第二节 补体结合试验
补体结合试验(complementfixationtest，CFT)是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理
该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原)；②补体系统；③指示系统，即SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体(或抗原)，则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体(或抗原)，则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性(图14-2)。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图
二、试验方法
补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。
(一)试剂
1.抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2.抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100%不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单价)。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用2～4个单位(1:64～1:32)，抗体采用4个单位(1:8)。
表14-4抗原和抗体的方阵滴定
抗原 |
抗血清稀释倍数 |
抗原对照 | ||||||||||
| 1:4 |
1:8 |
1:16 |
1:4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
3 |
2 |
0 |
1:8 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
3 |
2 |
1 |
0 | |||
1:16 |
4 |
4 |
4 |
4 |
3 |
2 |
2 |
± |
0 | |||
1:32 |
4 |
4 |
4 |
4 |
3 |
1 |
± |
0 |
0 | |||
1:64 |
4 |
4 |
4 |
④ |
2 |
± |
0 |
0 |
0 | |||
1:128 |
4 |
2 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | |||
1:256 |
3 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | |||
1:512 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | |||
抗体对照 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||||
注：1、2、3、4分别表示溶血反应强度+、++、+++、++++；0为不溶血。
3.补体滴定按表14-5逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X计算，X＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。
表14-5补体的滴定
| 管号 |
1:60补体(ml) |
缓冲液(ml) |
稀释抗原(ml) |
致敏SRBC (ml) |
结果 | ||
1 |
0.04 |
0.26 |
0.1 |
放 置 37℃水 浴30min |
0.2 |
放 置 37℃水 浴30min |
不溶血 |
2 |
0.06 |
0.24 |
0.1 |
0.2 |
不溶血 | ||
3 |
0.08 |
0.22 |
0.1 |
0.2 |
微溶血 | ||
4 |
0.10 |
0.20 |
0.1 |
0.2 |
微溶血 | ||
6 |
0.14 |
0.16 |
0.1 |
0.2 |
全溶血 |
(二)血清标本
采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于-20℃。血清在试验前应先加热56℃30min(或60℃3min)以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：①加热提高12；②-20℃冻融后离心去沉淀；③以3mmol/L盐酸处理；④加入少量补体后再加热灭活；⑤以白陶土处理；⑥通入CO2；⑦以小白鼠肝粉处理；⑧用含10%新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。
(三)正式试验
以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2U为全溶，1U为全溶略带有少许红细胞，0.5U应不溶。如0.5U补体对照出现全溶表明补体用量过多；如2U对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。
表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序
| 反应物(ml) |
待检血清管 | 阳性对照管 | 阴性对照管 | 抗原对照管 | 补体对照管 | 红细胞对照管 | |||||
| 测定 | 对照 | 测定 | 对照 | 测定 | 对照 | 2U | 1U | 0.5U | |||
| 稀释血清 |
0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | - | - | - | - | - |
| 抗原 |
0.1 | - | 0.1 | - | 0.1 | - | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | - |
| 缓冲液 |
- | 0.1 | - | 0.1 | - | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.4 |
| 2U补体 |
0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | - | - | - |
| 1U补体 |
- | - | - | - | - | - | - | - | 0.2 | - | - |
| 0.5U补体 |
- | - | - | - | - | - | - | - | - | 0.2 | - |
| 混匀，置37℃1h或4℃16～18h | |||||||||||
| 致敏红 细胞 |
0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 混匀，置37℃30min后观察结果 | |||||||||||
三、应用和评价
补体结合试验是一种传统的免疫学技术，能够沿用至今说明它本身有一定的优点：①灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05μg/ml的抗体，可与间接凝集法的灵敏度相当。②特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。③应用面广，可用于检测多种类型的抗原或抗体。④易于普及，试验结果显而易见；试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。
补体结合试验可应用在以下几方面：①传染病诊断。病原性抗原及相应抗体的检测。②其他抗原的检测。例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等。③自身抗体检测。
但是补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁锁并且要求十分严格，稍有疏忽便会得出不正确的结果，所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。
(尹学念)
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