第二节 cRNA探针在原位杂交组织化学(ISHH)中的应用
Angerer及其同事们首先应用RNA探针于原位杂交(见Cox et al 1984)，核酸探针为单链的RNA分子，产生自具有质粒逆转录系统的cDNA克隆(图20-2)。由于它是单链的，不像双链的DNA探针，在溶液中不会再退火(reanneal)，因此，较大百分比的探针可参与杂交反应，较cDNA探针的信号强。除此之外，在溶液中产生的cRNA-mRNA杂交体比相应的cDNA-mRNA杂交体稳定，但在原位杂交中是否如此尚未证明。cRNA探针不足之处在于有时比DNA探针粘性强(stickier)。可与组织产生较高的非特异性结合，但此缺陷可在杂交后漂洗液中加用酶漂洗来解决。最近，Wolf等(1987)建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA分子，这种cRBA分子称为“寡核苷酸核酸探针”(oligoribo-probes)已被成功的用于原位杂交实验。
图20-2 示cDNA转录为cRNA，可标记以不同的标记物，然后与细胞中
的mRNA相结合。Biotin( 生物素)，Au(金)，digo-(地高辛)
一、同位素标记cRNA探针在ISHH中的应用
(一)组织切片的原位杂交细胞化学方法
(1)组织准备：大鼠以10%水合氯醛(0.3ml/100g 体重)，或1%戊巴比妥钠约1ml(3～4mg/100g体重)腹腔内注射麻醉，用100ml生理盐水冲洗和150ml 4%多聚甲醛主动脉灌注固定。固定半小时后，取出组织块，置入4%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。
如要取脑组织，可于灌注后置4℃冰箱内过夜，次晨取脑组织，后固定4℃4h左右。
(2)组织切片/培养细胞在经过处理，抹以粘附剂的载片上，在43℃烤箱过夜。
(3)在PBS(0.1mol/L Ph7.2)中浸5～10min。
(4)浸于0.1mol/L甘氨酸—PBS 液内5min。
(5)为增强组织通透性，将载片置于0.3% Triton X-100(在PBS内)10～15min。
(6)PBS洗3×5min。
(7)在蛋白激酶K(1<μg/ml)溶于Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA(50mmol/L, pH8)中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。
(8)浸入新鲜配制的4%多聚甲醛(在PBS0.1mokl/L, pH7.2)3min以终止消化作用和再固定。
(9)浸入新鲜配制的含0.25%(V/V)三乙醇胺(0.1mol/L pH8.0)中，10min以达乙酰化(acetylate)的目的。
(10)预杂交：在50%(V/V)甲酰胺溶于4×SSC预热37℃15～45min 。
(11)杂交：将载片上过量的甲酰胺液倾去，加20<μl杂交混合液(含放射性同位素标记的探针量为5×103～106cpm/每张载片)。覆以硅化的盖玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒内以保持湿度，42℃孵育12～18h。为使载片不致于浸泡于SSC溶液内，通常以二根玻管(或棒)扎成担架状，载片置于玻棒上，与盐液不接触，但可保持盒内空气湿润。
(12)杂交后漂洗
①以小烧杯盛适量4×SSC溶液，将载片一端斜插入溶液内，轻轻抖动以移除盖玻片。
②将载片置于有刻度的染色用小方玻缸内，加入42℃(预热)4×SSC，3×20min。在漂洗过程中宜不断振动，以增强漂洗效果。如设有调整钮的振动台更为理想。
③加20<μlRNA酶溶液(20<μg/ml)在NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和EDTA(1mmol/L, pH8.0)消化未杂交探针，42℃30min(也有不加EDTA的)。
④以递减梯度盐溶液SSC漂洗载片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。
⑤梯度酒精脱水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室温，每次10min，空气干燥后待进行放射自显影。
(13)放射自显影和复染
①在暗室中预热水浴至45℃，将分装的核乳胶溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同时预热一电热板至45℃。将杂交后漂洗过完全干燥的载片依次排列于玻片架上，有组织切片一面面向实验者。在实验的载玻片前放1～2张无切片的干净玻片，作为测定核乳胶溶解度与浸片高度等的空白对照片。浸泡(Dipping)过核乳胶膜的载片放入暗盒内，事先最好将暗盒准备好，为保持干燥，放入一包变色硅胶干燥剂(无水干燥剂为小块蓝色晶体，吸水后呈粉红色，置烤箱中烘干待转成蓝色后可重复应用)，预先备好封固暗盒用的胶带备用。
②核乳胶液，国外产品为ILFord K5乳胶液，国内核乳胶产品可自原子能研究所订购。不论国产或进口乳胶，事先应(按说明需要浓度)稀释分装在10ml小瓶内，密封于暗盒内，4℃备用。反复的冷冻和融解核乳胶会增加背景染色。每一小瓶供一次性实验应用。
为节 省核乳胶，切片宜贴附在靠近载片的一端。这样，在浸泡时少量乳胶便可充分覆盖切片。
③浸核乳胶(Dipping)：当一切准备工作就绪后，在暗室中(只留完全灯)先将载片置于电热板上预热1～2min。以空白载片浸入核乳胶液，取出后检查核乳胶是否充分溶解，玻片上有无气泡。然后正式进行切片浸入。浸核乳胶膜是一项需反复操练的技术。以拇、食指夹住玻片一端，以垂直方向进入乳胶，进入的提出均应采取中速度，且速度应保持稳定，提出后可将玻片一端滴下的乳胶轻沾于吸水纸上，掌握好该技术，浸入形成的核乳胶膜厚度适当，均匀一致。依序放在预热45℃的电热板，倾斜度应一致。在45℃电热板上干燥至少1～2h，在此期间应严格控制在黑暗中。
④装入暗盒曝光：将载片架上已干燥覆有核乳胶的载片放入暗盒内，周围用胶带封固，以标签写明：样品种类，实验者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱内。曝光时间依同位素种类而异，32P大约需5～7日，3H需4周，但还要参考细胞内mRNA的含量而定，含量高者曝光时间宜短，反之宜适当延长。可根据不同曝光时间的实验结果予以调整。曝光时间长可增加信号，但也增加背景，反之，信号减弱，但背景亦低。
⑤显影：取出切片中暗盒(注意：切勿启封)，放在室温至少1h，使其回升到室温。然后在暗室内(只留安全灯)，将载片置入Kodax D19显影液(预调温至18～20℃)3min。水冲片刻后入Kodax F24固定剂内3min。上述溶液及水温最好都保持在18～20℃。突然改变溶液温度会损坏精细的核乳胶膜。另外，在显影和定影过程中不要振荡溶液，因为，这时的乳胶还是处于胶状结构，溶液振荡的冲击可使乳胶膜产生划痕。
⑥冲洗，脱水和复染：用自来水(水冲力勿过猛)冲洗载片20min，如需要可用1%苏木精复染，复染后自来水冲洗分化2min，梯度酒精脱水(70%，90%，100%)每次3min，二甲苯透明，DPX封片。
(二)培养细胞的原位杂交细胞化学方法
(1)固定：通常将细胞培养在盖玻片或塑料薄膜上，可将盖玻片取出，倾去培养液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依组织切片处理法进行ISHH实验。也有在4%多聚甲醛室温固定20min后，由低浓度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鲜配制的70%酒精中，4℃，备用。
(2)重回到水：50%，30%酒精3min，无菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/L MgCl2 10min，室温(配制法：200ml PBS, 1ml MgCl2)。
(3)0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室温10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/L Tris(配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，应用重蒸水制成200ml)。
以后步骤同(一)组织切片法。
二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用
(一)光敏生物素标记cRNA探针的应用
以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针，使其最终浓度为0.5～1.0<μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素(1<μg/μl)混合。在150瓦卤素灯下，距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针，将其溶于适量的灭菌双蒸水，用紫外分光光度计测探针的光密度(详第十九章 )，其最佳工作浓度为2<μg/ml。
切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节 。
光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序：
(1)石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/L PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。
(2)0.1mol/L 甘氨酸PBS冲洗5min。
(3)0.4% Trition X-100 PBS 冲洗15min。
(4)蛋白酶K1<μg/ml(0.1mol/L Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保温30min。
(5)4%多聚甲醛PBS固定5min。
(6)0.1mol/L PBS冲洗2×3min。
(7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L 三乙醇胺配制)10min。
(8)2×SSC冲洗10min(1×SSC：0.15mol/L NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠)。
(9)取10<μl含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上放入冰浴中冷却，然后再用。
(10)盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜，入温盒43℃保温12～16h。
(11)4×SSC洗脱盖片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
(12)2×SSC(含20<μg/mlRNaseA, 适于RNA探针)冲洗30min，37℃。
(13)1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
(14)0.05mol/L PBS 冲洗4×5min。
(15)3%BSA(0.4% Triton X-100 PBS配)37℃保温30min。
(16)Avidin –AKP(碱性磷酸酶)(1：500～1：100，0.4% Triton X-100 PBS配)室温1～3h。
(17)0.05mol/L PBS冲洗4×5min。
(18)TSM1冲洗2×5min。
(19)TSM2冲洗2×5min。
(20)硝基四氮唑蓝(NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)0.2mg/ml混合液显色，室温，暗处3h。
(21)20mmol/L EDTA,pH8.0终止显色。
(22)甘油明胶直接封片。
结果：杂交阳性部位着蓝黑色。
组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。
(二)酶促生物素标记cRNA探针的应用
基本方法和放射性标记cRNA探针同，所不同的是探针浓度为2.5<μg/μl。显示探针反应步骤如下。
(1)用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。
(2)将载片浸入0.3% H2O2在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。
(3)PBS冲洗2×3min，用吸水纸拭干切片周围的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清(1：30)，室温1h，或4℃过夜。
(4)PBS彻底冲洗。
(5)载片加生物素化抗小鼠IgG(1：100)30min室温。
(6)PBS彻底冲洗。
(7)应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室温。
(8)PBS彻底冲洗。
(9)将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液，0.02% H2O2,孵育3～15min。
(10)水洗，复染，脱水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染，多层ABC或PAP法加强染色效果。
三、地高辛标记cRNA探针的应用
(一)基本原理
地高辛(Digoxigenin 简写Digo-)又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成digoxigenin –11-dUTP(图20-3)。通过随机引物或缺口翻译法(多用随机引物法)，将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab(抗原结合片段)结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的，其反应过程见图20-3。
图20-3 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
常用的免疫酶学检测方法有两类：一是Dig –HRP(辣根过氧化物酶)检测体系，以DAB(四氢氯化二氨基联苯胺)/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。另一是Dig –AKP检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。
应用地高辛标记的核酸探针也较稳定，据报告在-20℃贮存可达2年，随时要取用，不像放射性标记探针有半衰期所致的时间限制。但在现实应用中，仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记3～6个月以内的核酸探针。为节 省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的杂交液也可反复多次使用，特别是对于已知的重复性实验。对于细胞或组织内未知mRNA的检测，仍宜采用未使用过的探针杂交液为佳。
与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。由于地高辛具有灵敏度及分辨率高，反应产物颜色鲜艳，反差好，背景染色低，制备探针可较长期保存，对人体无害等优点，已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。它不仅可应用于原位杂交细胞化学，还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序列，进行RFLP分析用于基因诊断，菌落原位杂交，噬菌斑原位杂交，固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中，组织中病毒DNA序列的检测。这一技术还被应用于检测DNA标记物及测序，对人类染色体连锁图谱进行构建和基因图谱分析。
(二)基本操作步骤
组织处理及预杂交等步骤与本章 中叙述的放射性同位素标记cRNA探针相同，但由于地高辛标记cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，我们在基本方法中仍较详细的叙述其操作过程。
1.组织前处理在组织制片中以冷冻切片(厚10～30<μm)最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。
在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸(foilpaper)包被，内加少许干燥剂(变色硅胶)。
下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
(1)PBS洗2×3min。
(2)选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。
其它切片暂放于PBS 内。
RNA酶对照片处理方法：加RNA酶(100<μg/ml)在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。
(3)蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/L Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1<μg/ml，孵育15～20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。
(4)0.1mol/L甘氨酸/PBS 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐(0.1mol/L 三乙醇胺配制)10min。
(5)在4%多聚甲醛/PBS3min。
(6)以PBS 漂洗2×3min。
(7)浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min，以封闭非特异性结合部位。
(8)2×SSC漂洗15min。
2.杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液，按每张切片10～2<μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃，16～18h或过夜。
3.显示
(1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。
(2)在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。
(3)拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1：500，以缓冲液1稀释)，孵育2h，室温。
(4)缓冲液1漂洗3×3min。
(5)浸入缓冲液210min室温。
(6)浸入底物中孵育10～30min(或更长时间，视需要而定)，底物内含显色BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。
(7)将切片浸入缓冲液3以终止反应。
(8)复染，可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁丫)(pyronin 丫)10～30s。
(9)流水洗5～10min，直至水无色为止。
(10)在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。
几点说明
①缓冲液1，2，3配制法见附录。缓冲液1中BSA用量大，价贵，如无法负担可略去。
②切片处理过程可采取漂浮法或载片染色法，载片染色适用于切片数数量较少时，可用液体覆盖于切片表面进行孵育，漂洗在烧杯内进行。如切片多，可将载片置于方形的染色缸(staining jar)内，将冲洗液加入缸内，如有振荡器在漂洗中稍加震荡更有助于减低背景染色。漂浮法适用于切片数量大量，将切片置于凹形碟内，或染色缸内。漂浮法的优点是节 约试剂用量，切片两面均可接触反应液，有利于信号的增强。
③在底物中孵育时间过长会产生弱强的非特异性染色，有时甚至误为阳性反应。解决方法一是设置对照片，二是对非特异性染色加以区别。非特异性染色与特异性染色的主要区别点在于后者有结构性定位，而前者系无结构性定位，常在切片边缘或细胞密集处呈现较强的颜色反应。
④在组织前处理中应严格注意控制RNA酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫细胞化学一样，自始至终应保持切片的湿润，勿令其干燥。
校对：2000/06/01 杨丽华
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