<人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程
<本品系用狂犬病固定毒(aG<)适应株接种原代地鼠肾单层细胞，培养后收获病毒液，加入甲醛溶液灭活后浓缩，再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。
1 <毒种
1<.1 <毒种来源
<狂犬病固定毒aG<适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后，再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。生产用毒种传代应不超过10aG<交替代。
1<.2 <毒种检定
1<.2<.1 <无菌试验
aG<毒种每次传代收剖后均须做无菌试验，合格者方可使用。
1<.2<.2 <病毒滴定
aG毒种用体重11～13g小白鼠进行脑内病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml<方可用于生产。
1<.2<.3 <纯毒试验
<生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500<以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。
1<.3 <毒种传代
<选择体重120<～160g<健康豚鼠，脑内注射，选潜伏期80<～100<小时具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑。豚鼠脑连续传代不超过5<代。
1<.4 <毒种保存
<供生产用aG<株在-60<℃以下保存，不得超过1<年。
2 <疫苗制造
2<.1 <细胞制备
2<.1<.1 <地鼠
<选用12<～14<日龄健康地鼠，如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。
2<.1<.2 <解剖
<处死地鼠，用消毒液洗涤皮毛数次，末次浸泡一定时间，无菌取肾，置于瓶中剪碎。
2<.1<.3 <细胞消化及分装
<将剪碎肾块洗涤数次，加入适量胰蛋白酶消化液，置2<～8<℃过夜(约16<～20<小时)或37<℃水浴消化适当时间，弃去消化液，经洗液洗涤2<～3<次，振摇或吹打分散细胞，加入适量生长液，分装培养瓶，置37<℃±0.5<℃培养长成单层。
2<.1<.4 <使用液体
<均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。
2<.1<.4<.1 <生长液
<为含不超过10%<小牛血清水解乳蛋白SMI<液或其他适宜培养液，可加入适量抗生素。
2<.1<.4<.2 <浸泡液
<为水解乳蛋白SMI<液或其他适宜培养液，其中保护剂可选用0.1%<以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
2<.1<.4<.3 <维持液
<为199<或其他适宜的溶液，其中保护剂中可选用0.4%<以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
2<.1<.5 <外源因子检查
<每生产批细胞留5%<(或不少于500ml<)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%<～0.5%<豚鼠红细胞(4<℃保存不超过7<天)进行血吸附试验，置4<～8℃30<分钟判定结果；再置20<～25℃30<分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。
2<.2 <病毒接种和病毒液收获
2<.2<.1 <病毒接种
<将长成单层细胞瓶倾去营养液，换入浸泡液。同时将无菌试验合格的aG<株摇碎后，经1000r/min<离心10<分钟，吸取上清液按1∶1000<～1∶4000<种入细胞瓶，也可将细胞与病毒同时接种，置32<～37<℃继续培养。
2<.2<.2 <洗换
<种毒后吸附适当时间倾去浸泡液，用Hanks<液或其他适宜液体洗涤细胞，然后换入维持液，置32<～37<℃继续培育。
2<.2<.3 <病毒液收获
<洗换后观察细胞生长情况，选择适当天数收获病毒液，取样品做病毒滴定及无菌试验。
2<.2<.4 <病毒滴定
<将样品做10<倍系列稀释，取3<个稀释度的病毒液，每个稀释度用体重11<～13g<小白鼠4<只，每只脑内接种0.03ml<，逐日观察，14<日判定结果，计算LD50<(3<日内死亡者不计)。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml<以上。可重试1<次。
2<.3 <灭活
<病毒液内加入1/4000<～1/5000<的甲醛溶液，置32<～37<℃或2<～8<℃或其他适宜温度灭活一定时间。
2<.4 <过滤合并
<将无菌试验合格的病毒液用滤球或绢布过滤后合并即为原液。
2<.5 <防腐剂
<按0.005%<～0.01%<加入硫柳汞。
2<.6 <超滤浓缩
<原液按其滴度进行不同倍数浓缩。按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。
3 <疫苗剂型
3<.1 液体浓缩疫苗
<病毒液灭活经超滤浓缩后再加入Al<(OH<)3<，使最终含量为0.4<～ 0.7mg/ml<。
3<.2 <冻干浓缩疫苗
<用适当方法进行超滤或精制，然后冻干。
3<.2<.1 <冻干保护剂
1%明胶和5%<蔗糖或其他适宜保护剂。
3<.2<.2 <疫苗稀释
<将保护剂按比例加入疫苗内，充分摇匀，取样做冻干前无菌试验后立即分装与冻干。
4 <半成品检定
4<.1 无菌试验
<按《生物制品无菌试验规程》进行。
4<.2 <灭活试验
<将样品脑内接种体重11<～13g<小白鼠10<只，每只0.03ml<，观察14<天，应健存，非特异死亡不超过20%<。小白鼠如发病死亡，可继续灭活并进行灭活试验。
4<.3 <残余牛血清蛋白含量
<用检定所认可的试剂和方法测定，液体浓缩疫苗与冻干浓缩疫苗牛血清蛋白含量应≤50ng/ml<。
5 <分装
<半成品检定合格后即可进行分装。液体浓缩疫苗每支装量2ml<，冻干浓缩疫苗每支装量1ml<或2ml<。
6 <成品检定
6<.1 效力试验
<由质量检定部门进行。
6<.1<.1 攻击毒株
<攻击毒株(CVS<)由中国药品生物制品检定所发给。
6<.1<.2 <击毒株的制备
6<.1<.2<.1 启开冻干毒种：稀释成10-2悬液，用体重11～13g小白鼠，脑内接种0.03ml，连续传2～3代，收脑时应选择4～5天有典型狂病症状的脑组织，放-60<℃低温保存。
6<.1<.2<.2 病毒悬液的制备：将鼠脑研磨并加入适量正常马血清或小牛血清蒸馏水，制成20%悬液，经1000r/min沉淀10分钟，吸取上清液分装安瓿或小管，储存于-60℃冰箱中，经用体重18～20g<小白鼠做病毒滴定，符合要求后，方可作攻击毒用。
6<.1<.3 <疫苗参考对照品。
<由检定所定期发给。
6<.1<.4 <待检疫苗
<取同批安全试验合格疫苗用pH7.6PBS<做5<倍连续稀释，一般采用3<个稀释度以上进行免疫，如1∶5<、1∶25<、1∶125<的稀释度。
6<.1<.5 <免疫
<选用体重12<～14g<的小白鼠，免疫时应同时有参考对照品的对照和攻击病毒LD50<测定的对照小白鼠，参考对照品可做1∶25<、1∶125<和1∶625<共3<个稀释度进行免疫，每只小白鼠腹腔注射0.5ml<，间隔一周再免疫一次，免疫时将疫苗保存在冰浴中，各组小白鼠都应在同样的条件下饲养。
6<.1<.6 <攻击
<小白鼠于第一次免疫后14<天，用预先测定含5<～100<个LD50<的病毒量脑内攻击0.03ml/<只。病毒测定用10-0<、10-1<、10-2<、10-3<，每稀释度不少于8<只，疫苗免疫组小白鼠每个稀释度为14<～16<只，所有小白鼠自攻击之日起观察14<天。第5<天后死亡和呈现典型脑病症状也作为因狂犬病死亡而计算在内。
6<.1<.7 <判定结果和合格指标
<要求原病毒悬液注射的小白鼠80%<以上死亡，攻击病毒含量为5<～100<个LD50<。液体浓缩疫苗合格指标应≥2.5IU/<安瓿(2ml<)，冻干浓缩疫苗应≥2.5IU/<安瓿(1ml<或2ml<)。疫苗不合格可复试一次。
6<.2 <物理检查
<液体浓缩疫苗应为橘红-<紫红色混浊液体，久放形成可摇散的沉淀。冻干浓缩疫苗为淡黄色疏松体。
6<.3 <化学测定
<按《生物制品化学检定规程》进行。
6.3.1 pH<值
6<.3<.2 <氢氧化铝含量 <不得超过0.7mg/ml<。 6<.3<.3 <硫柳汞含量 <不得超过0.01%<。 6<.3<.4 <游离甲醛含量 <不得超过0.015%<。 6<.3<.5 <水分 <冻干疫苗水分不得超过3.5%<。 6<.4 <无菌试验 <按《生物制品无菌试验规程》进行。 6<.5 <毒性试验 <取疫苗接种11<～13g<小白鼠10<只，每只腹腔注射0.5ml<，观察7<天，应健存。 6<.6 <稀释液 <冻干浓缩疫苗用灭菌注射用水或其他适宜稀释液稀释，其质量应符合《中国药典》规定。 7 <保存与效期 <疫苗应保存于2<～8<℃。液体浓缩疫苗由效力合格之日起效期为1<年，冻干浓缩疫苗由冻干之日起，效期为2<年。 <人用浓缩狂犬病疫苗使用说明书 <本疫苗为狂犬病固定毒(aG<)适应株，接种于原代地鼠肾单层细胞，培养后收获病毒液，加入甲醛溶液灭活后浓缩，再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。 <液体浓缩疫苗为橘红色-<紫红色微混浊液体，久放形成可摇散的沉淀。冻干浓缩疫苗为淡黄色疏松体。含硫柳汞防腐剂。 <接种对象 <凡被狂犬或其他疯动物咬伤、抓伤时，应立即处理局部伤口(用肥皂水反复冲洗后，再用碘酊消毒数次)，并及时注射本疫苗。 <用法 1<.一般咬伤者于0(第1天，注射当天)、3(第4天，以下类推)、7、14、30天各注射本疫苗1安瓿(液体疫苗2ml，冻干疫苗1ml或2ml)，儿童用量相同。严重咬伤者(头、面颈、手指、多部位3处以上咬伤，咬穿皮肤或舔触粘膜者)，应按上述方法注射本疫苗。并应于0、3天注射加倍量疫苗，并于0天注射疫苗的同时用抗狂犬病血清(40IU/kg)或狂犬病免疫球蛋白(20IU/kg)浸润咬伤局部和肌内注射。凡联合使用抗狂犬病血清或免疫球蛋白者，必须在全程疫苗注射完毕后再加强注射2～3针疫苗，即在全程注射后第15、75天或第10、20、90<天加强。 2<.<本疫苗供上臂三角肌肌内注射。儿童应在大腿前内侧区肌内注射。 3<.使用前将疫苗振摇成均匀悬液。冻干浓缩疫苗则加入等量灭菌注射用水溶解后，以无菌手续将疫苗吸入注射器内。 4<.<对未咬伤健康者预防注射，可按0、7、21天注射3<针。 <禁忌 <由于狂犬病是致死性疾病，疫苗注射无禁忌证。 <注意事项 1<.注射疫苗期间可照常工作，切忌饮酒、浓茶等刺激性食物及剧烈劳动等，以避免引起反应。 2<.<伤口不宜包扎或缝合。 <保存 <应保存于2<～8<℃。