吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合
制剂制造及检定规程
本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之用。
<1 抗原要求
<1<.1 百日咳菌苗原液应符合附录<1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中<2.4项的规定。
1.2 精制白喉类毒素应符合《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中4项的要求。
1.3 精制破伤风类毒素应符合《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中4项的要求。
<2 制造
<2<.1 配方
每ml制剂中各种抗原成份含量如下：
百日咳菌 45亿～90亿
精制白喉类毒素 20Lf
精制破伤风类毒素 5Lf
2.2 吸附剂配制，见《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》5项。
<2<.3 氢氧化铝稀释
以蒸馏水按吸附后之总量将氢氧化铝原液稀释成1.0～1.5mg /ml。硫柳汞含量不超过0.01%(g /ml)，氯化钠含量补足至0.85%(g /ml)，高压蒸汽灭菌。
2.4 吸附
按计算量将精制白喉类毒素、精制破伤风类素及百日咳菌苗原液加入稀释好的吸附剂内。调节pH至5.8～7.2。
2.5 分批
同批吸附剂同批配合的原液同次吸附的制品为1批。如用大罐吸附时，所用抗原和吸附剂可以多批混合(精制类毒素不超过3批)，每罐为1批。
<3 成品检定
3.1 物理化学检查
3.1.1 振摇后应呈均匀乳白色混悬液。不应有摇不散的凝块或异物。
3.1.2 pH值应为5.8～7.2。
3.1.3 氯化钠含量为0.75%～0.9%(g /ml)。
3.1.4 硫柳汞含量为1.0%～0.5%(mg /ml)。
3.1.5 硫柳汞含量不超过0.01%(g /ml)。
3.2 鉴别试验
抽取样品，另枸橼酸钠或用其他适宜方法将吸附剂溶解后，离心沉淀百日咳菌体和残留的吸附剂，按《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中7.6项、《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中7.6项和附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4.3项进行鉴别试验。
<3<.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.4 毒性试验
应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4.5项的规定。
3.5 安全试验
3.5.1 小白鼠法
用体重18～20g之健康小白鼠5只，每只皮下注射检品0.5ml观察7日，不得有局部脓肿或死亡。
3.5.2 豚鼠法
用体得300～400g豚鼠，每批制品不少于4只，每只皮下注射2.5ml，分两侧，每侧1.25ml，应符合《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中4.4项及《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中4.5项要求。
<3<.6 效力试验
3.6.1 百日咳菌苗免疫力试验
每3批抽1批进行，应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中1.2.5项的规定。
3.6.2 白喉及破伤风类毒素的效力试验
每更换1批类毒素时进行。取体重300～400g豚鼠4只，每只皮下注射0.5ml，第30天采血，将分离的血清等量混合，进行白喉及破伤风抗毒素单位测定。
3.6.2.1 白喉抗毒素单位测定
用Lr /300家兔皮内法，要求每ml血清达到0.25IU。
3.6.2.2 破伤风抗毒素单位测定
用L+/100小白鼠皮下法，要求每 3.6.2.3 白喉类毒素的效力试验亦可采用攻毒法。取体重300～350g豚鼠5只以上，每只皮下注射0.5ml。第30天各皮下攻击白喉毒素200个MLD，观察7天，豚鼠死亡不得超过20%；同时另取体重240～270g豚鼠3只，各皮下注射1个MLD毒素作为对照，2只对照豚鼠应发病并于96小时内死亡，允许另1只较晚死亡或发病。 3.6.2.4 亦可按WHO推荐的效力检定方法(见《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》附录和《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》附录)。 4 保存与效期 应保存于<2<～8℃。自吸附之日起效期为1年半。 附录1 百日咳菌苗原液制造及检定要求 本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每ml含菌45亿～90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。 1 菌种 1<.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。 1.2 菌种检定 1.2.1 培养特性 于包-姜(Bordet-Gengou)氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。 1.2.2 血清学特性 将35～37℃培育40～48小时的菌苔，混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每ml含菌20亿个，与Ⅰ相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。 1.2.3 皮肤坏死试验 用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml，经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。 1.2.4 毒力试验 用体重16～18g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40～48小时，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天，记录小白鼠生死情况，按Reed Muench法计算LD50，LD50菌数不超过1.2亿判为合格。 1.2.5 免疫力试验 1.2.5.1 方法 按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。 1.2.5.2 判定 试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于<4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均值)≥4.0IU，仍判为合格。 1.3 菌种保存 1.3.1 菌种应用冻干法保存。 1.3.2 冻干菌种应保存在2～8℃。冻干后抽样按1.2项进行检查，合格的菌种可使用<2年，以后每年检查<1次，如仍合格可继续使用<1年。 2<. 制造 2<.1 制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株，制成的菌苗应含1、2、3型因子。 2.2 制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基，不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。 2<.3 原液制造 2.3.1 菌种 冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于35～37℃培育不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。 2.3.2 培育 可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时，经检查为纯菌后，用适当方法收集菌体，混悬于pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。 2.3.3 杀菌 原液可用不超过0.1%(ml /ml)甲醛溶液杀菌，放37℃2～3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。 2<.3<.4 纯菌试验 原液应逐瓶(罐)抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面(或活性炭半综合培养基)各1管，放35～37℃培育2天，然后放24～26℃1天。有杂菌生长者应废弃。 2.3.5 原液合并 固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后，可加适量防腐剂，并保存于2～8℃。 2.4 原液检定 2.4.1 浓度测定 每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。 2.4.2 镜检 每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野，应无杂菌。 2.4.3 凝集反应 每瓶原液按1.2.2项与Ⅰ相血清做定量凝集试验，其凝集效价应达血清原效价之半，如仅达到或低于血清原效价1 /4时，应作免疫力试验，合格后方可使用；同时应用单价分型血清做定性凝集试验，其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。 2.4.4 无菌试验 每瓶原液除按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验外，并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长，可复试一次，若仍有百日咳菌生长，原液应判为不合格。 2.4.5 毒性试验 2.4.5.1 方法 按附录3《百日咳菌苗原液毒性试验方法》进行。 2.4.5.2 判定 试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重，第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。 试验结果达不到上述要求，可复试一次。仍达到不过要求，可将原液放置 1.2.5项方法及要求进行。 2.5 原液保存 应保存于2～8℃。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。 附录2 百日咳菌苗原液免疫力试验方法 1 免疫 1<.1 动物 选用体重<10～<12g同性或雌雄性各半的健康 将动物随机分为三组，每组16只或20只(同性或雌雄性各半，为保证攻击后有16只或20只小白鼠，可适当多免疫几只小白鼠)，同时饲养健康小白鼠55只，备做对照用。 1.2 免疫原稀释 将百日咳原液用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2，然后再稀释7.5×、37.5×、187.5×，百日咳参考菌苗稀释至每ml含8IU，然后再稀释成每ml含1.0IU(0.125ml)、0.2IU(0.025ml)及0.04IU(0.005ml)。 1.3 免疫方法 将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。 2 攻击菌及攻击菌液的制备 2.1 菌种 小白鼠脑内攻击用58030(18323)菌株。 2.2 培养基 可用包-姜氏培养基(含羊血20%～30%)或其他适宜的培养基。 2.3 培养温度及时间 放35～37℃培育，第一代不超过72小时，攻击时菌种的培育时间为20～24小时。原代菌种放2～8℃可保存2周。 2.4 攻击菌液的制备 将培育<20～<24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后，刮入生理盐水或 2.5 工作起止时间 自攻击菌液制备(开始刮菌)至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。 2.6 活菌计数 在攻击前后，可将<0.03ml含<8个菌的攻击菌液，接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中，每个平皿<0.2ml，每次不得少于<2个平皿，其菌落形成单位约为浊度测定的<1/4。 3 攻击 动物免疫后<14天，每只小白鼠脑内攻击<0.03ml菌液(含<8万个菌)，用<0.25ml注射器，<4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击<10只小白鼠。 4 记录结果 动物攻击后观察<14天。攻击后第<2天，将试验组动物处理成每组<16只或<20只。以后逐日观察动物并记录死亡数，最初<3天死亡的动物不作统计，至第<14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。 5 结果计算 5<.1 按 5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组LD50，1个LD50的菌数应不高于800个菌。 5.3 计算均质性因子“α”。 5.4 IU计算 待检原液每m 6 效力评价 百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后，每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。 <附录3 百日咳菌苗原液毒性试验方法 1 选用体重14～16g健康小白鼠，每批原液不少于10只(同性或雌雄性各半)。 2 以灭菌生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水(含成品菌苗相同量的防腐剂)，将百日咳原液稀释至成品菌苗浓度的1/2。 3 每只小白鼠腹腔注射稀释的原液0.5ml。另取同数量同体重的小白鼠(同性或雌雄性各半)，腹腔注射稀释用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水0.5ml作为对照。 4 注射后的小白鼠应逐日观察，并于喂食后2小时进行称重。 5 于注射前、注射后72小时及7天，分别称试验组及时对照组小白鼠的体重。 6 试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前的总体重；7天小白鼠平均增加的体重不少于对照组平均增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。 7 试验结果若达不到上述要求，可进行复试，仍达不到上述要求，原液可放置2～8℃保存3～4个月再进行复试，如仍达不到上述要求，该批原液的毒性判为不合格。 <吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂使用说明书 本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。每 本品为乳白色悬液，含硫柳汞防腐剂，放置后菌体易下沉，但经振摇后能均匀分散。 接种对象 3个月～<6周岁儿童。 用法 1<.臀部外<<上方1/4<处或上臂外侧三角肌附着处皮肤经消毒后肌内注射。 <2<.<免疫程序与剂量 <<自3<月龄开始免疫，至<12月龄完成三针次免疫，每针间隔<4～<6周。<18～<24月龄注射第<4针。每次注射剂量为<0.5ml。 禁忌 有癫痫、神经系统疾患及抽风史者禁用。急性传染病(包括恢复期)及发热者暂缓注射。 反应 注射本品后，局部可有红肿、疼痛、发痒，或有低热、疲倦、头痛等，一般不须特殊处理即行消退，如有严重反应应及时诊治。 注意事项 1<.使用时应充分摇匀，如出现摇不散之凝块，有异物，安瓿有裂纹，制品曾经冻结，标签不清和过期失效者不可使用。 <2<.注射后，局部可能有硬结，可逐步吸收。注射第2<针时应更换另侧部位。 <3<.应备1∶1000<肾上腺素，供偶有发生休克时急救用。 <4<.<注射第一针后出现高热、惊厥等异常情况者，不再注射第二针。 保存 应保存于<2～<8℃暗处，不得冻结。