第三节 单向免疫扩散法
一、原理
将抗载脂蛋白血清均匀地混合于琼脂糖凝胶内，打孔，加样。孔中待测样品的抗原辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原Apo含量成正比。
二、试剂
1.0.05mol/L pH8.2巴比妥钠-HCl缓冲液；巴比妥钠15.8g加水至1000ml。以1.17mol/LHCl调pH至8.2，约1.17mol/L Hcl(浓HCl 19.3ml加水180.7ml)18.36ml，最后以蒸馏水补足至1421.8ml。
2.24.0g/L琼脂糖：优质琼脂糖粉2.4g，硫柳汞0.01g，加0.05mol/LpH8.2巴比妥钠HCl缓冲液100ml，加热融化后，根据浇注板的大小分装，每管5.8ml、3.4ml、1.5ml，加塞后4℃或室温保存。
3.0.1g/L硫柳汞生理盐水：1000ml生理盐水中含硫柳汞0.1g。
4.抗血清：临用前根据浇注板的大小，按效价稀释。
三、操作
1.浇注琼脂糖凝胶板
取“凹”型有机玻璃框架，厚1.6mm，两边夹6×12cm玻璃，再用铁夹夹紧玻璃待用。
加热融化24.0g/L琼脂糖，56℃水浴保温。根据抗Apo血清效价，按表18-19进行配制。
表18-19 含抗血清琼脂糖板配制法
试 剂 |
抗 血 清 RID 法 效 价 | |||||
| 20 |
25 |
30 |
40 |
60 |
80 | |
| 24.0g/L琼脂(ml) |
5.80 |
5.80 |
5.80 |
5.80 |
5.80 |
5.80 |
| 硫柳汞盐水(ml) |
5.22 |
5.34 |
5.41 |
5.51 |
5.61 |
5.65 |
| 抗血清(ml) |
0.58 |
0.46 |
0.39 |
0.29 |
0.19 |
0.15 |
将稀释的抗血清倾入已融化的琼脂糖中，颠倒混匀1～2次，避免产生气泡，迅速浇注预置水平位置的双层玻板内，待凝。抗血清效价高时，亦可直接将抗血清混入12.0g/L琼脂中，摇匀后制板。
2.按模式图用直径3mm的金属管打孔，6×12cm免疫扩散板打孔28个，6×8cm免疫扩散板打孔16个。
3.待测血清用硫柳汞盐水稀释(按说明书)，用微量加样器每份标本加1孔。加样量10μl。置湿盒(水平位置)37℃扩散24h，测沉淀环直径，如图18-2所示。
图18-2 单向免疫扩散图(0.8%琼脂糖)
4. 标准曲线的制备(参考方法)
(1)参考血清稀释法：取Apo含量标准参考血清用盐水稀释成梯度浓度。ApoAⅠ：20、40、60、80、100mg/dl，同上法操作加样，每一稀释浓度应在两块板的不同位置各加样孔，每孔5μl。37℃湿盒扩散24h，测沉淀环直径，求出各稀释度均值。制作标准曲线。
(2)用半对数纸制作：以抗原含量为纵坐标(对数)，沉淀环直径为横坐标，在半对数纸上作图。一般要求至少有4个不同稀释度。增加标准曲线上的点数；可增加其可靠程度。
(3)用推算平均值法制备标准曲线：RID定量法尽管严格遵守所有的试验条件，但不同浓度所求得的沉淀环直径，在绘制曲线时仍然常不在一条直线上，推算平均值法是通过数学方法处理，使不在标准曲线上的各点回归到同一直线上来。可用公式logy=ax+b表示。
结果判断
根据待测血清在含抗Apo血清免疫扩散板上形成的沉淀环直径，查标准曲线即可行相应Apo的含量。可以mg/dl报告，也可以国际单位报告(g/L)
校对时间：1999-12-21 马海茸
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