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二、集落刺激因子(Csf)
http://www.100md.com 《细胞与分子免疫学》

二、集落刺激因子(CSF)

骨髓造血干细胞体外半固体培养技术的建立和重组集落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)的问世给集落刺激因子的研究提供了前提。根据细胞因子刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落,分别命名为粒细胞CSF(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞和巨噬细胞CSF(GM-CSF)、多重集落刺激因子(multi-CSF,又称IL-3)、干细胞因子(SCF)、红细胞生成素(EPO)。有人将IL-5称为嗜酸性粒细胞集落刺激因子(Eo-CSF)。此外,IL-1、IL-6和IL-11在骨髓多能干细胞早期的分化中也有重要的作用。

(一)IL-3

1981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子,能提高裸鼠脾脏淋巴细胞成熟淋巴细胞标志20-α-羟固醇脱氢酸(20-α-hydroxysteriod dehydrogenase,20αSDH)的阳性率,命名为白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)。由于IL-3可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化,又称为多重集落刺激因子(multi-colony stimulating  factor,multi-CSF)。 

1.IL-3的产生 主要由活化T细胞或T细胞克隆产生。小鼠髓样单核细系(myelomonocytic cell line) WEHI-3B细胞系可自发产生一定水平的IL-3。此外,胸腺上皮细胞、活化小鼠肥大细胞等也可表达IL-3。

2.IL-3的分子结构和基因 1984年美国和澳大利亚分别从ConA刺激小鼠T细胞和WEHI-3B细胞中提取高活性部分mRNA,逆转录成cDNA,进行克隆化和DNA序列分析。编码小鼠IL-3和GM-CSF的基因都定位于第11号染色体。IL-3的基因组由5个外显子和4个内含子组成。cDNA编码166氨基酸残基,N端26氨基酸残基为信号肽,此外N端另有数个氨基酸残基可能被血清蛋白酶所切除。成熟小鼠IL-3由131氨基酸残基组成,含有糖基,分子量为25~28kDa。

1986年美籍华人杨育中从长臂猿T白血病细胞株MLA144中提取IL-3mRNA,成功地获得长臂猿IL-3cDNA(gIL-3cDNA),后又用gIL-3cDNA作为探针筛选人IL-3基因组DNA,并克隆成功。人IL-3基因结构与小鼠相似,由5个显子和4个内含子组成,人与鼠IL-3DNA约有45%同源性,氨基酸有29%同源性,但人鼠间IL-3生物学作用无交叉反应。人和长臂猿IL-3有高度同源性,成熟的IL-3分子都由133个氨基酸残基组成,仅11个氨基酸残基不同,在第16位和84位上2个半胱氨酸残基在分子内形成二硫键,此外还有2个N糖基化点  。在体外糖基不影响IL-3的生物学活性。hIL-3启动子上游调控区含有多个转录调控子同源位点,其中AP-1(TGAGTCA)位于-301处 ,CREB(TTACGTCT)位于-147处,NFAT-1(GATGAATAAT)位于-156处,CK-1(GAAGGTTCCA)位于-126处 ,CK-2(TCAGATAA)位于-115处。hIL-3转录调控主要受上游两个顺式调控区的调控。第一个位于-121到-161之间,它对于hIL-3转录激活最为重要,其间除含有CREB、NFAT-1外,新发现了对hIL-3表达起决定作用的转录调控蛋白结合位点,该位点被命名为NF-IL-3-A(ATGAATAA)。第二个调控区位于-301处的AP-1位点,AP-1位点能强有力地增强hIL-3基因的转录。此外,最近还发现了hIL-3转录抑制调控区,位于-250和-271之间,称为NIP位点。目前认为位于其上游-301处AP-1对hIL-3的转录增强作用是通过消除NIP对hIL-3基因转录的抑制来实现的。

人IL-3以及IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、M-CSF、M-CSF受体(c-fms编码产物)、PDGFR(血小板衍生的生长因子受体)、β2-肾上腺素能受体(β2AR)、内皮细胞生长因子(ECGF)和CD14的基因都定位于第5号染色体。这种在一定区域内连锁的现象可能与协同调节造血过程有关,并可能与骨髓发育异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)、原发性急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphocytic leukemia,ANLL)、顽固性巨幼红细胞贫血等疾病的发病有关。

3.IL-3受体 分子量为140kDa,属于红细胞生成素受体超家族成员,而且具有2个该家族的结构域,IL-3R胞浆区是酪氨酸激酶的底物。有关IL-3Rβ链参见本节GM-CSF受体和本章第三节 。

4.IL-3的生物学活性 IL-3与其它集落刺激因子的生物学作用见表4-4。除具有多重集落刺激作用外,最近发现IL-3可刺激皮肤上皮细胞、CD4-CD8-TCRαβ细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞的增殖,阻止肥大细胞发生程序性细胞死亡。

(二)GM-CSF

1977年Burgess等从小鼠肺条件培养液中发现一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的因子,命名为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)。1984年和1985年小鼠和人GM-CSF的cDNA分别克隆成功。

1.GM-CSF的产生 T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞等均可产生GM-CSF。其中T细胞和巨噬细胞一般在免疫应答或炎症介质刺激过程中直接产生;而内皮细胞、成纤维细胞可能通过IL-1和TNF的诱导而产生。

表4-4  CSF的生物学功能及临床应用   

CSF 分子量(kDa)
鼠  人
主要产生细 胞 主要集落刺激作用 促进吞噬细胞功能 临床治疗疾病 使用情况 基因定位 外显子/内含子 人与鼠同源性(%) 人与鼠活性交叉 糖基化
G-CSF(CSF-β) 25 30 Mo,En,Fb 髓样、中性粒细胞集落增殖、分化成熟 PMN的吞噬和杀伤功能,ADCC 增加化疗作用,艾滋病,白血病,再生障碍性贫血、癌症,骨髓移植 FDA已批准 17q11~q13 5/4 73 + 0-
M-CSF
(CSF-1)
70 45(同源二聚体) Mo、En、Fb 前单核、单核 M吞噬和细胞毒功能,ADCC,促进IL-1、TNF-α的产生 Ⅰ期临床试验 5q23~q31 80 + N-
GM-CSF(CSF-α,CSF-2) 23 22 Tact、Fb、En、Mo 多能干细胞、髓样干细胞、单核、嗜酸、中性粒细胞增殖 增加M、Mo、PMN、Eo的数量,提高吞噬功能 二次化疗所致中性粒细胞减少症,异体和自体骨髓移植,再生障碍性贫血,烫伤骨髓功能衰竭,血小板减小 FDA已批准 5q23~q31 4/3 54 - N-
IL-3(multi-CSF) 25 18 Tact 多能干细胞、多种定向祖细胞、前髓、髓样、红样、巨核、前单、单核、中性、嗜酸、肥大细胞 体内注射IL-3增加外周血中PMN、Mo、Eo的数量,促进Eo ADCC Ⅰ、Ⅱ期临床试验 5q23~q31 5/4 29 _ N-
:巨噬细胞;Eo:嗜酸性粒细胞;En:内皮细胞;Fb:成纤维细胞;Tact:活化T细胞

表4-5  产生GM-CSF的细胞和刺激物

细胞种类 刺激物
细胞因子 受  体 CD抗原 其  它

图4-3  细胞因子与造血细胞分化

合理应用重组人M-CSF有助于提高机体免疫应答水平,现已用于治疗某些肿瘤,提高化疗后总白细胞和粒细胞水平,还可治疗小儿慢性中性粒细胞减少症。

M-CSF可能与某些癌症、全身性红斑狼疮和骨质疏松症等疾病发生有关。白血病、淋巴细胞恶性增生、骨髓及外骨髓增殖性疾病、卵巢癌、子宫内膜癌、全身性红斑狼疮以及免疫性血小板减少性紫瘢病人血清或血浆中M-CSF的水平可升高。

(五)SCF

干细胞因子(stem cell factor,SCF)又称肥大细胞生长因子(mast cell growth factor,MGF),最初是从Buffalo大鼠肝细胞系中cDNA克隆成功,在小鼠MGF基因位于第10号染色体SL基因,是C-kit的配体(C-kit ligand,KL),因此也称之造血生长因子KL。

1.SCF的产生 主要由肝细胞产生。

2.SCF的分子结构 人和小鼠SCF分别由248和220个氨基酸组成,约有80%同源性。SCF可以可溶性和膜结合两种形式存在,可能与SCF mRNA剪接或蛋白酶切割位点不同有关。在体内SCF以非共价相连同源二聚体形式存在,单体分子量约31kDa,单体中含有4个半胱氨酸残基,形成分子内二硫键。糖基对SCF生物学活性并非必需。

3.SCF受体 SCF受体即是C-kit,成熟SCF受体分子由953个氨基酸组成,其中胞膜外区497个氨基酸,属免疫球蛋白超家族成员,组成5个Ig样的结构域,与M-CSFR、PDGFR有较高的同源性;穿膜区由23个疏水性氨酸组成;胞浆区433个氨基酸,含有酪氨酸激酶和自身磷酸化的结构域。SCFR表达于多种干细胞、集落形成细胞和肥大细胞等。

4.SCF的生物学作用

(1)促进IL-3依赖的早期造血前体细胞的增殖和分化,可以IL-3、G-CSF、GM-CSF和EPO等细胞因子协同促进髓样、淋巴样和红细胞样细胞的产生。

(2)促进肥大细胞增殖。

(3)促进黑素母细胞(melanoblasts)的增殖。

SCF在骨髓移植、造血功能障碍以及干细胞基因治疗中有潜在的应用价值。目前SCF已进入临床Ⅰ期试验,主要治疗乳腺癌和淋巴瘤病人。

(六)EPO

红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种刺激红细胞产生的糖蛋白。

1.EPO的产生

(1)肾脏是EPO产生的主要来源,产生EPO细胞为肾小管基底膜外侧的肾小管周围间质细胞(peritubular interstitial cell),由于这些细胞释放第Ⅷ因子,因此这种EPO产生细胞可能是一种肾小管周围毛细血管的内皮细胞。组织氧利用率下降所引起组织缺氧是诱导EPO产生的主要刺激因素。

(2)肝脏中枯否氏细胞

(3)骨髓中巨噬细胞

2.EPO的分子结构和基因 人和小鼠EPO基因分别定位于第7和第5号染色体。人EPO基因组为单拷贝,5.4kb长,有5个外显子和4个内含子。EPO基因上游有TATA盒,5′UTR处有AP-1、SP-1、NF-IL-6、GRE和NF-κB的结合序列。EPO cDNA编码193个氨基酸,包括27个氨基酸先导序列,成熟EPO分子由166个氨基酸组成,分子量为18kDa,在CHO细胞中表达rEPO为30kDa ,糖占39%,在人尿中的EPO为34kDa糖蛋白。

3.EPO受体 1989年从MEL细胞745表达文库中EPORcDNA克隆成功。人EPOR基因位于19号染色体,裸肽分子量为55kDa,糖基化后为66kDa,由508个氨基酸残基组成,包括24氨基酸残基的先导序列,成熟EPOR为484个氨基酸残基,其中,胞膜外区226,穿膜区22,胞浆区236个氨基酸残基,胞膜外结构属红细胞生成素/细胞因子受体超家族。还可能存在着66kDa与其它膜分子的复合物。EPOR有高亲和力和低亲和力两种,至今对EPOR组成的确切结构和信号转导还不清楚。目前至少已发现3种在自然状态下由于膜受体裂解脱落的可溶性EPO受体(sEPOR)。

 4.EPO的生物学作用 EPO特异地作用于红细胞样前体,对其它细胞系几乎没有作用。EPO刺激骨髓中红细胞样前体细胞产生红细胞样集落形成单位(colony-forming unit-erthroid,CFU-E)和红细胞样爆发形成单位(burst-forming unit-erythroid,BFU-E)。CFU-E为迅速分裂的红细胞样前体细胞,对低浓度EPO即有反应;BFU-E则为更不成熟的红细胞样前体细胞,对EPO反应后,其分裂速度较慢。

EPO水平过高见于:(1)原发性红细胞增多症;(2)继发性红细胞增多症,如高原居住者,慢性阻塞性肺疾患,紫绀性心脏病,高亲和力血红蛋白病,吸烟,局限性肾脏缺氧,恶性或良性肾脏肿瘤,肝细胞瘤,肝癌,肾上腺肿瘤等。EPO水平过低主要见于肾功衰竭或晚期肾病引起的贫血,慢性感染、类风湿性关节炎、AIDS、肿瘤引起的贫血,其他原因引起的贫血等。患上述疾病机体可能产生IL-1、TNF-α,这些细胞因子是EPO活性的抑制剂。再生障碍性贫血、缺铁性贫血、地中海性贫血、巨幼细胞性贫血等病人EPO水平反而升高,表明上述贫血症原因并非由EPO缺乏所引起。

EPO主要用于肾功衰竭引起的贫血,还可用于类风湿性关节炎、多分性骨髓瘤、非Hodg-kin氏淋巴瘤、AIDS、化疗等原因引起的贫血。1989年美国FDA批准Amgen公司首先将rEPO投放市场。

(七)CSF的临床应用

如前所述,多种CSF已广泛应用于临床治疗多种疾病,体内应用CSF可提高循环血液中的血细胞,纠正贫血,减少感染等并发症,可明显改善症状,降低病死率。其主要适应症是下列原因引起的血液细胞减少(参见表4-15和表4-16)。

(1)肿瘤化疗引起的血液细胞减少;

(2)肿瘤放疗引起的血液细胞减少;

(3)骨髓移植后重建造血功能;

(4)再生障碍性贫血以及慢性肾衰、肿瘤及血引起的贫血;

(5)艾滋病、骨髓发育异常综合征(MDS)患者血细胞减少;

(6)烧伤等。


校对:白艳萍

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