冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程
<本品系用从健康人白细胞中获得的α1b<干扰素基因重组质粒，转染大肠杆菌，使之高效表达人α1b<干扰素，经高度纯化后冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。
1 <菌种
1<.1 <菌种来源
<系带有人α1b干扰素基因的pBVXα1b质粒转化的大肠杆菌JM103株。投产的工程菌需经卫生部批准。
<1.2 菌种特性
<菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。
<1.3 制造用菌种库的建立
<从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均应进行下列检定，合格后方可投产。
<1.3.1 划种LB琼脂平板
<应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
<1.3.2 涂片革兰氏染色
<在光学显微镜下观察应为典型的革兰氏阴性杆菌。
<1.3.3 对抗生素的抗性
<应与原始菌种相符。
<1.3.4 电镜检查
<应为典型大肠杆菌形态，排除支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
<1.3.5 生化反应
<应符合大肠杆菌生物学性状。
<1.3.6 干扰素表达量
<在摇床中培养，应符合原始菌种的表达量。
<1.3.7 表达的干扰素型别
<应用标准抗α型干扰素血清作中和试验，证明型别无误。
<1.3.8 质粒检查
<应做该质粒的酶切图谱，应与原始质粒相符。
<1.4 种子液制备
<1.4.1 菌种传代用LB培养基
<液体LB培养基不含琼脂，供摇床培养用，含2%琼脂供制备平板和斜面用，含0.5%琼脂的半固体供短期保存菌种用。
<1.4.2 生产菌种的制备和检定
<取制造用菌种库冻干菌种，开启后划种培养基平板2<～3<块，培养后挑取平板中典型集落8<～10<个，分别培养后保存，然后分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，先其中干扰素表达量最高的一份供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种库的表达量，所表达的干扰素应用标准抗α型干扰素血清作中和试验，证明型别无误。
<1.4.3 种子液的制备
<将菌种接种M9CA培养基，在摇床中培养至OD值在0.4～0.8之间即可供发酵罐接种用。种子液应进行质粒稳定性检查。
2 <发酵
2<.<1 每次发酵前必须进行一次空罐灭菌。
<2.2 发酵用GMD培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素，配制后进行实罐灭菌。
<2.3 发酵温度为36.5±0.1℃，根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度，并作必要的培养基成分添加，发酵时间根据工程菌生长情况确定。发酵结束时放出菌液，发酵灌应再进行一次灭菌并清洗。
3 <收菌
<用离心法收取菌体，称重，容器上标明批号、罐别、重量、日期。收获<的菌体如在24小时内破菌裂解可保存于4～8℃冷库，否则应置?/30℃冻存。
<4 菌体裂解与粗制干扰素制备
<用高压匀浆法裂解菌体，将菌体作成10%～20%的悬液进行高压匀浆，压力50Mpa/cm2，连续匀浆二次，匀浆后的悬液离心后取上清即为粗制干扰素。
<5 浓缩与纯化
<5.1 初步纯化
<采用不同原理多步骤的方法，使初步纯化的干扰素达到外观无色透明，无絮状物，比活性在105IU/mg蛋白以上，并将其浓缩至原体积的1/10～1/20，保存于4℃，如3天内不能进行高度纯化，应冻存于?/30℃冰箱内。
<5.2 高度纯化
<经初步纯化后进行高度纯化，去除绝大部分非干扰素蛋白，使其达到本规程7～8项要求。高度纯化应在洁净度为10000级的恒温(15～18℃)室内进行。
<5.3 在高度纯化过程中应进一步浓缩，使体积为初步纯化干扰素的1/5～1/10。并应转换缓冲液系统，使之适合于人体注射用。
<5.4 在整个浓缩与纯化过程中不得加入对人体有害的物质。
<5.5 在浓缩纯化过程中应特别注意去除热原质，用于分子筛层析的溶液，配合后应进行去除热原质处理。容器应干热灭菌，不能干热灭菌者应用适当浓度的NaOH处理。
<5.6 浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”，取样进行7.1～7.4项检定后，立即加入人白蛋白，使其最终含量为2%，称为“加白蛋白半成品”，取样测定干扰素效价，其余冻存于-30℃冰箱中，应尽量避免冻融。
<5.7 所用的人白蛋白应符合相应规程要求，HBsAg。
<6 稀释、除菌过滤
<6.1 将检定合格的加白蛋白半成品以乳径为0.22μm的滤膜除菌过滤，除菌后立即进行稀释。
<6.2 稀释液制备
<用合格的蒸馏配制生理盐水，经高压灭菌，加入检定合格的注射用人白蛋白，使最终含量为2%，即为稀释液。配制后应立即用于稀释。
<6.3 稀释
<除菌后加白蛋白半成品用稀释液稀释至所需浓度。稀释后用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌，保存于4℃，并取样作无菌试验和热原试验，合格后进行冻干。
<7 半成品检定
<每批半成品抽样进行7.1～7.7项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行7.8～7.12项检定。
<7.1 效价测定
<用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为检测系统。用国家参考品校准为IU。
<7.2 蛋白含量
<用Lowry法测定。同批不同阶段的样品比较时应尽可能同时测定。
<7.3 比活性
<根据效价测定及蛋白含量计算比活性，本品的比活性应在107IU/mg蛋白以上。
<7.4 纯度
<7.4.1 电泳纯度
<用非还原型SDS?/PAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描，纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。
<7.4.2 高效液相色谱纯度
<用280nm检测，应呈一个吸收峰，或主峰占总面积95%以上。
<7.5 分子量测定
<用还原型SDS?/PAGE法。加样量不低于5μg。制品的分子量与理论值比较，误差不超过10%。
<7.6 残余外源性DNA含量
<用固相斑点杂效法，以地高辛标记的核酸探针法测定，其含量应少于100pg/剂量。
<7.7 残余IgG含量
<如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行本项检定。采用ELISA双抗体夹心法测定，IgG含量应少于100ng/剂量。
<7.8 残余工程菌蛋白含量
<用酶标法或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%.
<7.9 抗生素活性
<半成品中不应有残余氨苄青霉素活性。
<7.10 肽图测定
<应符合α1干扰素的图形，批与批之间图形应一致。
<7.11 等电聚集
<测定等电点，应有固定的范围(4.0～6.5之间)。
<7.12 紫外光谱扫描
<检查半成品的光谱吸收值，批与批之间应一致，应有固定的最大吸收值。
<8 除菌半成品检定
<8.1 效价测定
<同7.1项。
<8.2 无菌试验
<按《生物制品无菌试验规程》进行。
<8.3 热原质试验
<按《生物制品热原质试验规程》进行。每只家兔静脉注射干扰素5万，判定标准按该规程4.1项要求进行。
<9 成品检定
<9.1 处观
<应为微黄色薄壳状疏松体，加入1ml蒸馏水后溶解迅速，不得含有肉眼可见的不溶物。
<9.2 pH值
<9.3 无菌试验 <同8.2项。每批抽样不少于10支。 <9.4 水分 <应≤3%。 <9.5 热原质试验 <同8.3项。 <9.6 价测定
<同7.1项。效价应为标示量的80%～150%。 <9.7 安全试验 <9.7.1 豚鼠试验 <用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射1ml(于1ml生理盐水内)，观察7天，豚鼠应健存，每只体重增加判为合格。 <9.7.2 小白鼠试验 <用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml(于0.5ml生理盐水内)，观察7天，动物应健存，每只体重增加判为合格。 <10 规格 <10μg/瓶，20μg/瓶和30μg/瓶。 <11 保存与效期 <保存于2～8℃，自效价检定合格之日起效期为2年6个月。 <冻干基因工程α1b<干扰素使用说明书 <本品系用健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因组建杂交质粒，转化大肠杆菌，使之高效表达人α1b干扰素，经高度纯化后冻干制成。本品为微黄色疏松体，每支含α1b干扰素10μg、20μg或30μg，相当于用MDBK/EMC系统测定的效价100万单位，200万单位和300万单位，用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎及毛细胞白血病的治疗。 <用法 <每支用灭菌注射用水1ml溶解，肌内或皮下注射，不得静脉注射，建议晚上给药。剂量及疗程推荐如下： <毛细胞白血病：40～60μg，每天注射一次，连续用药6个月以上。可根据病情适当调整，缓解后可改为隔天注射1次。 <慢性乙型肝炎：40μg(20～60μg)，每天注射一次，或在用药4周后改为每周3次，连续治疗3个月或更长。 <副反应 <最常见的副反应为发热和疲劳，常在开始用药阶段出现，多数为低热(38℃以下)，一般为一过性。其他副反应有头痛、肌痛、关节痛、食欲不振、恶心等。 <常见的化验异常是颗粒白细胞减少和血小板减少，停药后可恢复。 <如出现上述患者不能忍受的严重副反应，应减少剂量或停药，并进行对症治疗。 <禁忌证 <1.已知对干扰素制品过敏者； <2.有心绞痛、心肌梗塞病史以及其他严重心血管病史者； <3.有其他严重疾病，不能耐受本品之副反应者； <4.癫痫和其他中枢神经系统功能紊乱者。 <注意事项 <1.凡有明显过敏体质，特别是对抗生素有过敏者， 本品应慎用， 必须使用时应先用本品作皮肤试验(1:100稀释，皮内注射)，阴性者方可使用。在使用过程中如发生过敏反应应立即停药，并给予相应治疗。 <2.使用前应仔细检查安瓿，如安瓿有裂缝、破损不可使用。在加入灭菌注射用水后稍加振荡，制品应溶解良好，如有不能溶解的块状或絮状物，不可使用。 <3.制品溶解后应一次用完，不得分次使用。 <保存 <保存于2～8℃暗处。