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第二节 基因治疗 Gene Therapy
http://www.100md.com 《生物化学与分子生物学》

第二节 基因治疗 Gene Therapy

许多疾病如遗传性疾病、肿瘤等与人体的基因异常有密切的因果关系。早在DNA重组技术之前就有人提出将正常基因顺序导入病人体内进行基因水平治疗的设想。Edward Tatum 和Joshua Lederberg 在60年低曾提出可利用病毒作为基因转移的载体。但直到1990年才成功地实现了用基因治疗手段尝试治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症(adenosine deaminase deficiency)。到目前为止,已报道的基因治疗方案已超过百种。有300多病人接受了这种新的治疗方式。基因治疗的对象不再局限于遗传病,而被扩展到肿瘤和传染病等多种疾病。其发展相当迅速,前景十分看好,我国学者也在用基因治疗方式治疗血友病方面做了一定工作。目前已积累了一定的经验和教训,有了一些可遵循的操作程序及可供选择的治疗方式。但这种新的治疗方式仍有许多环节需要不断改进和提高。

一、基因治疗的概念和策略

基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中,目的基因被导入到靶细胞(target cells)内,他们或与宿主细胞(host cell)染色体整合成为宿主遗传物质的一部分,或不与染色体整合而位于染色体外,但都能在细胞中得到表达,起到治疗疾病的作用。

目前基因治疗的概念了较大的扩展,凡是采用分子生物学的方法和原理,在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现,基因治疗方法有了较大的发展。根据所采用的方法不同,基因治疗的策略大致可分为以下几种:

基因置换(gene replacement):基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因,使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想,但目前由于技术原因尚难达到。

基因修复(gene correction):基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正,而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复,操作上要求高,实践中有一定难度。

基因修饰(gene augmentation)又称基因增补,将目的基因导入病变细胞或其它细胞,目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中,缺陷基因仍然存在于细胞内,目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后,防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。

基因失活(gene inactivation):利用反义技术能特异地封闭基因表达特性,抑制一些有害基因的表达,已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达,增加化疗效果。

免疫调节(immune adjustment):将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内,改变病人免疫状态,达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内,提高病人IL-2的水平,激活体内免疫系统的抗肿瘤活性,达到防治肿瘤复发的目的。

其它:增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性:采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损用力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,然后给予病人无毒性GCV药物,由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将CGV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死,而对正常细胞无影响。

总之,基因治疗的策略较多,不同的方法在实践中各具有优缺点。而基因的治疗本身也并不局限于遗传病的治疗,现已扩展到肿瘤、病毒性疾病等。基因治疗可用于疾病的治疗,也可用于疾病的预防。应该指出的是基因治疗并不是万能的,尚不能取代现有的治疗方法,作为一种新的方法也还有一些需进一步完善的地方,在实践是应相互结合,取长补短,以取得较好的治疗效果。

一些常见疾病的治疗策略见表1。

表23-1 基因治疗策略

图23-2 Scientists use recombinant DNA techniques to replace the gag,pol,and env genes with one or more foreign genes.The foreign genes can be inserted in several different patterns.in this example,a selectable marker gene(neo)replaces the viral gag and pol genes and  a human gene replaces the env gene.

STEP 2

MAKING THE HELPER CELL

Desiging the Helper Vius

图 23-3 The helper cell should meet two basic requirements:(1)it should provide functions missing from the the vector virus,and(2)it should not be capable of producing viable virus particles. The crucial element in the development of a successful helper cell is the design of the helper virus. Researchers use recombinant DNA techniques to disable the helper virus in the test tube-one of the most common measures is removal of the Psi fragment. The Psi-deficient helper virus produces all of the normal viral proteins, but cannot package its own RNA because it lacks the appropriate packaging signal. Helper virus DNA is inserted into the genome of the helper cell using chemical techniques.

STEP 3

PRODUCING THE VECTOR

图23-4 Scientists use chemical measures or an infection technique to insert recombinant vector DNA (including a human gene) into helper cells. Because the vector provirus contains the Psi sequence, the vector RNA genome is automatically encapsulated by viral proteins produced by helper virus DNA in the helper cell. The resulting viral particles are released by budding from the helper cell membrane. The vector virus is capable of only one infection because it lacks the information needed to make viral proteins.

STEP 4

INFECTING THE TARGET ELL

图23-5 Researchers infect target cells (such as human bone marrow cells) with the vector virus in two different ways: they mix them with helper cells producing the virus, or they bathe them in fluid harvested from the helper cell culture. When the vector provirus is integrated into the target cell DNA ,enzymes from the target cell treat it as an integral part of the genome. Cellular enzymes do the work necessary to make proteins from the foreign genes located between the two viral L TRs.

非病毒载体:这类载体的发展较快,目前主要是脂质体,一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景,关于常见载体的优缺点列于表2。

表23-2 常见基因转运载体的优缺点

名称 机制 转染效率 用途 优缺点 影响因素
启动子

病毒启动子:如LTRS,CMV,SV40启动子在短时间后易于关闭,尤其是在逆转录病毒中

看家基因启动子:如二氢叶酸还原启动子可长期表达转基因,但水平很低。

组织/细胞特异性启动子:一些编码含量丰富蛋白的基因的启动子如肌肉中肌酸激酶的启动子能够进行特异性强表达

可诱导启动子:如金属硫蛋白基因的启动子,类固醇诱导的启动子可调节基因表达

其它调节转录的顺式作用调节元件

增强子,位点控制元件,内含子序列及编码序列本身可影响基因表达调节。

影响转录后表达的序列

3’-mRNA序列:对于稳定mRNA及进行翻译可能是必需的。

三、基因治病的靶向

基因治疗中的靶向问题是基因治疗中急待解决的问题。逆转录病毒载体是目前治疗中应用较为广泛且效果较好的载体。有关逆转录病毒靶向的研究已取得一些进展,使得基因治疗更为安全和有效。

(一)逆转录病毒转导的细胞类型的选择调节

Mo-HLV是一个可广泛转导多种细胞的病毒,为了使其仅感染某些专一性细胞就必须改变其感染谱。

1、改变Mo-HLV感染谱

按宿主范围可将Mo-HLV分为三类:单向性:只能感染啮齿类细胞;异向性:可感染除啮齿类动物细胞以外的其它的细胞;双向性:可感染人及啮齿类动物等大多数细胞。感染细胞的类型是由病毒的外壳蛋白env确定的。

(1)病毒与抗体的偶联:为了使逆转录病毒定向感染所需要的靶细胞,可将病毒与抗体偶联,该抗体则针对所需感染细胞上特有的抗原。如使单向感染病毒与抗人MHC-1。MHC-II的抗体偶联或与抗人表皮生长因子的抗体偶联后,可以感染人类细胞。Goud等使用此法使单向病毒感染人的肝细胞,可惜病毒未能整合入肝细胞基因组,可能其中还有其它原因。

(2)病毒外壳蛋白与配体偶联:  如将env蛋白与乳糖偶联成去延酸糖蛋白,用此法改造的单向逆转录病毒将不再感染原先的宿主而只感染人的肝细胞,因为只有肝细胞表面上含有去延酸糖蛋白的受体。

(3)改变病毒外壳蛋白的识别序列:已发现env蛋白与被感染细胞受体相识别部位的化学组成,如果改变核表位的基因序列,就可能改变感染细胞的类型,但Etienne等认为有一个潜在的、非病毒原有的表位与细胞受体识别之后不能使病毒内化。一种可行的方法是同时表达原有的env蛋白,就能解决内化问题。

2、使用其它逆转录病毒载体:

牛白血病逆转录病毒,猿免疫缺陷病毒,鼠乳腺肿瘤病毒有组织专一性感染的特点,有些研究组利用其作为载体。Page等采用HIV作为病毒载体,Rizvi等用BLV作载体,Morris等采用MMTV作载体,并构建了MMTV独特的包装细胞,使病毒滴度提高百倍以上,但同Mo-MLV相比,其它病毒的滴度偏低。

3、以嵌合逆转录病毒为载体

逆转录病毒感染谱是由病毒颗粒决定的,如果我们改变病毒颗粒蛋白,即保留毒gagpol基因,而env基因来自另一个逆转录病毒,即可改变感染宿主范围。Laudau等用鸟逆转录病毒和RSV的env基因取代 Mo-MLVR env基因,Miller等用长臂猿白血病病毒的env基因嵌合 Mo-MLVR成功感染了多种细胞,并取得较高的滴度,Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白,将血凝素成功地嵌入病毒外壳,并能有效感染人和鸟类细胞。Jane等用泡状口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白,使该病毒颗粒能成功地感染非哺乳动物如Zebra fish细胞,更重要的是这种病毒外壳可耐受超离心而不影响感染效率,因此有利于浓缩病毒,提高滴度。

(二)目的基因组织专一性表达的调节

许多组织专一性表达的调节片段已研究清楚,把这些片段与目的基因一起重组入逆转录病毒可用于基因的靶向表达。

1、肝专一性表达

肝专一性表达研究较多的是磷酸烯醇式酮酸羧激酶的启动子。McGrane  等用了转基因动物技术使该启动子表达外源基因,证明该启动子专一性地在肝和肾等中表达;Hatzoglau等用PEPCK启动子与neo基因或牛生长因子重组入逆转录病毒载体。克隆后经腹腔注射入子宫感染鼠胎肝或注入门静脉并切除部分肝,证实前病毒可整合肝细胞基因组,并持续表达了八个月之久,而且牛生长因子表达量受食物刺激信号的调节。

另一个肝专一性表达的片段是A-胰蛋白酶基因的顺式作用因子。Simon等的研究表明,α-AT基因上游是决定肝专一性表达的片段,(-137~37)为最短的肝专一性表达的片段。Peng等用α-AT的(-730-30)片段与SV40启动子融合驱动人苯丙氨酸羟化酶基因,使其在肝脏专一性表达,为苯丙酮尿症基因治疗奠定了基础。

α-FP为肝癌细胞特有的高效表达产物,Watanabe等发现其上游调控区(-3700~3300)决定了α-FP在肝癌中的专一性表达。Huber等将片段与你腺嘧啶激酶基因融合,克隆入逆转录病毒后转染肝细胞,然后给予无毒性原药-阿拉伯糖核苷,只有肝癌细胞才专一性地合成TK,批ara-MF转化成细胞毒性ara-ATP,造成肝癌细胞的死亡,而其它感染了α-EF-TK的细胞不受影响。

2、肌肉专一性表达

肌肉中高效表达的是肌苷激酶的调控片段。Johnson等发现MCK调控区有两个增强子:一个位于(-1256~1049),决定肌肉和心肌专一性表达,另一个位于第一内含子(738~1599),只决定在心肌的高效专一性表达。Cox等用这两个增强子使Dystrophin在肌肉的表达量增强50倍,完全纠正了mdr鼠肌肉病理变化,而且无付作用,最近,Yao等用2分MCK增强子(-1350~1048)使人凝血因子IX在肌母细胞中得到高效表达。

3、乳腺专一性表达

在乳腺中专一性表达的基因有β酪蛋白,乳清酸蛋白,鼠乳腺肿瘤病毒,三都调控区中的负调控片段决定他们仅在乳腺组织中表达。

4、黑色素瘤专一性表达

黑色素瘤特异性表达酪氨酸和酪氨酸相关蛋白。决定酪氨酸专一性表达的片段是在该基因上游(-270~1),决定TRP-1专一性表达的区域为(-640~165),Hart等用上述调控区与Gal报告基因融合,在人与鼠的黑色素瘤细胞中均检测到其表达。

5、胶质瘤专一性表达

目前已知鞘磷酸碱性蛋白基因上游(-1300~1)片段决定其在胶质瘤细胞中的专一性表达,Miyao等用该片段与HTK基因融合,转染胶质瘤细胞,在1μMganciclovir培养液中,90%胶质瘤细胞死亡,而对照组生长不受影响。

6、肺癌专一性表达

人表面活性蛋白A是大多数肺癌表达的物质。Smith 等用SPA-1上游(-2600~178)片段驱动HSV-TK基因,转化肺癌细胞株H441 ,给予ganciclovir后,H441大量死亡。

校对时间: 99-11-25 15:50 孟红霞

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