第二节 凝胶内沉淀试验
最常用的凝胶为琼脂糖。由于凝胶内沉淀试验具有高度的敏感性和特异性，且设备简单、操作方便，因而得到广泛应用。
该试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。适宜浓度的凝胶可视为一种固相的液体，水分占98%以上，凝胶形成网络，将水分固相化。抗原和抗体蛋白质在此凝胶内扩散，犹如在液体中自由运动。大分子(分子量为20万以上)物质在凝胶中扩散较慢，可利用这点识别分子量的差别。另外，由于琼脂网孔有一定的限度，抗原抗体结合后，复合物的分子量至少应在百万以上，这种超大分子则被网络在琼脂中，经盐水浸泡也只能去除游离的抗原或抗体，这对后面的分析带来极大的方便。
凝胶内沉淀试验可根据抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向扩散试验和双向扩散试验。
一、单向扩散试验
本试验是在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形成可分为试管法和平板法两种。
(一)试管法
该方法由Oudin于1946年报道。将血清或纯化抗体混入约50℃的0.7%琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，待凝固后，在凝胶中面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光处，极易观察这种白色不透明沉淀带。
沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响。溶液内含有多种抗原，在凝胶中含有各自的抗体，扩散后形成相应的抗原抗体复合物，出现多条区带。试管上部的沉淀带表示抗原量少或者抗体量多；反之，下面的沉淀带则是抗原量大，抗体量少。另外，抗体类型也有很大区别，如用兔抗血清(R型抗体)，抗体过量亦可形成复合物，因而沉淀带宽而界线不清；如用马抗血清(H型抗体)，抗原或抗体过量皆不形成复合物，因而只在比例合适处形成界线清晰的沉淀物(图12-1)。
图12-1两种抗血清形成的沉淀带示意图
(二)平板法
此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是：将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内(约50℃)，未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔(一般直径约3～5mm)，孔中加入抗原溶液，放室温或37℃让其向四周扩散，24～48h后可见周围出现沉淀环(图12-2)。
图12-2单向辐射状免疫扩散
上排为5个不同的参考中、下排为患者血清
下排右2为一异常病理血清
由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩散(singleradialimmunodeffusion，SRID)。最后，测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同时，这种沉淀还与分子量和抗散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法：
1.Mancini曲线适用于大分子抗原和长时间扩散(>48h)的结果处理。使用方格计算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系(图12-3)。
利用公式表示：C/d2＝K
图12-3Mancini曲线
T1为1624h；T2为24～48h；T3为48h以上；可见T3为直线，T1为反抛物线
式中C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数。
2.Fahey曲线这种曲线适用于小分子抗原和较短时间(24h)扩散的结果处理。使用半对数划线，浓度的对数与扩散圈直径之间呈线性关系(图12-4)。
用公式表示：log/d＝K
式中C＝抗原浓度(mg/d)，d＝沉淀环直径，K＝发常数。
各种蛋白质只要符合以下3条，几乎皆可用SRID定量测定：①备有仅对某待测抗原的单价特异抗血清；②备有已知含量的标准品；③待测品含量在1.25μg/ml以上(单向扩散技术的敏感度)。现在最常用于临床检测的项目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白。
在检测标本的同时，用已知含量的标准抗原作5～7个稀释度，同时测量圈的大小(见图12-2)。按扩散时间(Fahey和Mancini法)的不同，取方格纸或对数纸做标准曲线图。
单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，其重复性和线性皆是可信赖的，唯敏感度稍差(不能测μg/ml以下含量)。另外，以下影响因素也应注意。
1.抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而且还应注意存放的方法，防止效价下降。
2.标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长期应用。
3.测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。
4.有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率、但抗原性相同的两个组分。例如α重链病血清中出现的α重链和正常IgA发生反应，就形成内外两重环(图12-2)。
图12-4Fahey曲线
t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上可见t1为直线，t3为抛物线
5.在单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符，这主要出现在Ig测定中。如用单向克隆抗体或用骨髓抗原免疫动物获得的抗血清，都存在结合价单一的现象，若用此作为单向扩散试剂测量正常人的多态性抗原，则抗体相对过剩，使沉淀圈直径变小，测量值降低。
6.测得结果的假阳性升高现象与上面相反，如用多克隆抗体测定单克隆病(M蛋白)，则抗原相对过剩(单一抗原决定簇成分)，致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加。
二、双向扩散试验
在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。
(一)试管法
试管法由Oakley首先报道。先在试管中加入含抗体的琼脂，凝固后在中间加一层普通琼脂，冷却后将抗原液体加到上层。放置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散，在抗原与抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。此法分析效果与Oudin法相似，在临床检验中罕用。
(二)平板法
平板法由Ouchterlony首先报道，是抗原抗体鉴定的最基本方法之一。该法的基本步骤是：在琼脂板上相距3～5mm打一对孔，或者打梅花孔、双排孔、三角孔等(图12-5)。在相对的孔中加入抗原或抗体，置室温或37℃18～24h后，凝胶中各自扩散的抗原和抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。根据沉淀线的形态和位置等可作如下3种分析。
1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估计沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致。沉淀线如靠近抗原孔，则指示抗体含量较大；如靠近抗体孔，则指示着抗原含量较多。不出现沉淀线则表明抗体或抗原过剩。另外，如出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗体的纯度。
图12-5双扩散各种孔型图
2.抗原或抗体相对分子量的分析抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如若两者分子量相等，则形成。图12-6显示左侧沉淀线抗原分子量大于抗体，右侧沉淀线则抗体大于抗原，中间一条线则为两者相等。抗体多为IgG，分子量约15kD，未知抗原的分子量可做粗略估计。
图12-6抗原抗体相对分子量示意图
3.用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质完全相同、部分相同或完全不同。三种情况在双向扩散中表现的基本图形见图12-7。
从图12-7可以分析出，左图中两种受检抗原(Ag-a)完全相同，形成一个完全融合的沉淀线；右图中抗体为双价，两种抗原完全不同(Ag-a和Ag-c)；中图的抗体为双价，两种抗原(Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位，又有不同的b和c表位，所以沉淀线呈部分融合的形状。这种技术作为抗原的分析，是目前免疫化学中最常用的鉴定技术之一。
图12-7三种扩散基本图型
4.用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。
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