第二十章低密度脂蛋白受体的检测
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《动脉粥样硬化与生物化学检验》
脂蛋白受体主要包括乳糜粒受体（CM-R）、极低密度脂蛋白受体（VLDL-R）、低密度脂蛋白受体（LDL-R）、高密度脂蛋白受体（HDL-R）和清道夫受体（scavenger receptor）等。脂蛋白受体的检测与一般受体检测方法的原理及操作基本类同。目前研究最多，应用最广的要属LDL-R,其他脂蛋白受体如清道夫受体、VLDL-R等的检测方法与LDL-R基本相似，多采用125Ⅰ标记的配体检测或是3HTdR掺入法等。本章以LDL-R为代表介绍脂蛋白的检测方法。
低密度脂蛋白受体（LDL-R）广泛分布于人与动物的各种细胞和组织，如肝细胞，成纤维细胞，血管平滑肌细胞，淋巴细胞，单核细胞及肾上腺、卵巢等。LDL-R是一种跨膜糖蛋白，位于细胞表面被膜凹的浆膜部位。主要功能是参与LDL-R的代谢过程，与含有ApoB100、ApoE的LDL、β-VLDL等结合，并内吞入细胞，LDL-R缺乏则导致血中胆固醇异常。家族性高胆固醇血症（FH）是LDL-R基因突变引起的LDL-R缺乏以致胆固醇异常的显性遗传性疾病。其特征为血胆固醇显著升高、黄色瘤和早发心肌梗塞。人群中杂合子型FH（LDL-R减少）发生频率为1/500，纯合子型FH（LDL-R缺乏）较少见，发生频率约为1/1000000，通常在儿童期即发生心肌梗塞。FH的发病率在我国也是比较高的，因此LDL-R的检测对于筛选人群中的FH患者及预防冠心病、心肌梗塞等具有重要意义。
细胞表面的LDL-R的分析可通过以下几种检测方法进行：检测同位素或非同位素标记的LDL与LDL-R的结合力（或率），推算受体最大结合浓度，在限制性生长条件下检测细胞分裂抑制率。判断LDL受体活性；用抗体直接测定LDL-R量或者对受体直接进行蛋白质结构和基因图谱分析。
第一节 受体与标记配体的结合分析
为了体外研究脂蛋白的细胞代谢和脂蛋白受体活性，早在1974年Goldstein和Brown就建立了成纤维细胞125I标记LDL的配体-受体结合分析法。其基本原理是：用放射性同位素（常用125I）标记LDL后，与细胞（通常为培养的单层成纤维细胞）、组织或含有LDL-R的制剂一起孵育，使LDL-R与125I-LDL充分结合，形成受体-配体复合物，再除去未结合的125I-LDL，测定结合沉淀物中的放射性。同时检测细胞、组织或受体制剂的蛋白质含量，即可计算出与125I-LDL结合的LDL-R量。本法由于使用同位素，采样困难和操作过程繁琐，且费时、昂贵，故在临床诊断上难以广泛开展。 Teupser等于1996年建立了直接荧光法检测LDL-R，他们采用1，1’二（十八烷基）-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐（1,1'-dioctadecy1-3,3,3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI）标记LDL，原理与同位素标记LDL相同。其操作步骤见图20-1。直接荧光法可定量检测附着的或非附着的各种类型的培养细胞（如正常人或FH病人的皮肤成纤维细胞、淋巴细胞、人U-937和鼠P388D1巨噬细胞系）的LDL-R和清道夫受体，其特点是特异性强，灵敏度高，不使用有机溶剂、不需预先进行脂质抽提，并省去了多步抽提步骤。正常人平均最大结合浓度为10.3±1.1μg/mg细胞蛋白，FH杂合子为5.2±0.8μg/mg细胞蛋白，FH纯合子0.9±0.2μg/mg细胞蛋白。
图20-1 直接荧光法测LDL-R操作步骤
亦有用胶体金标记LDL的，但是在受体-配体结合分析法中，正常人与FH患者的测定值有较明显的交叉现象，且操作比较繁琐。
1987年Roach等比较了在硝化纤维素上用125I-LDL、生物素-LDL、生物素-LDL、胶体金-LDL和胶体金-LDL结合银染四种方法检测LDL-R，发现胶体金-LDL结合银染的方法最为敏感，且安全、简单、快速、便宜。比较结果见表20-1。
表20-1 硝化纤维上检测LDL-R的几种方法比较
因素
125I-LDL
生物素-LDL
胶体金-LDL
胶体金-LDL加银染
时间
12～24h
3h
5～10min
20min
敏感性
1.6fmoles
1.6fmoles
1.6fmoles
193amoles
线性范围
0.5～15μg
0.5～4μg
0.5～4μg
0.06～2μg, 百拇医药 参见：
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