第三节 Pcr操作范例及反应体系的组成
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《免疫细胞化学》
第三节 PCR操作范例及反应体系的组成
一、PCR操作范例
在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNA 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。
表22-1 PCR反应混合液
|
成分 |
加入体积(μl) |
最终浓度 | |
|
双蒸馏水 |
53.5 |
||
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10×反应缓冲液[1] |
10.0 |
[1×]Mg2+1.5mmol/L K+50mmol/L | |
|
4×dNTPs(各1.25mmol/L) |
16.0 |
各200μmol/L | |
|
λ-DNA模板(全长48.5kD) |
10.0 |
1ng/次 | |
|
引物1,2(各25bp,20μmol/L)[3,4] |
5.0 |
1.0μmol/L(100pmol) | |
|
Taq聚合酶储存液[2] |
0.5 |
2U/100μl | |
|
总体积(pH8.3) |
100.0 |
||
|
石蜡油 |
50～100.0 |
||
|
琼脂糖(%) |
kb |
PAGR(%) |
bp |
|
0.3 |
60～5 |
3.5 |
100～1000 |
|
0.6 |
20～1 |
||
|
0.7 |
10～0.8 |
5.0 |
80～500 |
|
0.9 |
7～0.5 |
8.0 |
60～400 |
|
1.2 |
6～0.4 |
12.0 |
40～200 |
|
1.5 |
4～0.2 |
20.0 |
10～100 |
校对：2000/06/02 杨丽华
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