第三节DNA重组实验中常用的技术
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《免疫细胞化学》
一、质粒DNA的提取及鉴定
（一）质粒DNA的提取及鉴定
1．收获细菌
（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2．碱裂解法小量抽提质粒
（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。
（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。
（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,
水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。
（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。
（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。
（7）4℃以12000g离心5min。
（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。
（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。
（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。
（二）质粒DNA的大量制备
（1）同上1.（1）
（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的LB
100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。
（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。
（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。
（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。
（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。
（7）加溶液Ⅲ
7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。
（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃
3～5h。
（9）15000rpm
4℃ 离心20min。
（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。
（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。
（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。
（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。
（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。
（15）加入1/10体积的3mol/L NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃
3～5h。
（16）10000rpm
4℃离心20min。
（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。
（三）质粒DNA的鉴定
1．酶切反应
（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer
1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
（2）取反应物点样，观察酶切效果。
（3）酶切完全后，70℃
5min终止反应。
2．琼脂糖电泳
（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。
（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。
（3）打开电源开关，5V/cm电泳。
（4）在UV灯下观察电泳结果。
二、DNA的重组
（一）DNA的酶切与连接
（1）酶切反应
同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。
（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc混匀，-20℃
2h以上。
（3）15000rpm离心15min，弃上清。
（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
（6）测定DNA的含量。
（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。
（二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化
1．感受态的制备
（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl2
5ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl2
1.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2．重组DNA的转化
（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：
转化项目
受体菌 DNA
总体积 DNA对照组
0
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
0
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
（3）42℃
90s。
（4）37℃水浴5min。
（5）加入无相应抗生素的LB
200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
（三）转化子DNA的快速鉴定－快速细胞破碎法
（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。
（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,
20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，
37℃水浴30min以上。
（4）15000rpm离心15min。
（5）吸取上清点样电泳，观察。
（四）转化子DNA的酶切鉴定
1．转化子DNA的快速少量抽提
（1）同本节二.（三）.1.
（2）菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。
（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。
（4）15000rpm离心15min。
（5）吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。
（6）15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。
（8）取少量DNA电泳，观察浓度。
2．转化子DNA的小量酶切鉴定 同质粒DNA的小量酶切鉴定，见本节一（三）。
（五）重组子DNA的进一步鉴定
可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节四。
[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段
（1）用合适的酶切割DNA并电泳。
（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。
（3）将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。
（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。
（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，
10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。
（6）加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。
（7）于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。
（8）用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
（9）真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。
三、地高辛配基随机标记DNA探针法
（一）概述
基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。
1．标记 本试剂盒采用随机引物标记方法，可标记少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA链每20～25个核苷酸，掺入一个Dig-dUTP，反应时间约为1h。
2．杂交 按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃，重复使用。
3．免疫学检测 封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记DNA结合，出现杂交的半抗原-标记DNA，显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续3d。典型的例子是在24h后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。
4．应用 地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg的同源DNA，能检测1μg哺乳动物DAN中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成），而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以替代同位素标记和放射自显影术。
（二）试剂盒成份
1．无标记对照DNA1 此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它们的混合比例为2：3：3，共有16个Pbr328片段，这些片段的大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。
2．无标记对照DNA2 此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ线性化。
3．DNA稀释缓冲液 有两管，每管1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50μg/ml）。
4．标记对照DNA 此管内有50μl线性化pBR328 DNA，按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的标记DNA。
5．六聚核苷酸混合物
6．标记用混合底物 此管内有50μl 10倍浓度的dNTP标记用混合底物，
含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。
7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级） 此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U/μl。
8．（Dig）AP结合物 此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750U/ml。
9．NBT 有两管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。
10．X-磷酸盐 有两管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml）。
11．封阻试剂 有两瓶，每瓶有50g粉剂。
（三）需配制的溶液 EDTA（0.2mol/L）,pH8.0 (20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/L NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠；pH7.0 Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5 Tris –HCl(100mmol/L); NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。
（四）操作方法
1．标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。
（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。
（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：
新鲜变性的DNA 1-3μg
六聚核苷酸混合物 2μl（管5） dNTP标记用混合底物 2μl（管6）
加无菌重蒸水至 19μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow） 1μl（管7）
（3）在37℃保温至少60min，可到20h。
（4）煮沸5min，终止反应。
（5）15000rpm离心30s，置于冰上待用。
2．预杂交 按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。
预杂交液组成：5×SSC
0.5%（W/V）封阻试剂（管11）
0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
0.02%（W/V）SDS
膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。
3．杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。
杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V）
5%（W/V）封阻试剂
5×SSC
0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
0．02%(W/V)SDS
新变性标记DNA（150ng/ml）
杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。
4．洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液计算。
（1）在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
（2）在65℃条件下用0.1×SSC/0.1% SDS溶液漂洗，10min，2次。
（3）在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。
5．免疫测定
（1）配制溶液
缓冲液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）
缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。
缓冲液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10）。
2． 显色过程 A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。 B．在100ml缓冲2中保温30min。 C．再用缓冲液1短暂洗涤。 D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。 E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。 F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。 G.膜在缓冲液3中平衡2min。 H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。 I．当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。 J．摄相。
说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。
（五）排除实验中问题的方法
1．DNA不能有效地被标记时考虑
（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。
（2）标记反应的保温时间延长（增至20h）。
（3）DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。
2．不能达到预期的灵敏度时考虑
（1）DNA标记率。
（2）增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。
（3）显色反应的时间可延长至3d。
3．若显色时背景过深，可采取
（1）在杂交溶液中减少标记DNA量。
（2）增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。
（3）某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
（4）在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。
四、核酸的分子杂交
核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术，转移技术及其它常用的杂交技术。
（一）斑点杂交的直接点样法
斑点杂交或叫打点杂交（dot-blot hybridization），其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便，灵敏度高。一个点样品只含0.25～1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小（碱基对数）。
1．DNA的打点法（DNA Dot Blot）
（1）膜的处理：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。
（2）DNA变性：将DNA溶液于1×TE（pH8.0）缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，
迅速入冰水中。
（3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μl变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。
（4）固定：将凉干的滤膜夹在滤纸中，于80℃干烤2～3h，然后进行杂交。
2．RNA的打点法（RNA Dot Blot）
（1）膜的处理：同DNA的打点法。
（2）RNA变性：将提取的RNA与50μl
20×SSC/甲醛（30μl 20×SSC加20μl甲醛）混合，65℃水浴15min。
（3）点样：同DNA的打点法。
（4）固定：同DNA的打点法。
（二）DNA的吸印转移法（Southern Blot） DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。
试剂：变性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液：1mol/L Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/L NaCl
1．电泳 取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，
取酶消化后的DNA点样于0.8%～1.2%的凝胶上，以0.8～1V/cm电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转，紫外灯照射10～20min后拍照。
2．变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min，将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。
3．转移 取托盘一只，放入10×SSC溶液约500～1000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃，取一长方形Wateman paper（滤纸）搭在桥上，两边浸入10×SSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜），去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸（长和宽均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约500～1000g。转膜24h，中间更换吸水纸。
图23-7 Southern转膜示意图
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