第十五章 血清脂类测定
血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。
目前，对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程，均必须检测血浆(清)中的脂类，通过其含量的变化，对临床疾患提供协助诊断的依据。有关医学科研工作，脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。
1.胆固醇测定
血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类：一类是化学法包括抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特异快速，并能自动化分析，已常规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。另外，三氯化铁-硫酸反应法(Zak法)具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点，缺点是特异性差，干扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清样品中的血红蛋白，胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局(NBS)出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，已供临床检测血清胆固醇使用。
2.甘油三酯测定
血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性，水解成甘油，并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再测定甘油，方法特异，准确而快速，临床广为应用。目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据，然而血清样品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在研究讨论这一问题。若不减去，其测定值将会高于血清样品中的真值，如果要减去，就必须先测出血清样品中的游离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做到。有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.07～0.13mmol/L，相当于甘油三酯的0.5～6.0mmol/L，为此建议，实测的甘油三酯量减去一个校正系数即：
甘油三酯(mmol/L)=[0.98×总甘油(mmol/L)]-0.07(mmol/L)。
这一校正系数也仅适用于健康人，对临床病人并不一定适用。据报道，血清样品的游离甘油一直是个未知数，无法测准。为此，目前临床测定血清甘油三酯时，基本上未考虑游离甘油，因为其含量很少，暂且忽略不记。甘油三酯测定的参考物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物(2：1，W/W)，此参考物适用于化学法。在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。
3.磷脂测定
血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。如需要分别检测各种磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。目前，临床仅测定血清磷脂总量。血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。化学法是以磷脂中的磷为定量依据，因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根，故将磷脂的磷称为脂性磷。由于血清中磷脂大部分为卵磷脂，其分子量中磷约占4%，故将脂性磷换算成磷脂的系数，一般为25。由于化学法均需要抽提，再测抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。酶法是利用磷脂酶进行定量测定。生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。磷脂酶D特异性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂，三者约占血清总磷脂的95%，临床多用含磷脂酶D 的试剂进行磷脂的定量测定。
4.游离脂肪酸测定
游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸，故又称为非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必须是灵敏的方法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。测定方法有：①滴定法需要微量滴定装置，因为要通过肉眼观察颜色，难免会有主观因素的影响，所以难以测定准确，很难用于常规；②光度法，以铜皂法常用；③酶法，主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测，方法特异，快速准确，已常规应用于临床。
第一节 胆固醇测定
血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1.化学法
化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。
2.酵法测定
CE在胆固醇酯酶(cholesterol esterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法
1.原理
血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2.试剂组成
代号 |
种类 |
浓度 |
组 成 |
贮存2～8℃ |
有效时间 |
| R1 |
乙醇 |
优质纯 |
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| R2 |
石油醚 |
沸点68℃，特级纯 |
|||
| R3 |
水醋酸 |
分析纯 |
|||
| R4 |
无水醋酸 |
胆固醇分析用，不含HCI |
|
||
R5 |
浓硫酸 |
分析纯 |
|||
R6 |
KOH液 |
33%(W/W) |
KOH10g+H2O 20ml |
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R7 |
乙醇性KOH液 |
R194ml+R66ml |
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临用前配制 | |
R8 |
Liebermann |
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配制后 | ||
Burchard |
|
R420体积+R51体积+R310体积 |
1h | ||
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试剂* |
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内用完 | ||
R9 |
胆固醇标准液 |
5.17mmol/L |
胆固醇标准品200mg+R1→100ml |
0 |
|
*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。
3.操作
图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图
按图15-1操作。
4.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)
首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下，生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
(一)手工测定法
1.试剂组成
代号 |
种类 |
浓度 |
组成 |
贮2～8℃ |
有效时间 |
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Na2HPO4 |
50mmol/L |
|
|
|
|
Na2H2PO4 |
50mmol/L |
|
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|
胆酸钠 |
3mmol/L |
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4-氨基安替比林 |
0.82mmol/L |
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R1* |
ESPAS |
14mmol/L |
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24h |
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Carbowax-6000 |
0.17mmol/L |
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|
CEH |
33U/L |
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|
COD |
117U/L |
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POD |
6700U/L |
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R2 |
标准液 |
5.17mmol/L |
用异丙醇溶解胆固醇 |
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|
*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。
2.操作
按图15-2操作。
3.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1.试剂组成
A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图
2.上机参数
项 目 |
参 数 |
方 法 |
终点法 |
波 长 |
双波长(540nm，700nm) |
反应温度 |
37℃ |
试剂A反应时间 |
2～3min |
试剂B反应时间 |
5～6min |
样本用量 |
3μl |
试剂A用量 |
250μl |
试剂B用量 |
120μl |
单位 |
mmol/L |
3.操作过程
4.计算
以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。
5.注意事项
(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
(2)试剂在有效内2～8℃避光食保存。
(3)胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。
校对时间：1999-12-16 马海茸
, http://www.100md.com