阳性。目前用于检测本周蛋白的方法很多,如:①热沉淀:此种反应易受pH及多种理化因素影响,因此宜用pH4.9醋酸缓冲液调到恒定环境;②醋酸纤维薄膜电泳:可用清晨第一次尿,浓缩尿液50倍左右后,进行CAM电泳,经丽春红染色,BJP区带在α2-γ区间可被显现;③聚丙烯酰胺溶胶电泳:是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的电泳技术,它是一种不连续的凝胶电泳,故能使蛋白质各组份被清楚地分开,BJP呈现的位置与CAME相同;④非浓缩尿与银染技术:由Shate建立的一种不需浓缩尿的银染技术,提高了尿中BJP检测敏感性;⑤免疫电泳;⑥固定免疫电泳:它作为一种更为灵敏的筛选BJP方法,比一般免疫电泳灵敏度提高近10倍。
六、肿瘤标志物的联合应用
用肿瘤标志物测定肿瘤在临床上已应用了许多年,为临床的诊断和疗效观察起了很多的作用,但在应用过程中,确实也存在着特异性不强、阳性率不高等不足。为了提高诊断的阳性差,临床上常将几项相关的标志物组成联合标志物组,同时对某一肿瘤进行检测,应用多变量分析的方法,提高临床的诊断的准确性。
(一)肺癌的诊断的标志物 CEA是最早用于肺癌的诊断,特别对非小细胞肺癌的诊断有一定的意义。目前临床上常将CEA和总唾液酸蛋白(TSA)联合检测,可提高诊断的灵敏度和特异性。或CEA与降钙素以及ACTH联合检测能对治疗的效果提供依据。
在肺癌的基因检测中,往往以检测P53基因和RB基因的表达为主。
肺癌的肿瘤标志物的临床应用如能结合细胞学的检查,其价值就更大。
(二)乳腺癌的诊断的标志物
乳腺肿瘤的标志物有不少,最早使用的是CEA、hCG、铁蛋白等。近年来,癌抗原物质的出现,特别是CA153、CA549标志物的检查为乳腺肿瘤的诊断带来一种较为可靠的依据。在基因检测方面,主要有P53、C-erb-2等。现有学者认为,乳腺肿瘤的患者的家族中存在着一种易感性的基因,这就是BRCA1和BRCA2,这对早期诊断和发现乳腺肿瘤有一定的意义。
(三)肝癌的诊断标志物
到目前为止,AFP仍然是肝癌诊断的最佳标志物,除此之外,还有γ-GT、AFU、GGT-Ⅱ、RNAase同工酶、AKP同工酶、醛缩酶同工酶、β2-微球蛋白相关抗原等。在肝癌的检测中,以几项标志物协同使用,能提高诊断阳性率。
(四)胰腺癌的诊断标志物
胰腺癌的早期诊断比较困难,手术切除率低,从目前的胰腺癌的诊断标志物来看,CA19-9是比较好的诊断标志物,其阳性值与肿瘤大小有一定的相关性。CA19-9又可与CA50或与胰腺癌组织抗原一起,作为胰腺癌诊断的联合指标。
(五)卵巢癌的诊断标志物
从目前的卵巢癌的诊断的单个标志物来看,特异性不高。如能将几个标志物联合检测可提高诊断的阳性率。
现可组合的标志物有:CEA、hCG、SIEX、CA125、CA19-9等单克隆抗体,在基因检测方面有K-ras癌基因等。
99-12-16 9:51 刘小琴
婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧潡鏌熺€电ǹ孝缂佽翰鍊濋弻锕€螣娓氼垱锛嗗┑鐐叉▕娴滄繈宕戦幇鐗堝仯闁搞儺浜滈惃鐑樸亜閿旇骞栭柍瑙勫灴閹晝绱掑Ο濠氭暘婵犵數鍋涢惇浼村磹濠靛鈧礁顫濋懜鐢靛姸閻庡箍鍎卞Λ娑㈠储閸楃偐鏀介柣鎰綑閻忋儳鈧娲﹂崜鐔奉嚕閹间礁围闁糕剝鍔掔花濠氭⒑閸愬弶鎯堥柛鐕佸亰瀹曘垽骞橀鐣屽幐闁诲繒鍋涙晶浠嬪煡婢舵劖鐓冮柦妯侯樈濡偓閻庤娲╃换婵嬪箖濞嗗浚鍟呮い鏂剧矙閻涘酣姊婚崒娆戭槮闁圭⒈鍋婅棟妞ゆ劧绠戦悿鐐節婵犲倸鎮╂繛鎴欏灩缁€鍐┿亜閺冨洤顥嶉柟鑺ユ礀閳规垿鎮欓弶鎴犱桓闁艰¥鍊濋弻锛勨偓锝庝邯閸欏嫰鏌i幙鍐ㄤ喊鐎规洖鐖兼俊鎼佹晝閳ь剟鎯冮幋锔解拺缂佸顑欓崕鎰版煙濮濆苯鍚圭紒顔碱儔楠炴帡寮崫鍕闂佹寧绻傜花鑲╄姳娴犲鐓曢柡鍐╂尵閻h鲸銇勯鍕殻濠碘€崇埣瀹曞崬螖閳ь剙岣块幋锔解拺缂佸顑欓崕鎰版煙閻熺増鍠樼€殿喛顕ч埥澶愬閳ュ厖姹楅柣搴ゎ潐濞叉牕煤閵忋倕鐒垫い鎺嶇缁楁艾菐閸パ嶈含鐎规洩绲惧鍕節閸屻倖缍嬮梻鍌欑閻ゅ洭锝炴径鎰瀭闁割煈鍠氶弳锕傛煕椤愶絾绀€闁绘挻锕㈤弻锝夊箛闂堟稑顫繛瀛樼矋閻熲晛顫忛搹瑙勫珰闁哄被鍎洪埀顒侇殘缁辨帡鎮╅懠顑呪偓瑙勬礃濞茬喎鐣烽敓鐘冲€风€广儱妫涢埥澶愭煃閽樺妯€濠殿喒鍋撻梺缁橈耿濞佳勬叏閿旀垝绻嗛柣鎰典簻閳ь剚鐗滈弫顕€骞掑婵嗘喘椤㈡盯鎮欓弶鎴斿亾閸洘鐓ラ柡鍐ㄥ€婚幗鍌涚箾閸粎鐭欓柡宀嬬秮楠炲洭顢楁担鍙夌亞闂備胶枪鐎涒晛顫忚ぐ鎺嬧偓鍐Ψ閳哄倸鈧兘鏌涘▎蹇fЦ闁哄濮撮—鍐Χ閸愩劎浠惧┑鈽嗗亜閸燁偊鎮鹃悜钘壩╅柍鍝勶攻閺咃綁姊虹紒妯哄婵炰匠鍥х缂佸绨遍弨浠嬫煟濡櫣浠涢柡鍡忔櫊閺屾稓鈧綆鍓欓埢鍫燁殽閻愬瓨宕屾い銏℃瀹曞崬螖閸愵亞鎽岄梻鍌欐祰椤曟牠宕规總鍛婂€堕柟閭﹀劒濞差亶鏁傞柛鏇ㄥ弾閸氬懘姊绘担铏瑰笡闁挎岸鏌涘锝呬壕缂傚倷鐒﹂〃鍛此囬棃娑辨綎婵炲樊浜滅粻浼村箹鏉堝墽鎮奸柣锝囨暬濮婃椽鎮烽弶鎸幮╁銈嗗灥椤︻垶鎮鹃悜鑺ュ仺缂佸娼¢崬璺衡攽閻橆喖鐒哄ù婊勭箓铻為柛鎰靛枛閺嬩線鏌涚仦鍓х煂濡炶濞婇幃妤呮晲鎼存繄鐩庢繝纰樷偓鐐藉仮婵﹦绮幏鍛村川婵犲啫鏋戦梻浣呵归鍥磻閵堝宓侀柟鐗堟緲缁狀噣鏌﹀Ο渚Ъ闁硅姤娲熷娲传閸曨剙鍋嶉梺鎼炲妼缂嶅﹪鎮伴鈧慨鈧柕鍫濇閸樻悂姊洪幖鐐插姉闁哄懏绋戦悺顓炩攽閻樻鏆柍褜鍓濈亸娆撴儗濞嗘挻鐓涚€光偓鐎n剛袦婵犳鍠掗崑鎾绘⒑鐎圭姵銆冮柤瀹犲煐缁傛帡鍩¢崘顏嗭紳闂佺ǹ鏈銊ョ摥闂備焦瀵уú锔界椤忓牊鍋樻い鏃傛櫕缁♀偓闂佹悶鍎崝宥呪枍閵忋倖鈷戠紓浣广€掗崷顓濈剨婵炲棙鎸婚崑顏堟煃瑜滈崜姘┍婵犲洦鍊锋い蹇撳閸嬫捇寮介鐐殿唶婵°倧绲介崯顐ゅ婵犳碍鐓熼柡鍌涘閹插憡銇勯埡鍐ㄥ幋闁哄瞼鍠栭獮宥夘敊绾拌鲸姣夐梻浣瑰▕閺€閬嶅垂閸ф钃熸繛鎴欏灪閺呮粓鎮归崶銊ョ祷缂佹鐭傚娲嚒閵堝懏鐎鹃梺闈╃稻濞兼瑧鍙呭銈呯箰鐎氣偓鐟滄棃寮诲☉銏犖ㄦい鏃€鍎崇敮銉モ攽閻愯泛浜归柛鐘崇墪椤繐煤椤忓嫮顦ㄩ梺鍛婄懃椤︿即宕曢幘缁樷拺闁荤喐婢橀弳杈ㄦ叏濮楀牆顩柟骞垮灩椤繈鎳滅喊妯诲濠电偠鎻徊浠嬪箠濞嗘帇浜归柟鐑樺灥閻濇ê顪冮妶鍡楃瑨闁稿﹤顭烽幆灞解枎閹惧鍘甸梺缁樺灦閿曗晛鈻撻弴銏$厱濠电姴鍊绘禒娑㈡煏閸パ冾伃鐎殿噮鍓熷畷褰掝敊鐟欏嫬鐦辩紓鍌欒兌閸嬫捇宕曢幎钘壩ч柟闂寸閽冪喖鏌ㄩ悢鍝勑㈢紒鈧崘顔界厪濠电偛鐏濋崝妤呮煕鐎n偅灏电紒顔界懇楠炴劖鎯旈姀銏☆潠濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忔い鎾卞灩缁狀垶鏌涢幇闈涙灈缂佲偓鐎n喗鐓曟い顓熷灥娴滅偤鏌℃径濠勭Ш闁哄矉绲鹃幆鏃堝閳轰焦娅涢梻浣告憸婵敻鎮ч悩璇茬畺闁靛鏅滈崑鍌炲箹鏉堝墽绋绘繛鍫熷劤閳规垿顢欐慨鎰捕闂佺ǹ顑嗛幐鎼佸煘閹达箑鐒洪柛鎰典簼閹叉瑥顪冮妶蹇涙濠电偛锕璇测槈閵忕姷顔掗梺鍝勵槹閸ㄨ绂掗崫銉х=濞达綀娅g敮娑氱磼鐎n偅宕岄柛鈹惧亾濡炪倖甯婇懗鍫曞煀閺囩偟鏆嗛柨婵嗘噺閸嬨儵鏌熼姘拱缂佺粯绻堝畷鎴︽嚍閵夛富妫冮梺璇″枓閺呯姴鐣烽敐鍡楃窞閻庯綆浜濋悗楣冩⒒閸屾瑦绁版俊妞煎妿濞嗐垽鏁撻悩鏌ユ7闂佹寧绻傞ˇ顓㈠焵椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柍鈺佸暞閻濇洟姊绘担钘壭撻柨姘亜閿旇法鐭欓柛鈹惧亾濡炪倖甯婇懗鍫曞煡婢舵劖鐓冮悷娆忓閻忔挳鏌℃担鍝バх€规洜鍠栭、鏇㈡晬閸曨剙绀嬪┑鐘垫暩婵參骞忛崘顔煎窛妞ゆ梻鏅ぐ褏绱撻崒娆戣窗闁哥姵顨婇幃鐑芥晜閻愵剙搴婂┑鐘绘涧椤戝懘鎮欐繝鍥ㄧ厪濠电倯鍐ㄦ殭缂佺姷澧楃换婵嬫偨闂堟刀鐐烘煕閵娧冨付闁崇粯鏌ㄩ埥澶愬閳╁啯鐝栭梻渚€娼ч悧鍡浰囬姣垦囧蓟閵夛妇鍘搁梺鎼炲劗閺呮盯寮搁幋锔界厱婵炲棗绻掔粻濠氭煛瀹€瀣М闁诡喓鍨介幃鈩冩償濠靛棙鐎冲┑鐘殿暯濡插懘宕归鍫濈;闁瑰墽绮埛鎺懨归敐鍫澬撻柕鍡楀暟缁辨帡鍩€椤掍焦濯撮柧蹇撴贡閻撳姊洪崷顓℃闁哥姵顨婂畷鎴﹀煛閸屾粎鐦堥梻鍌氱墛娓氭宕曡箛鏇犵<闁逞屽墴瀹曟﹢鍩炴径鍝ョ泿婵$偑鍊栭幐楣冨窗鎼淬劍鍊堕柨婵嗩槹閻撴瑩鎮楅悽鐧诲綊宕㈢€涙ɑ鍙忓┑鐘插鐢盯鏌熷畡鐗堝櫧缂侇喚鏁搁埀顒婄秵娴滄繈鎮炬导瀛樷拻濞达絽鎲¢幉绋库攽椤旂偓鏆鐐村灴瀹曟儼顦撮柡鍡檮缁绘繈妫冨☉鍐插闂佹眹鍊愰崑鎾寸節閻㈤潧浠﹂柛銊ュ悑閵囨棃骞栨担鍝ユ煣闂佹寧绻傚ú銊у娴犲鐓曢悘鐐插⒔閹冲懘鏌涢弬璺ㄐ㈤柣锝嗙箞閺佹劙宕ㄩ闂存樊闂備胶纭堕弬鍌炲垂閽樺鍤曟い鏇楀亾鐎规洖銈搁幃銏ゅ传閸曨偆顔戦梻鍌氬€烽懗鍫曞箠閹炬椿鏁嬫い鎾卞灩绾惧潡鏌熺€电ǹ浠ч柣鐔活潐缁绘盯骞嬪▎蹇曚痪闂佺粯鎸诲ú鐔煎蓟閿熺姴纾兼慨妯哄綁閾忓酣姊洪崫鍕紨缂傚秳绶氬濠氬灳瀹曞洦娈曢柣搴秵閸撴盯鎯侀崼銉﹀€甸悷娆忓缁€鍐偨椤栨稑娴柨婵堝仜閳规垹鈧絽鐏氶弲锝夋⒑缂佹﹫鑰挎繛浣冲洨宓侀柍褜鍓涚槐鎾诲磼濮橆兘鍋撻幖浣哥9闁绘垼濮ら崐鍧楁煥閺囩偛鈧爼鍩€椤掆偓閸熸潙鐣烽妸銉桨闁靛牆鎳忛崰姗€鏌$仦鑺ヮ棞妞ゆ挸銈稿畷銊╊敍濮橆儷鏇炩攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墱閺侇噣骞掑Δ鈧粣妤佹叏濮楀棗鍘崇紓鍌涘哺閺岀喖鏌囬敃鈧弸銈囩棯閹冩倯闁靛洤瀚板顕€宕惰濮规绱撴担鍝勑㈡い顓犲厴瀵濡搁妷銏℃杸闂佸壊鍋呯换鈧俊鍙夊姍濮婄儤娼幍顕呮М闂佸摜鍠愬ḿ娆撴偩閻戣棄绠抽柟鎼幗閸嶇敻姊洪崨濠庢畼闁稿鍋ら獮澶愬閵堝棌鎷绘繛杈剧秬濡嫰宕ラ悷鎵虫斀闁绘劏鏅涙禍鍓х磽閸屾艾鈧悂宕愯ぐ鎺撳殞濡わ絽鍟悡婵堚偓骞垮劚椤︿即寮查弻銉︾厱闁靛鍨哄▍鍥煟閹炬剚鍎旀慨濠冩そ瀹曟粓鎳犻鈧敮銉╂⒑閸濄儱校闁圭懓娲畷娲焵椤掍降浜滈柟鍝勭Ф椤︼妇绱掑Δ浣哥瑲闁靛洤瀚伴、鏇㈡晲閸モ晝鏉芥俊鐐€戦崹娲晝閵忋倕绠栭柍鍝勬媼閺佸啴鏌ㄥ┑鍡楊劉缂傚秴鐭傚濠氬磼濮橆兘鍋撴搴㈩偨婵﹩鍏楃紓姘辨喐瀹ュ洤寮查梻渚€娼ч悧鍡涘箖閸啔娲敂閸曞簶鏅犻弻宥嗘姜閹峰苯鍘¢梺鍛婃缁犳垿鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冾殘閻熴劑姊虹粙娆惧剰婵☆偅绻傞锝夊Ω閳哄倸浜遍梺鍓插亖閸ㄥ顢欓弴鐔虹瘈闁靛骏绲剧涵鐐亜閹存繃鎼愰悡銈夋倵閻㈢數銆婇柛瀣尵閹叉挳宕熼鍌︾喘闂備焦鎮堕崝蹇旀叏閵堝棛鈹嶅┑鐘叉搐闁卞洭鏌¢崶鈺佷户闁稿﹦鍋ゅ娲濞淬劌缍婂畷鏇㈡倻濡警鍤ら梺鍝勬储閸ㄦ椽鎮¢悢鍏肩厽闁哄倹瀵ч幉鎼佹煟椤撶偠瀚版い顓″劵椤﹁櫕銇勯妸銉уⅵ鐎殿噮鍋婇、娆撳床婢跺顥堢€规洦浜畷姗€顢旈崱蹇旓紙濠电姷鏁告慨浼村垂婵傜ǹ鏄ラ柡宥庡幖缁€澶愭煛瀹ュ骸骞栫痪鎯ь煼閺屻劌鈹戦崱鈺傂ч梺缁樻尰濞茬喖寮婚弴鐔风窞婵☆垵娅f禒鈺侇渻閵堝倹娅撻柛鎾寸懇閸┿儲寰勯幇顒傤啋闂佽崵鍠愭竟鍡椥掗姀銏㈢=濞达絼绮欓崫娲偨椤栨侗娈斿畝锝堝劵缁犳稑鈽夊Ο婧炬櫇閹叉瓕绠涘☉娆忎患婵犻潧鍊搁幉锟犲煕閹寸姵鍠愰柣妤€鐗嗘穱顖涗繆椤愶絽鐏ラ柍瑙勫灴閹瑩鍩℃担宄邦棜闂傚倸鍊峰ù鍥敋閺嶎厼绐楁俊銈呭暙閸ㄦ繈鏌熼幑鎰靛殭缂佺姵婢橀埞鎴︽偐閹绘帗娈紓浣稿閸嬫盯鈥︾捄銊﹀磯闁惧繐婀辨导鍥р攽椤旂》鍔熼柛瀣尵閹广垹鈹戠€n偄浠洪梻鍌氱墛缁嬫劗鍒掔捄渚富闁靛牆妫欐径鍕煕濡湱鐭欐鐐茬墦婵℃悂鏁傞崫鍕凹闂備礁鎲¢崝鎴﹀礉瀹ュ憘锝夘敆閸曨兘鎷洪梺鍛婄箓鐎氼噣鍩㈡径鎰厱婵☆垱浜介崑銏⑩偓瑙勬礀缂嶅﹤鐣烽幒妤佸€烽悗鐢登圭敮鎯р攽閻樺灚鏆╅柛瀣枛瀹曟垿骞橀弬銉︾€洪梺绯曞墲缁嬫帡鎮¢弴銏″€甸柨婵嗗暙婵$厧鈹戦垾鐐藉仮婵☆偂鐒﹀鍕箛椤撶姴寮虫繝鐢靛█濞佳兾涘▎鎾抽棷鐟滅増甯楅悡娑㈡煕閳╁啰鎳冮柡瀣灥鑿愰柛銉戝秷鍚銈冨灪缁嬫垿锝炲┑瀣闁绘劏鏅涘宥呪攽閻樻剚鍟忛柛鐘崇墵閺佸啴濡烽妷顔藉瘜婵炲濮撮鍐焵椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柍鈺佸暞閻濇娊姊绘担铏广€婇柛鎾寸箞閹兘鏁冮崒銈嗘櫍婵犵數濮电喊宥夊煕閹烘嚚褰掓晲閸噥浠╅柣銏╁灡閻╊垶寮婚悢鍝勬瀳闁告鍋樼花浠嬫⒑閻熸壆鐣柛銊ョ秺閸╃偤骞嬮悩顐壕闁挎繂楠告晶顔剧磼娓氬﹦鐣甸柡宀嬬稻閹棃顢涘⿰鍛咃綁姊洪崫銉バi柣妤佺矌閸掓帗绻濆顓熸珳闂佺硶鍓濋悷褔鎯侀崼鐔虹瘈闁汇垽娼у瓭闂佺ǹ锕ラ幃鍌炪€侀弮鍫晝闁挎梻鏅崢鐢告⒑閸濆嫷鍎涢柛瀣閹便劑宕掑☉娆忓伎婵犵數濮撮崯顖炲Φ濠靛浂娈介柣鎰綑婵牓鏌熼娑欘棃闁轰焦鍔欏畷鎺戔槈鏉堛劎绉鹃梻鍌氬€搁崐椋庣矆娓氣偓楠炴牠顢曢敂钘変罕濠电姴锕ら悧鍡欑矆閸儲鐓熼柡鍐ㄧ墱濡垿鏌¢崱顓犵暤闁哄矉缍侀幃銏㈢矙濞嗙偓顥撻梻浣稿閸嬫帗绂嶉鍫濊摕婵炴垯鍨归崡鎶芥煏婵炲灝鍔氶悗娑崇到閳规垿鎮欑€涙ḿ绋囬柣搴㈠嚬閸撶喖鍨鹃弮鍫濈妞ゆ柨妲堣閺屾盯鍩勯崘鐐暭闂佽崵鍠愰崝娆忣潖閾忓湱纾兼俊顖涙そ閸ゅ绱撴担鍝勑i柟鍛婃倐椤㈡岸鏁愭径濠勵唴缂備焦绋戦鍡涘疾濠婂牊鈷戦柛鎾村絻娴滅偤鏌涢悩铏磳鐎规洏鍨介弻鍡楊吋閸″繑瀚奸梻浣藉吹閸犳挻鏅跺Δ鍛畾闁割偁鍨荤壕鐓庮熆鐠轰警鍎愮紓宥嗗灴閺岋綁鏁愰崶銊︽瘓閻庤娲栧畷顒勫煡婢跺ň鏋庨柟瀛樼箓缁楁岸姊洪懡銈呮瀾缂侇喖绉堕崚鎺楀箻瀹曞洦娈惧┑鐘诧工閸犳艾岣块埡鍌樹簻闁圭儤鍩堝Σ褰掓煕瀹ュ洦鏆慨濠冩そ濡啫霉閵夈儳澧︾€殿喗褰冮オ浼村醇濠靛牞绱遍梻浣呵归惉濂稿磻閻愮儤鍋傞柕澶嗘櫆閻撶喖鏌¢崒娑橆嚋闁诡垰鐗忛埀顒佺⊕缁诲牓寮婚敐澶嬪亜闁告縿鍎查崵鍌滅磽娴e搫校闁圭懓娲幃浼搭敋閳ь剙顕f禒瀣垫晣闁绘劖顔栭崯鍥ㄤ繆閻愵亜鈧牠骞愭ィ鍐ㄧ;闁绘柨鎽滈々閿嬨亜閺嶃劎鐭岀痪鎹愭闇夐柨婵嗘缁茶霉濠婂懎浜剧紒缁樼箞婵偓闁挎繂妫涢妴鎰版⒑閹颁礁鐏℃繛鍙夌箞婵$敻骞囬弶璺唺闂佺懓顕刊顓炍i鐐粹拻濞达絽鎳欓崷顓熷床婵°倕鎳庣壕濠氭煙闁箑鍘撮柡瀣閺屾洟宕煎┑鎰ч梺鎶芥敱閸ㄥ湱妲愰幘瀛樺閻犳劦鍨崇槐鎵磽娴e搫校闁绘濞€瀵鏁愭径濠勫幐婵犵數濮撮崐缁樼閳哄懏鈷戝ù鍏肩懅閹ジ鏌涜箛鏃撹€跨€殿噮鍋婇獮妯肩磼濡桨姹楅梻浣藉亹閳峰牓宕滈敃鈧嵄濞寸厧鐡ㄩ埛鎺懨归敐鍫燁棄濞存粌缍婇弻宥呯暋閹殿喖鈪甸悗瑙勬礃缁矂锝炲┑鍥风矗婵犻潧娲﹀▍鎾绘⒒娴d警鏀伴柟娲讳邯濮婁粙宕熼姘卞幈闂佺鎻梽鍕磻閿濆鐓曢柕澶樺灣瀹€娑㈡煕鐎n偅宕岄柟鐓庣秺椤㈡洟濡堕崟顓熷瘻闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁撻悩鑼舵憰闂侀潧饪电€靛苯鈻撴禒瀣厵闂傚倸顕ˇ锕傛煟閹惧绠為柡宀€鍠栭獮鎴﹀箛闂堟稒顔勭紓鍌欒兌婵绱炴笟鈧濠氭晲婢跺﹦鐤€濡炪倖鎸鹃崰鎾剁矙閸パ屾富闁靛牆鎳庨銏ゆ煙閸涘﹥鍊愰柛鈺冨仱楠炲鏁傞挊澶夋睏闂佽崵濮村▔褔宕樿閻姊婚崒娆戭槮闁硅姤绮撳畷鎶藉Ψ閳轰礁鐎梺鍓插亝濞叉粌鐣垫笟鈧弻娑㈠焺閸愵亖妲堢紒鐐劤閸氬骞堥妸鈺傛櫜閹肩补鈧磭顔愮紓鍌氬€哥粔鎾晝椤忓牏宓侀柛鎰靛枛閻撴盯鏌涘☉鍗炲箻妞ゆ柨鐭傚娲捶椤撶偛濡虹紓浣筋嚙閸婅绌辨繝鍥ㄧ叆閻庯綆鍓涢惁鍫ユ⒑濮瑰洤鐏叉繛浣冲棌鍙撮梻鍌欒兌鏋い鎴濇楠炴垿宕堕鈧拑鐔兼煟閺傝法娈遍柡瀣閺屾盯鈥﹂幋婵囩亶闂佽绻戦幐鍓ф閹烘挶鍋呴柛鎰典簽閺嗩偆绱撴担鍝勑i柣妤冨Т椤曪絾绻濆顓炰簻闁荤偞绋堥埀顒€鍘栨竟鏇㈡⒑濮瑰洤鐏繛鍛劦閹兘鎮ч崼鐔烘闂傚倷娴囧畷鐢稿窗閹邦喖鍨濋幖娣灪濞呯姵淇婇妶鍛櫤闁稿鍊块弻銊╂偄閸濆嫅銏ゆ煢閸愵亜鏋戠紒缁樼洴楠炲鈻庤箛鏇氭偅缂傚倷鑳舵慨鍨箾婵犲洤钃熼柨鐔哄Т绾惧吋鎱ㄥΟ鍧楀摵闁汇劍鍨垮娲传閸曢潧鍓伴梺鐟板暱闁帮綁宕洪悙鍝勭闁挎棁妫勯埀顒傚厴閺屾稑鈻庤箛锝喰﹀┑鐐叉嫅缂嶄礁顫忕紒妯诲缂佸娉曢惄搴g磽娴h棄鐨洪柛瀣尵缁碍娼忛妸褏鐦堥梺鎼炲劀閸滀礁鏅┑锛勫亼閸婃牕螞娴h鍙忛柕鍫濇噳閺嬪秹鏌曡箛瀣偓鏍煕閹达附鍋i柟顓熷笒婵″吋绻涢崨顔煎闁哄瞼鍠栧畷娆撳Χ閸℃浼�