*表示甲基化

三、分子克隆化的另一些酶

(一)DNA聚合酶

(DNA polymerase)的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物(primer)的3’-OH上，释放出一个焦磷酸分子(ppi)，如下式表示。

聚合酶主要有以下几种：

1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大肠杆菌DNA聚合酶(E. Coli DNA polymerase)主要有3种作用：①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移(nick translation)中的应用，将在下面介绍。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。

另外还有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ。前者不能利用单链DNA或poly(dA-dT)为模板。需有镁离子和dNTP时才能表现出酶活性，无自发合成DNA的作用。后者没有5’→3外切酶活性，也不能用单链DNA作为模板。

2.噬菌体DNA聚合酶 这里以T4DNA聚合酶为例。它也具有5’→3聚合酶活性，但它的外切酶活性比大肠杆菌的要高200倍。因此，它也可用来补齐单链末端或标记同位素。

(二)RNA聚合酶

RNA聚合酶(RNA polymerase)的作用是转录RNA。有的RNA聚合酶有比较复杂的亚基结构。如大肠杆菌RNA聚合酶有四条多肽链，另有一个促进新RNA分子合成的σ因子，因此它的组成的是α2ββσ。这种结构称为全酶(holoenzyme),除去了σ因子的酶称为核心酶。噬菌体RNA聚合酶则没有亚基。

真核生物的RNA聚合酶分三类。RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中，转录rRNA顺序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核质中，转录大多数基因，需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核质中，转录很少几种基因如tRNA基因如5SrRNA基因。有些重复顺序如Alu顺序可能也由这种酶转录。上面提到的“TATA”框又称Goldberg –Hogness顺序，是RNA聚合酶Ⅱ的接触点，是这种酶的转录单位所特有的。它在真核生物的转录基因的5’端一侧，在转录起点上游20至30个核苷酸之间有一段富含AT的顺序。如以转录起始点为0，则在-33到27个核苷酸与-27至21核苷酸之间，有一个“TATA”框。一般是7个核苷酸。RNA聚合酶Ⅱ转录单位的典型结构如图23-2。原核生物中也类似“TATA”框的结构。RNA聚合酶作用在“TATAAT”(Pribnow)盒和“TTGA-CA”框附近。

图23-2 反转录酶的作用机理

(三)反转录酶

反转录酶(Reverse transcripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA( cDNA)的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA(ssDNA)，再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA(dsDNA)，再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此，反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。

(四)核酸外切酶

大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(exonuclease Ⅲ)是从带3’-OH末端的双链DNA，按3’→5’方向切除5’单核苷酸：

大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ则是从单链DNA的3’端和5’端切除寡核苷酸(两种形式)：

(1)(2)

前一种酶需要镁离子作辅助因子才有活性；后一种酶则不需镁离子，因此即使在有螯合剂EDTA的情况下也有活性。另一种从噬菌体λ感染的大肠杆菌中提取的λ核酸外切酶是从带有5’磷酸末端的双链DNA上，逐个切除5’单核苷酸，在反应时需要镁离子：

(五)核酸酶S1

核酸酶S1(nuclease S1)主要是降解单链DNA或单链RNA。对单链DNA的活性更高。它的用途是切除DNA片段的单链末端使之成为平头末端，切开合成dscDNA时形成的“发夹”环以及分析DNA-RNA杂合子的结构。

(六)DNA酶

DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)是随机水解双链或单链DNA的一种内切酶，使DNA分子降解成带有5’磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物：

在进行重组DNA研究时，必须注意防止DNA酶的污染，否则制备的DNA样品将会降解。因此器皿或试剂高温处理，样品中加EDTA，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。

(七)RNA酶

RNA酶A(ribonuclease A)作用于嘧啶核苷酸的3’磷酸根上，切开与相邻核苷酸连接的5’磷酸键。另一种RNA酶T1只作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸根，切开与相邻核苷酸连接的5’磷酸键。人体的分泌物如唾液，汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA样品时，必须戴手套，实验用的玻璃器皿都要经250℃烘烤4h(RNA酶耐热)，或用RNA酶的抑制剂处理。

(八)连接酶

最常用的是T4DNA连接酶(T4DNA ligase)，催化双链DNA中相邻的3’OH与5’磷酸根之间形成磷酸二酯键，它可用来连接具有粘性末端的两个DNA片段，或连接两个平头末端的DNA片段，使之成为一个重组DNA分子。可是这种酶只能连接双链DNA而不能连接单链DNA分子。T4RNA连接酶则可在单链DNA分子或RNA分子的5’磷酸根和3’-OH之间催化生成共价键。

(九)末端转移酶

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotide transferase)的作用是将脱氧核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。

(十)碱性磷酸酶

从DNA或RNA的三磷酸脱氧核糖核苷酸或三磷酸核糖核苷酸上除5’-磷酸根残基。一般的用途是用这种酶处理DNA或RNA后，在5’端上标记32P。在经限制性内切酶酶切DNA片段后，用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)处理可以阻止酶切的片段自身连接，这在克隆DNA片段时特别有用。

校对：2000/06/05   杨丽华