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第二节 细胞因子的结构和生物学特征
http://www.100md.com 《细胞与分子免疫学》

第二节  细胞因子的结构和生物学特征

由于基因工程技术的迅速发展,许多细胞因子的cDNA克隆获得成功,并获得了高活性基因表达产物,这给细胞因子的细胞生物学和分子生物学的研究提供了必要的前提。目前已有IL-2、EPO、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ和IFN-α等细胞因子投放市场,有更多的细胞因子正在进行不同期的临床验证。细胞因子在正式投入市场成为商品前,必须经过临床前筛选实验、临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期试用等几个阶段的验证。

一、白细胞介素(IL)

在1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上,将来自单核-巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素(interleukin,IL)。目前已知许多IL是来自单核-巨噬细胞和淋巴细胞以外的其它细胞。已正式命名的白细胞介素有IL-1~IL-15。

(一)IL-1

IL-1是一种单核因子。1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质,这种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素(PHA)的有丝分裂反应。起初命名为淋巴细胞激活因子(lymphocyte-activating factor,LAF)或内源性热原质(endogenous pyrogen)、破骨细胞激活因子(osteoclast activating factor)、黑素瘤细胞生长抑制因子(melanoma growth inhibitory factor)等,1979年国际统一命名为IL-1。

1.IL-1的产生 IL-1可由多种细胞合成和分泌。

(1)单核细胞、巨噬细胞(如腹腔粘连细胞peritoneal cell,PC)、树突状细胞等在摄取抗原抗体复合物后或在抗原提呈过程中可产生IL-1。在大多数刺激剂刺激外周血单个核细胞(PBMC)条件下,IL-1βmRNA水平要高于IL-1αmRNA 20~25倍。

(2)小鼠巨噬细胞细胞系P388D1、J774、PU5-1.8、WEHI-3以及人前单核细胞株U937等在脂多糖(LPS)刺激后都能分泌大量的IL-1。

(3)表皮细胞、NK细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脑胶质星状细胞、肾小球系膜细胞(mesangial cell)、滑膜衬里细胞(synovial lining cell)、平滑肌细胞、上皮细胞、胎盘细胞、白血病细胞、PMN等在某些条件下亦可产生IL-1。

许多因素可以直接影响单核-巨噬细胞IL-1的分泌:①细胞因子如巨噬细胞激活因子(MAF)、集落刺激因子(CSF)、IFN-α、IFN-γ对IL-1产生具有增强作用。②LPS、PPD、BCG和李斯特菌,葡萄球菌、链球菌外毒素,活病毒等也是IL-1产生的刺激剂。在外周血中20pg/ml内毒素刺激单核细胞即可产生IL-1,因此在一般培养条件下,由于微量内毒素的污染可刺激单核细胞分泌IL-1。10ng/mlLPS可使单核细胞合成IL-1增加100倍。③蛋白激酶C(PKC)的激活剂乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate,PMA)以及钙离子载体(calcium ionophore)如A23187均具有强烈的刺激作用。④皮质类固醇和前列腺素则对IL-1的产生有抑制作用。

2.IL-1的分子结构和基因 完整的人IL-1α和IL-1β基因组分别为10.5kb和7.8kb。人和小鼠IL-1基因定位于2号染色体,均含7个外显子。IL-1前体(ProIL-1)为31kDa,通过蛋白水解酶裂解形成成熟的IL-1分子。IL-1在不同种属中有较高同源性。在氨基酸水平上,IL-1α和IL-1β在不同种属同源性分别为60%~70%和75%~78%;但在同一种属中IL-1α与IL-1β同源性只有25%。人IL-1α(PI5.0)和IL-1β(P17.0)分别由159和153个氨基酸残基组成,分子量约17.5kDa,同源性为28%。IL-1对糜蛋白酶敏感。不同细胞所产生IL-1的等电点可有所差异。

3.IL-1的受体 T细胞、成纤维细胞表面IL-1受体为80kDa,而B细胞则为68kDa。编码这两种IL-1受体是不同基因产物。P80IL-1R称为IL-1RtI(CDw121a),P68IL-IR称为IL-1RtⅡ(CDw121b)。

表4-1  IL-1 Rt Ⅰ和IL-1RtⅡ的比较

IL-1 RtⅠ IL-1RtⅡ
IL-1β>IL-1α
易内化 易降解

(1)IL-1RtⅠ:IL-1RtⅠ cDNA克隆在人和鼠均已获得成功。IL-1RtⅠ为穿膜蛋白,胞膜外区有3个结构域属免疫球蛋白超家族,穿膜区有20个氨基酸残基,胞浆区含有丝氨酸和苏氨酸残基,当IL-1与IL-1RtⅠ结合后丝氨酸和苏氨酸很快被磷酸化。通过基因转染Hela细胞实验证明,IL-1RtⅠN端2个结构域与配体结合有关。针对N端17个氨基酸片段的McAb能阻断IL-1RtⅠ与IL-1结合。IL-1与IL-RtⅠ结合后即发生内化(internalization)。成纤维细胞、平滑肌细胞主要表达IL-1RtⅠ。一般来说,IL-1RtⅠ可与IL-1α和IL-1β相结合,但IL-1α与Ⅰ型受体结合能力较高,而IL-1β与Ⅱ型受体结合较高。IL-1与不同种属不同细胞结合后的生物学效应有所差别,如人和鼠IL-1α结合到人内皮细胞上的亲和力相同,但产生的生物学效应不完全相同。抗IL-1RtⅠMcAb在体内和体外均可抑制IL-1在生物学效应。

(2)IL-1RtⅡ:主要分布于EBV转化的B细胞、Raji细胞、巨噬细胞、胎盘、Th2克隆、活化T细胞、PMN和骨髓细胞等。胞膜外区有3个结构域属免疫球蛋白超家族,与IL-1RtⅠ之间有28%氨基酸同源性,穿膜区有更高的同源性,但胞浆区要比Ⅰ型受体短,可能在介导信号传递上有差别。IL-1与IL-1RtⅡ结合后易发生降解而不象IL-1RtⅠ那样发生内化。IL-1RtⅡ经蛋白水解酶水解后可形成可溶性的IL-1结合蛋白(soluble IL-1 binding protein,sIL-1BP),46kDa,与IL-1β有较高亲和力,在自然情况下sIL-1BP是IL-1β的抑制剂。可溶性IL-1R(soluble IL-1 receptor,sIL-1R)可有效防止小鼠心脏移植排斥反应,减轻Lewis大鼠的实验性关节炎和过敏性大脑炎。

在T细胞中,CD4阳性细胞亚群IL-1受体表达要高于CD8阳性T细胞亚群。以小鼠胸腺瘤细胞系EL-4为模型,发现IL-1α和IL-1β可结合到相同的高亲和力受体。现已发现联合免疫缺陷病人的T细胞表达IL-1R缺陷,对抗原刺激不发生增殖反应,也不产生IL-2,病人易患机会致病菌感染。

4.IL-1受体拮抗物 在某些白血病患者血清和尿中以及单核细胞培养上清中发现一种多肽性质的IL-1特异性抑制因子,称为IL-1受体拮抗物(interleukin 1 receptor antagonist,IL-1ra),又称IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist protein, IRAP)。

(1)IL-1ra的产生:IL-1ra体外可由LPS刺激的单核细胞,PMA、PHA、CSF刺激的单核细胞系产生。

(2)IL-1ra分子的结构和基因:IL-ra基因克隆1990年获得成功,编码人IL-1α、IL-1β和IL-1ra基因都定位于2号染色体。IL-1ra cDNA编码的多肽为17kDa,糖基化后分子量为25kDa,但糖基对IL-1ra活性并非必需。未成熟的IL-1ra分子为177个氨基酸残基的肽链,N端25个氨基酸多为疏水性氨基酸,构成典型的信号肽顺序。成熟分子由152个氨基酸残基组成。在65、68、116及122位上有4个保守的半胱氨酸残基,Cys65-116,Cys68-122间形成链内二硫键。从cDNA推算的氨基酸序列IL-1ra与IL-1α和IL-1β分别有19%和26%的同源性,人和小鼠的IL-1ra有77%同源性。

(3)IL-1ra的生物学作用:IL-1ra能特异性地抑制T细胞表面IL-1R与IL-1结合,但不抑制TNF或IL-2与相应受体的结合。IL-1ra不与IL-1直接结合,而是一种IL-1与IL-1R相互结合的竞争性抑制物。rIL-1ra与Ⅰ型和Ⅱ型IL-1R都能结合,但与IL-1RtⅠ结合的亲和力要高于与IL-1RtⅡ结合的亲和力。rIL-1ra、rIL-1α、rIL-1β与IL-1RtⅠ结合的亲和力比较相近,但rIL-1ra、rIL-1α与IL-1 RtⅡ结合的亲和力要低于rIL-1β与IL-1RtⅡ结合的亲和力。IL-1ra能抑制IL-1刺激滑膜细胞PGE2的产生和软骨细胞胶原酶合成,抑制胸腺细胞的增殖以及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与内皮细胞的粘附。在体内可抑制IL-1引起的发热。IL-1ra可结合T细胞和成纤维细胞表面IL-1RtⅠ ,也能抑制IL-1与PMN、B细胞、髓样单核细胞白血病细胞IL-1RtⅡ的结合。IL-1ra可抑制PBMC、骨髓细胞衍生的髓样淋巴细胞白血病细胞自发增殖和自发产生IL-1、IL-6和GM-CSF。在体内,IL-1ra可阻止LPS引起的家兔死亡,减轻免疫复合物所诱导的炎症,抑制小鼠骨髓移植后GVHR的发生,提高存活率,此外,还可防治动物实验性溃疡性结肠炎。

(4)IL-1ra与临床:正常人血清IL-1ra水平在200pg/ml以下,感染、炎症以及内毒素血症病人血清中IL-1ra水平可升高到8ng/ml。应用IL-1ra治疗败血症已进入Ⅲ期临床验证,死亡率明显下降。此外IL-1ra治疗类风湿性关节炎也已开始在临床验证。IL-1ra在体内的副作用很小,但应用剂量较大,阻断IL-1 50%生物学效应时所用IL-1ra的用量是IL-1用量的10~500倍。

5.IL-1的生物学作用 IL-1具有广泛的免疫调节作用,并有致热和介导炎症的作用,它的生物学功能是通过与相应高亲和力受体结合而介导的,IL-1生理条件下的浓度仅在10-12~10-14M之间。IL-1作用无明显的种属特异性,人IL-1可作用于小鼠源性的细胞。主要表达IL-1RtⅡ的细胞似乎比表达IL-1RtⅠ细胞相对有种属特异性。

(1)促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化:T细胞经抗原、有丝分裂原或抗TCR/CD3刺激后表达IL-1受体,在IL-1作用下T细胞被活化,由G0期进入G1期。活化后的T细胞分泌IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4等细胞因子,并表达IL-2受体进而T发生增殖和分化。IL-1还可增加T细胞表面MHCⅡ类抗原的表达。IL-1能诱导杀伤性T淋巴细胞(CTL)的分化,在混合淋巴细胞培养(MLC)中,IL-1诱导CTL的产生可能是通过促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ。IL-6可协同IL-1活化T细胞和刺激IL-2的产生。

(2)促进B细胞功能:协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的增殖和分化,促进免疫球蛋白的合成和分泌,这种作用可能是通过IL-1诱导PBMC产生IL-6而介导的。

(3)刺激骨髓多能干细胞的增殖:现已证实IL-1与Stanley(1986)报道的血细胞生成素-1(hemopoietin-1)是同一种分子。IL-1刺激造血细胞和成纤维细胞产生CSF,增加造血细胞CSF受体的数量,并协同IL-3、IL-6、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF等因子刺激造血功能,对粒单系祖细胞和巨核系祖细胞均有刺激作用。此外,IL-1可刺激干细胞产生SCF,IL-1本身可作用早期干细胞,激活干细胞从Go期进入增殖周期。IL-1能预防化疗造成的骨髓抑制已进入临床Ⅱ期验证。

(4)增强NK细胞的杀伤活性:通过提高NK细胞对IL-2等细胞因子的敏感性增强其杀伤活性,IL-1与IL-2或IFN有协同刺激NK细胞活性的作用。

(5)促进多种免疫分子的基因表达:如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、TNF-α、TNF-β、INF-β、G-CSF、GM-CSF、GM-CSF,IL-2Rα链(Tac),补体C2、Bf,粘附分子以及c-fos、c-myc和c-jun等原癌基因的表达。C-fos和C-jun组成活化蛋白-1(AP-1),活化IL-2基因的启动子,诱导B细胞κ链核因子(NF-κB)活化免疫球蛋白κ链基因,诱导NF-IL-6转录因子活化IL-6启动子。

(6)刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF,并通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导对中性粒细胞的趋化作用。此外,IL-1诱导内皮细胞活化,刺激中性粒细胞释放炎症蛋白和炎症介质,直接参与炎症发生过程。

IL-1与TNF生物学性质,尤其在非免疫性作用方面较为相似(见表4-8)。抗TNF-α中和抗体可预防内毒素引起的休克,同时降低了IL-1和IL-6水平,表明在某些条件下,IL-1水平受到TNF的调控。

6.IL-1与临床

(1)发热:IL-1是一种内源性热原质(endogenous pyrogen), IL-1引起发热作用与内毒素不同,IL-1对热敏感,反复注射不产生耐受。IL-1引起发热的机理之一可能是IL-1促进单核-巨噬细胞释放PGE2,刺激下丘脑体温调节中枢,引起发热。阿斯匹林、消炎痛等抑制PGE2的合成,可作为解热剂。PGE2对IL-1产生有负反馈作用。老龄人或癌症患者PBMC中单核细胞产生IL-1能力低于正常人,可能与感染后不易出现明显发热等临床症状有关。

(2)促进肝细胞合成急性期蛋白(acute phase protein):如C-反应蛋白、血清淀粉样A蛋白(serum amyloid A protein,SAA)和α酸性糖蛋白(α-acid glycoprotein,αAGP)以及某些补体的组分,有利于机体抵抗病原微生物等,是机体非特异性防御因素之一。低剂量IL-1可提高动物对脑型和恶性疟疾的抵抗力。

(3)对间质细胞和其它细胞的作用:类风湿关节炎关节囊内巨噬细胞受到刺激和活化后可分泌IL-1,刺激滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞分泌大量PGE2、胶原酶和中性蛋白酶等,从而使关节中的胶原组织降解,骨质吸收,局部血管通透性增加,直接参与关节的病理损伤。多种关节炎的关节液中可测出高水平IL-1。IL-1还可刺激脑组织神经胶质细胞增生,形成瘢痕,与癫痫发作可能有关。此外,IL-1刺激肾小球系膜细胞增生,导致肾实质纤维化和慢性肾功衷竭。

(4)抗肿瘤作用:由于IL-1能协同IL-2、IFN-γ诱导CTL和NK细胞的杀伤活性,促进杀伤细胞IL-2受体的表达以及成纤维细胞分泌IL-6,因此具有抗肿瘤作用。临床已试用IL-1治疗肿瘤。

(5)抗放射作用(radioprotective):小鼠注射IL-1 100ng在950R照射条件下可提高白细胞水平,延长存活时间,能预防放疗造成的骨髓抑制。临床上已试用IL-1治疗骨髓移植。最近在动物实验中发现IL-1能降低血糖水平,有可能成为治疗糖尿病的新药。

(二)IL-2

1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子,由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养,称为T细胞生长因子(T cell growth factor,TCGF),1979年统一命名为白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)。

1.IL-2的产生 IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。

(1)CD4阳性或CD8阳性T细胞:有丝分裂原刺激CD4阳性或CD8阳性T细胞亚群均可产生IL-2;同种异体抗原主要刺激CD4阳性T细胞分泌IL-2。PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺中的T细胞受到刺激后都能产生IL-2。在小鼠Th细胞中,只有Th1亚群可产生IL-2。

(2)T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系:人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体(如A23187)或PMA刺激下可产生高水平的IL-2。如长臂猿T细胞系MLA144可自发产生IL-2,小鼠胸腺瘤细胞系EL-4和人Jurkat细胞静止状态不合成和分泌IL-2,刺激后可分泌高水平的IL-2。

(3)T淋巴细胞杂交瘤:T淋巴细胞杂交瘤123,FS6-14.13,HT-24A等在ConA刺激下产生IL-2。

(4)应用基因工程技术制备:1983年Taniguchi等从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功IL-2cDNA,并在大肠杆菌中得到高水平的表达。目前应用基因工程技术所制备和纯化的IL-2已用于临床治疗某些肿瘤和其它疾病。

2.IL-2的分子结构和基因 人IL-2含有133氨基酸残基,分子量为15.5kDa。天然IL-2在N端含有糖基,但糖基对IL-2的生物学活性无明显影响,等电点在6.6~8.2。IL-2分子含有3个半胱氨酸,分别位于第58、105和125位氨基酸,其中58位与105位半胱氨酸之间所形成的链内二硫键对于保持IL-2生物学活性起重要作用。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中,如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。现已有应用点突变,将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基,使只能形成一种二硫键,保证了在IL-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2,将IL-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸,改构后IL-2比活性比天然IL-2明显增加。人IL-2基因定位于第4号染色体,长约5kb,由4个外显子和3个内含子组成。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63%同源性。

3.IL-2的受体 IL-2R是由α、β和γ三条链组成。

(1)IL-2Rα链:Uchiyama(1981)首次制备了抗活化T细胞抗原Tac的McAb,与IL-2相互竞争结合到Tac阳性细胞。Tac的分子量为55kDa。1984年Leonard将Tac分子的cDNA克隆成功。Tac分子为糖蛋白,由272个氨基残基组成,包括21个氨基酸残基信号肽,成熟分子含251个氨基酸,含有多个半胱氨酸,2个N-糖基化位点,穿膜区和胞浆区分别含19和13个氨基酸残基。人Tac的基因定位于第10号染色体,包括8个外显子和7个内含子,长约25kb。Tac(p55)即为IL-2受体α链(或亚单位),又称CD25,是活化T淋巴细胞的标志。在骨髓移植中如除去Tac阳性供体细胞可以降低移植物抗宿主反应(GVHR),现已进入Ⅱ期临床验证。也可用抗IL-2R McAb选择性地封闭、消除活化的效应细胞,从而治疗同种异体移植物排斥反应及某些自身免疫性疾病。

(2)IL-2Rβ链:分子量70kDa,故又称p70,在人白细胞分化抗原中编号为CD122。人IL-2Rβ链基因定位于22号染色体。成熟IL-2Rβ链有525个氨基酸,5个N糖基化位点,包括胞膜外区、穿膜区和胞浆区。胞膜外区由214个氨基酸组成,有8个Cys,其结构上有1个红细胞生成素(EPO)受体超家族特征性的结构域,还有1个Ⅲ型纤维粘连蛋白结构域。跨膜区25个氨基酸。胞浆区有286个氨基酸,与EPO受体胞浆区有一定的同源性。IL-2Rβ链本身无酪氨酸激酶区,但胞浆区中有两个结构域:一个是靠近膜端的丝氨酸富含区,在IL-2诱导的增殖信号传递中起重要作用;另一个是与酪氨酸激酶相联的酸性区域。缺乏酸性区域的IL-2Rβ链突变体能传导增殖信号,并诱导转录c-myc,不能介导诱导转录因子Fos的作用;缺乏丝氨酸富含区的IL-2Rβ链突变体不能诱导细胞增殖及c-myc的转录。因此,酪氨酸激酶途径似乎与c-fos 基因的诱导有关,而非激酶依赖的途径与c-myc基因的诱导有关。IL-2Rβ链主要分布于T细胞、大颗粒淋巴细胞(LGL)、B细胞、pre-T细胞。

(3)IL-2Rγ:糖蛋白,含347个氨基酸,分子量64kDa。胞膜结构特征属于红细胞生成素家族成员,胞浆区含86个氨基酸,从288~321位氨基酸序列似乎同源于src同源区2(SH2),此区能与一些磷酸化蛋白中磷酸化酪氨酸残基相连,参与信号的转导。IL-2Rγ链表达于多种淋巴样细胞表面,如Molt-β、Molt-4、Jurkat、MT-1、MT-2以及EB病毒感染的Raji细胞。

(4)IL-2R的组成与亲和力的关系:单独IL-2Rγ链不能结合IL-2,但对于中亲和力IL-2R(βγ链)、高亲和力IL-2R(αβγ链)的组成、IL-2的内化以及信号转导是必需的。X-性联重症联合免疫缺陷症病人的IL-2Rγ基因发生突变而丧失IL-2R功能。

表4-2  三种亲和力IL-2R的组成

组成 亲和力(Kd) 细胞分布举例
(5)可溶性IL-2R:可溶性IL-2R(soluble IL-2 receptor,sIL-2R)是膜结合形式IL-2Rα链的脱落物,分子量45kDa。在人类T细胞白血病Ⅰ型病毒(HTLV-I)感染的HUT102B2细胞培养上清中含有大量sIL-2R。PBMC经丝裂原、CD3 McAb和同种异体抗原刺激后可释放sIL-2R。正常人血清和尿液中亦可检出少量sIL-2R。sIL-2R可能与膜表面IL-2R(mIL-2R)竞争结合IL-2,从而成为一种免疫抑制物质。sIL-2R增高可见于某些恶性肿瘤、自身免疫病、病毒感染性疾病以及移植排斥等(见本章第三节)。

4.IL-2 的生物学作用 IL-2 的作用具有沿种系谱向上有约束性,向下无约束性的特点,如人的IL-2 能促进小鼠T细胞的增殖,而小鼠的IL-2 不能维持人T细胞的生长。IL-2体内的半衰期只有6.9分钟。有报道用PEG对IL-2加以修饰,对生物学活性无影响,半衰期可延长7倍左右。目前关于IL-2 的生物学作用大都是体外实验的结果。具有中和活性的抗IL-2 抗体可抑制IL-2 的生物学活性。

(1)Th、Tc和Ts细胞都是IL-2 的反应细胞:IL-2 对静止T细胞作用较弱。胸腺细胞和T细胞经抗原、有丝分裂原或同种异体抗原刺激活化后有在IL-2 存在的条件下进入S期,维持细胞的增殖。IL-2 可刺激T细胞转铁蛋白受体(TfR,CD71)、胰岛素受体、MHCⅡ类抗原的表达,并产生多种淋巴因子如IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-β及CSF等。

(2)诱导CTL、NK和LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能,并诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子。IL-2可增强CTL细胞穿孔素(perforin)基因的表达。

(3)直接作用于B细胞,促进其增殖、分化和Ig分泌。已发现活化的B细胞也可具有IL-2 R,IL-2 对B细胞的调节作用除通过刺激T细胞分泌B细胞增殖和分化因子外,还可能有直接的调节作用。

(4)活化巨噬细胞。

5.IL-2 的临床应用 目前重组IL-2 已用于临床治疗肿瘤以及感染性疾病等。

(1)抗肿瘤:IL-2 在体外可诱导PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)成为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。LAK/IL-2对肾细胞癌、黑素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌有较明显疗效,对肝癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的疗效。近年来已开始采用IL-2 基因治疗对黑素瘤、肾细胞癌以及神经母细胞瘤等肿瘤等进行临床验证。

(2)治疗感染性疾病:动物实验结果表明,IL-2 对某些因细胞免疫功能低下而受病毒感染,需增强细胞免疫功能的病人有一定疗效。IL-2 本身无直接抗病毒活性,它是通过增强CTL、NK活性以及诱导IFN-γ产生而介导抗病毒感染的。目前用IL-2 治疗活动性肝炎已显示出可喜的苗头,对于单纯疱疹病毒感染、AIDS病(已进入Ⅱ期临床验证)、结节性麻风、结核杆菌感染等也有一定疗效。如rIL-2明显延长结核杆菌H37RV株感染小鼠和豚鼠的半数死亡时间,降低死亡率,减少感染动物脾、肺组织内的结核杆菌数。

(3)免疫佐剂作用(adjuvanticity):应用IL-2作为佐剂与免疫原性弱的亚单位疫苗联合应用,可提高机体保护性免疫应答的水平。此外,最近发现IL-2具有降低血压作用,IL-2治疗高血压已进入Ⅰ期临床验证。

(4)采用IL-2白喉毒素融合蛋白治疗类风湿性关节炎进入Ⅰ/Ⅱ期临床验证,约有74%患者病情得到改善,IL-2融合毒素主要作用于CD4阳性淋巴细胞,有较好的选择性。

rIL-2体内大剂量使用毒性作用较大,可引起毛细血管渗漏综合征(capillary leak syndrome,CLS)。此外,IL-2半衰期短,有时还可在体内诱导产生一定抗体。

美国Immunex应用抗IL-2Rα链McAb预防骨髓移植后GVHR进入Ⅱ期临床试验。

(三)IL-3

见本节集落刺激因子。

(四)IL-4

1982年Howard发现T细胞培养上清中有一种促进B细胞增殖的因子,起初命名为B细胞生长因子-1(B cell growth factor-1,BCGF-1)。有的实验室称为B细胞刺激因子-1(B cell stimulating factor-1,BSF-1)、T细胞生长因子-2(T cell growth factor-2,TCGF-2)。1986年基因克隆成功,国际统一命名为白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)。

1.IL-4的产生 在人类IL-4主要由活化T细胞产生。在小鼠由Th2亚群产生。此外,肥大细胞、IL-2刺激小鼠T细胞系2.19、ConA刺激人Th克隆2F1、小鼠胸腺瘤EL-4细胞以及B细胞系CH12均能分泌IL-4。

2.IL-4的分子结构和基因 小鼠IL-4基因长约6kb,成熟IL-4分子由120氨基酸残基组成,裸肽分子量为14kDa,有3个糖基化点,经糖基化后IL-4分子量为30kDa。人IL-4基因定位于第5号染色体,由4个外显子和3个内含子组成,约10kb,是现知淋巴因子基因中较大的一个。成熟人IL-4分子由129氨基酸残基组成,15kDa,有2个糖基化点,含有6个半胱氨酸,参与分子内二硫键的组成。人与鼠IL-4 DNA水平上有70%同源性,IL-4前体蛋白从N端到91位氨基酸以及C端到128位氨基酸人小鼠之间在氨基酸水平上有70%同源性,前体蛋白91至128位氨基酸之间很少有同源性,这可能与IL-4种属作用特异性有关,如人、鼠IL-4生物学作用上没有交叉反应。

3.IL-4的受体人 IL-4受体(IL-4R)由800氨基酸残基组成,分子量为140kDa,胞膜外区207氨基酸,跨膜区24氨基酸,胞浆区569氨基酸,与小鼠IL-4R有53%同源性,属于红细胞生成素受体超家族成员,最近命名为CDw124。在小鼠,T细胞、B细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和肥大细胞表面都有IL-4R,每个细胞受体数目在100~2000左右,其亲和力Kd在10-10~10-11M,1~5×10-12M浓度的IL-4可使B细胞增殖(3H-TdR掺入率)达到最大值的50%。LPS对B细胞IL-4R表达有正调节作用,受体数量可增加5~10倍。IL-4与相应受体结合后细胞内传递信号的途径尚不清楚,IL-4R胞浆区富含苏氨酸和丝氨酸,PTK和PKC可能参与受体介导的信号传递,IP3和Ca2+浓度升高。在小鼠发现有不同剪接形式mRNA所翻译的分泌型(可溶性)IL-4R(sIL-4R)。sIL-4R与膜型IL-4R(mIL-4R)同配体IL-4结合时具有相同的亲和力。sIL-4R可能是IL-4保护性载体,或调节IL-4的生物学活性。

4.IL-4的生物学活性 IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫调节作用。

(1)B细胞:促进SAC或抗IgM预先刺激B细胞的增殖,这一生物学功能已被用来作为检测IL-4的生物学活性。IL-4促进B细胞MHCⅡ类抗原、FcεRⅡ/CD23和CD40的表达,并增强B细胞提呈抗原能力,使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。增加FcεRⅡ/CD23(IgE Fc段低亲和力受体)的表达,并释放可溶性CD23(sCD23)/IgE结合因子(IgE-BF),与mIgE阳性细胞结合并诱导其分化,可能与促进B细胞IgE的产生有关。IL-4提高LPS刺激小鼠B细胞IgG1、IgE产生水平分别为8~10倍和10~100倍,但对IgG3分泌降低6~10倍,IgG2a、IgG2b和IgM有不同程度下降,对IgA产生无明显影响。IL-4增强IgG1和IgE水平的机理可能是:①使选择性刺激定向产生IgG1或IgE的B细胞的增殖和分化;②增加特异的重链稳定区(CH)Ig类的转换区Sμ-Sγ1结合,促进IgG1合成和分泌。IFN-γ对IL-4上述生物学功能有明显抑制作用。而IL-4则可抑制IFN-γmRNA的转录和抑制IFN-γ诱导B细胞产生IgG2a。寄生虫感染时血清IgG1和IgE水平升高。此外,IL-4还可促进休止期B细胞的早期活化,从Go期进入G1期,细胞体积增大,并表达CD25。

(2)T细胞:IL-4是T细胞自身分泌的生长因子,如HT-2细胞系是一种IL-2依赖细胞系,IL-4可单独维持TH-2的增殖,抗IL-2和抗IL-4McAb(11B11)可分别抑制IL-2和IL-4刺激IL-2细胞的增殖作用,但相互之间无交叉抑制作用。纯化后的T细胞(CD4阳性或CD8阳性亚群)对IL-4的增殖反应还需要IL-1(或PMA)的协同作用;而IL-2单独可维持活化T细胞的增殖。表明IL-4生长信号的传递过程与IL-2有所不同。高剂量IL-4能诱导CD4-CD8+或CD4+CD8-或CD4-CD8-胸腺细胞的增殖。IL-4增强PHA刺激T细胞释放GM-CSF和G-CSF。在小鼠实验系统中,多数情况下IL-4对CTL和LAK细胞的分化有正调节作用;而对人的杀伤细胞则有时表现为负调节作用,如在人MLC中IL-4选择性地促进Th增殖,同时伴有CTL、NK和LAK功能的降低。此外IL-4还能抑制IL-2所诱导的NK白血病细胞LAK活性。最近发现,用IL-4与T细胞或B细胞温育,可降低高亲和力IL-2R位点数,但不影响低亲和力IL-2R的数量。IL-4还可刺激CD3阴性NK细胞克隆和生长。

(3)刺激肥大细胞增殖,并与IL-3有协同作用,尤其对于粘膜和结缔组织型肥大细胞体外生长是必需的。

(4)促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能,可能与调节MHCⅡ类抗原和FcR表达有关。IL-4与GM-CSF、IL-3和LPS有协同作用。IL-4可诱导外周血单核细胞分泌G-CSF和M-CSF,增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性和ADCC作用。IL-4是小鼠巨噬细胞趋化因子,并促进IL-1ra产生,但抑制单核细胞IL-1、TNF和IL-6的产生。

(5)协同CSF刺激造血细胞的增殖,与G-CSF协同增强粒细胞集落形成,协同红细胞生成素(EPO)增强BFU-E的形成。

IL-4作为肿瘤免疫调节剂已进入Ⅱ期临床试验。此外,还开始进行治疗免疫缺陷症的临床试验。由于体内、体外均证实IL-4可以抑制IL-1、IL-6和TNF分泌,并促进IL-1ra 产生,因此应用IL-4可能为治疗败血症休克提供一种新的方法。

(五)IL-5

1980年Takatsu等发现在T细胞条件培养液中,含有一种因子能替代T细胞在体外协同胸腺依赖抗原的抗体应答,称为T细胞替代因子(T cell replacing factor,TRF)。由于这种因子对B细胞和啫酸性粒细胞增殖、分化有重要调节作用,又名B细胞生长因了了-Ⅱ(B cell growth factor-Ⅱ,BCGF-Ⅱ),IgA增强因子(IgA-enhancing factor,IgA-EF),嗜酸性粒细胞集落刺激因子(eosinophil colony-stimulating factor,Eo-CSF)和嗜酸性粒细胞分化因子(eosinophil differentiation factor,EDF)。1986年统一命名为白细胞介素-5(interleukin 5,IL-5)。

1.IL-5的产生 在人类IL-5主要由活化T细胞产生,在小鼠则由Th2亚群细胞产生。

2.IL-5的分子结构和基因 1986年Kinashi获得IL-5 cDNA克隆。小鼠IL-5由133氨基酸残基组成,含21氨基酸的信号肽,成熟IL-5分子含有112氨基酸残基,裸肽分子量12~15kDa,有3个糖基化位点,糖基化后分子量为18kDa,糖基化对于IL-5活性表达以及与相应受体的结合起重要作用。小鼠IL-5通常以二硫键连接的二聚体形式存在,分子量为45kDa。人的IL-5由134氨基酸残基组成,含22氨基酸残基信号肽,2个糖基化点,人和小鼠IL-5基因分别定位于第5号和第11号染色体,与IL-3、IL-4、GM-CSF等造血因子的基因密切连锁。人和鼠IL-5在氨基酸水平上有70%的同源性,生物学作用有交叉反应。

3.IL-5受体 小鼠IL-5由α和β两条链组成。α链,p60,含415个氨基酸,糖蛋白,先导序列17个氨基酸,胞膜外区322氨基酸残基,空膜区22个,胞浆区仅54个氨基酸残基。α链单独结合IL-5为低亲和力,参与信号的转导;β链,p130,单独不结合IL-5,与α链共同组成高亲和力受体。小鼠IL-5Rβ与IL-3R的β链(AIC2B基因产物)相同,人IL-5Rβ链是与IL-3Rβ链、GM-CSFRβ是共同的。由于mRNA剪接的不同,已发现有二种可溶性小鼠IL-5Rα链,其中一种可抑制IL-5与膜结合IL-5R的结合。人和鼠IL-5Rα链有79%的同源性。

4.IL-5的生物学活性 与其它IL相比,IL-5生物学活性作用谱相对较窄。

(1)小鼠IL-5促进抗原刺激的B细胞分化为抗体合成细胞,主要作用于进入细胞增殖后期的B细胞,并增加活化B细胞IL-2R的表达,IL-5的这种刺激作用与人IL-6功能相似,人IL-5只作用于B细胞刺激后很窄的时相内。

(2)促进IgA合成,其机理可能是:①作为IgA特异性启动因子,使mIgM 阳性B细胞分化为mIgA阳性B细胞;②作用于IgA型B细胞,促进其增殖和分化,成为分泌IgA的浆细胞。IL-4有协同IL-5促进IgA合成的作用。IL-5对IgM的分泌也有促进作用。

(3)协同ConA或IL-2诱导胸腺中杀伤性T细胞前体(CTPp)分化为CTL。

(4)趋化人嗜酸性粒细胞,延长成熟嗜酸性粒细胞的存活时间,刺激人和小鼠嗜酸性粒细胞的功能,诱导嗜酸性粒细胞的分化。

(六)IL-6

1980年发现成纤维细胞经Poly I-C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子,称为β2干扰素(IFN-β2)。以后的研究结果未能证实这种因子的直接抗病毒作用,但具有其它多方面的生物学功能,根据实验系统和功能的不同,不被命名为杂交瘤/浆细胞瘤生长因子(hybri-doma/plasmacytoma growth factor,HPGF),B细胞分化因子(B cell differentiation factor,BCDF),B细胞刺激因子-2(B cell stimulatory factor 2,BSF-2),26kDa,溶细胞性T细胞分化因子(cytolytic T cell differentiation factor,CDF)和肝细胞刺激因子(hepatocyte stimu-lating factor,HSF)等。1986年统一命名白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)。

1.IL-6的产生 淋巴样和某些非淋巴样细胞均可产生IL-6。   

(1)T细胞:T细胞产生IL-6依赖于巨噬细胞或PMA。抗原提呈细胞刺激相应的T细胞克隆,以及HTLV-I感染的T细胞系等均可分泌IL-6。

(2)B细胞:如SAC刺激而活化的B细胞。

(3)单核细胞:LPS刺激单核细胞产生IL-6,某些单核细胞系如P388D1也可分泌IL-6。

(4)成纤维细胞:可自发产生IL-6,其它因子或刺激物如IL-1、TNF、PDGF、IFN-β、PolyI-C、A23187、PMA等可促进IL-6的产生。

(5)肾小球系膜细胞、角朊细胞、内皮细胞等在一定培养条件下均可产生IL-6。此外,肿瘤细胞或细胞系如MG63成骨肉瘤,T24膀胱癌、A549肺癌、7860肾癌、SK-MG-4神经胶质母细胞瘤、U373星状细胞瘤、心脏粘液瘤细胞和骨髓瘤细胞等也能分泌IL-6。最近发现垂体前叶中的滤泡—星状细胞(folliculostellate)可产生IL-6,可能与败血症时LPS刺激导致GH、ACTH等激素水平升高有关。

IL-1、TNF、IFN-β、PDGF、LPS、Poly Ⅰ-C、A23187和PMA等对IL-6的产生具有正调节作用。

2.IL-6的分子结构和基因 1985年Kishimoto等从人T细胞中首先获得IL-6cDNA克隆成功,人 IL-6基因与小鼠有65%同源性。人IL-6基因位于第7号染色体,长约5kb,有5个外显子和4个内含子。

图4-1  IL-6基因的功能调节区

在IL-6基因功能调节区基因中存在着儿种转录控制元件(transcriptional control element),如糖皮质激素反应元件(glucocorticoid responsive elements,GRE)、AP-1结合位点、c-fos血清反应元件同源物(c-fos serum responsive element homology,c-fos SRE homology),cAMP反应元件(cycli AMP responsive element,CRE)和NF-κB结合位点。IL-1、TNF等细胞因子可使IL-6启动子很快发生一过性的活化。IL-1反应的元件在IL-6启动基中-180/-123;IL-6核因子(NF-IL-6)识别一段特殊的14bp,ACATTGCACAATCT。多反应元件(multi-response element,MRE)位于c-fos SRE同源区内,这个区域对IL-1、TNF、forskolin和PMA诱导IL-6产生有关;与IL-1、TNF刺激IL-6产生有关的NF-κB位于TATA盒的上游。

人IL-6分子由212个氨基酸残基组成,包括28个氨基酸残基的信号序列,成熟IL-6为184氨基酸残基,分子量26kDa。IL-6分子由4个α螺旋和C端(175~181位氨基酸)受体结合点所组成,其中179位精氨酸残基对于与受体的结合非常重要。分子中糖基对生物学活性功能并非必需,N端23个氨基酸残基虽不直接与IL-6生物学活性有关,但对整个IL-6分子组成起稳定作用。人IL-6氨基酸序列与小鼠IL-6有42%同源性,人的IL-6对小鼠某些细胞有刺激作用。IL-6与G-CSF和IFN-β有较高同源性,对骨髓造血细胞和髓样白血病细胞的某些作用也有相似之处。

3.IL-6的受体 目前已知,IL-6R至少由称之为IL-6结合受体蛋白(IL-6 binding receptor protein)和称为信号转导蛋白(signal-transducing protein)的gp130所组成,习惯上前者称之IL-6R。

(1)IL-6R(CD126):人IL-6R由468个氨基酸组成,切除N端19个氨基酸残基后的成熟分子有449氨基酸,胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别为339、28和82个氨基酸,分子量为80kDa,6个N糖基化位点。胞膜外由一个Ig样区(C2,约100氨基酸)、2个Ⅲ型纤维结合蛋白结构(各含100氨基酸)及1个细胞因子受体的同源区所组成,后者含4个保守的Cys和一个WSXWS结构。单独IL-6R与IL-6结合为低亲和力。IL-6R分布于淋巴样细胞和非淋巴样细胞,如活化B细胞、EBV转化B细胞、急性淋巴母细胞白血病细胞、骨髓瘤细胞、静止T细胞、肝细胞、单核细胞、急性髓样白血病(AML)细胞、嗜铬细胞瘤细胞等。

(2)gp130(CDw130):分子量为130kDa的糖蛋白,共有14个潜在N-糖基化位点,胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别有597、22和277个氨基酸。胞膜外区有1个IgC2区,6个Ⅲ型纤维结合蛋白的结构,其中第二个和第三个结构区之间有4个保守的Cys和WSXWS结构的区域,形成1个细胞因子受体家族结构特征的结构域。gp130不能直接与配基IL-6结合,在生理情况下,IL-6与IL-6受体结合后使IL-6R的构象发生变化并迅速与两个gp130分子结合,形成高亲和力的结合位点,并通过gp130亚单位传递信号。人和小鼠gp130在氨基酸水平上有77%的同源性。转染gp130 cDNA小鼠pro-B细胞在IL-6/sIL-6R复合物刺激下可传递增殖信号。小鼠体内注射IL-6可增加gp130mRNA的表达。目前已证实,gp130除组成IL-6高亲和力受体外,也是白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)和IL-11等受体所共用的亚单位。

(3)信号转导:gp130与IL-6/IL-6R复合物结合后,刺激gp130胞内部分发生酪氨酸磷酸化,目前关于参与此过程的酪氨酸?, http://www.100md.com