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第四节 非酯化脂肪酸测定
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第四节 非酯化脂肪酸测定

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterified fatty acid,NFFA),正常血清中含有油酸(18:1,W9)占54%,软脂酸(16:0)占34%,硬脂酸(18:0)占6%,是其主要的NFFA。另外还有月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)和花生四烯酸(20:4,W6,9,12,15)等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较,NFFA在血中浓度很低,其含量水平极易受脂代谢,糖代谢和内分泌机能等因素影响,血中NFFA半寿期为1~2min,极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输,属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清NFFA法有滴定法。比色法,原子分光光度法,高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在,极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内,若保存三天,其值约升高30%,使结果不准确。

1.非酶法测定

非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差;高压液相层析法,仪器太昂贵,不便于批量操作。

2.酶测定法

主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A(CoA)进行定量。酶法测定结果准确可靠,快速,易于批量检测。测定原理如图15-6所示。

图15-6 血清主要FFA酶法测定图

□:内物质作为生成量与变化量进行测定;ACS:乙酰CoA合成酶;MK:肌激酶;   PK:丙酮酸激酶;POD:丙酮酸氧化酶;DTNB:α-磺基苯甲酸;ACO:乙酰CoA氧化酶;ACD:乙酰CoA脱氢酶。

一、光度法

1.原理

血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中,形成铜皂在上层溶剂中,再用二苯卡巴肼与铜显色,进行定量。

2.试剂组成

代号

种类

浓度

组成

贮存2~8℃

有效期

R-1

抽提剂

氯仿:庚烷:甲醇=5:5:1(V/V)

R-2

缓冲液

33mmol/L

KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4<·2H2O5.983g/L 50ml调pH至6.4

R-3

铜贮液

500mmol/L

Cu(NO3)2·3H2O 12.07g加H2O→100ml

 

R-4

三乙醇胺

1.0mol/L

三乙醇胺10ml,加水→100ml

 

R-5

NaOH液

1mol/L

 

R-6

铜试剂

R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml

+H2O→100ml调pH至8.1

 

 

R-7

二苯卡
巴肼液

 

二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-4 0.1ml

临用前配制

R-8

软脂酸标准贮存液

2mmol/L

软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液

冷藏

R-9

R-8的应用液

500μmol/L

用R-1液稀释

冷藏

3.操作

按图15-7操作。

4.计算

血清游离脂肪酸(μmol/L)=ESA/EST×500

二、酶法

1.原理

血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA),经酶试剂作用生成紫色化合物,其颜色深浅与NEFA含量成正比。

2.试剂组成

代号

种类

组成

浓度贮存

贮存

R1

缓冲液

磷酸缓冲液
MgCl2
去垢剂

0.04mmol/LpH6.9
3mol/L

 

R2

酶/辅酶

乙酰CoA合成酶
抗坏血酸氧化酶
CoA

ATP

4-AAP

溶于10ml R1液中

≥0.3U/ml

≥1.5U/ml

0.9mmol/L

5.0mmol/L

1.5mmol/L

冷藏5日

R3

酶稀释液

 苯氧乙醇

去垢剂

0.3%(V/V)

 

R4

 

马来酰亚胺

该试剂与R3等体积混合

10.6mmol/L

 

R5

酶试剂

乙酰CoA氧化酶

过氧化物酶

TOOS

混合上述试剂,再等体积R4试剂混合

≥10U/ml

7.5U/ml

0.2mmol/L

冷藏5日

R6

标准液

1mmol/L

冷藏

*应用带玻塞离心管

3.操作

按图15-8操作。

4.计算

图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

图15-8 血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图

(胡汉宁 储建中)

参考文献

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校对时间:1999-12-16 马海茸

, 百拇医药