通心络对人体外周血EPC增殖、迁移和黏附功能的影响(二)
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(上接6月26日A7版)
7. 内皮祖细胞黏附能力测定
同上搜集贴壁细胞,悬浮于500 μl培养液中,计数并将同等数目的内皮祖细胞(EPC)接种于包被人纤维连接蛋白培养板,在37℃ 5% CO2饱和湿度培养箱中培养30分钟,计数贴壁细胞。
结果
1. 内皮祖细胞的鉴定
培养4 d后,洗去未贴壁细胞,可见典型细胞集落,中间为大量圆形细胞,外周为纺锤形细胞,向外扩散,7 d后形成梭形内皮样细胞。用Dil-acLDL和F1TC-UEA-I对细胞染色后,通过激光共聚焦显微镜鉴定,UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPC(图1,见上期)。
图2显示,流式细胞仪示,贴壁细胞CD34阳性表达率为69.7%±6.5%(n=5),CD133阳性表达率为80.4%±8.3%(n=5),对照组CD34阳性表达率为72.7%±7.5% (n=5),CD133阳性表达率为2.7%±1.7%(n=5),而CD133阳性表达明显缺失。
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2. 内皮祖细胞的生长及形态学改变
倒置显微镜下动态观察可见,在培养的第2天开始出现内皮细胞成簇现象,第4天细胞由圆形转变为梭形贴壁细胞,第7天成为纺锤形、鹅卵石样的单层细胞,呈条索状或管状分布,对照组细胞间隙较大。通心络组细胞间隙较对照组缩小,细胞生长较快,细胞量较多。
3. 通心络对外周血内皮祖细胞迁移功能的影响
通过transwell小室(孔径8 μm)检测通心络对外周血EPC迁移功能的影响。结果显示(表1,图3),不同浓度通心络组均改善了外周血EPC的迁移功能,其中100 μl 浓度的作用最为显著(23.2±1.7对15.3±2.0 ,P<0.01)。但在 200 μl组迁移能力低于其他各组,提示较高浓度的通心络对细胞存在一定毒性作用。采用100 μl的通心络进行时效作用的研究,结果显示(表2,图4),通心络呈时间依赖性地增强EPC迁移能力,36 h达到高峰。Transwell小室检测通心络与对照组培养7d的EPC迁移功能研究显示(图5),100 μl通心络组较对照组EPC迁移数明显增加(cells×200)。
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4. 通心络对外周血内皮祖细胞黏附功能的影响
不同浓度通心络36 h对外周血EPC迁移和黏附的影响研究显示(表1,图6),各个不同浓度通心络组均改善了EPC的黏附功能,在100 μl时最为显著(43.8±4.7对28.5±4.7, P<0.01)。但在 200 μl组黏附能力低于其他各组,提示较高浓度的通心络对细胞有一定的毒性作用。100 μl通心络对外周血EPC黏附能力影响的时效关系研究结果显示(表3,图7),通心络增强EPC黏附能力的作用呈时间依赖性,6 h贴壁细胞数开始显著增加(P<0.05),36 h达到高峰(P<0.01)。
研究者认为,通心络影响EPC数量和功能的确切机制尚未明确。可能与下列因素有关:①通心络可减少EPC的凋亡 通心络可明显抑制缺氧引起的血管内皮细胞Caspase-3活性增高并减少缺氧所诱导的动脉内皮细胞凋亡;②通心络可能通过增加NO、NOS水平,增加其生成和生物利用度,减少ox-LDL产生,降低内皮素浓度,从而对血管舒缩的调节、内皮细胞黏附分子的表达起到关键作用;③通心络为中药复方制剂,体现的是一种综合作用,亦可能通过其他信号传导途径调节EPC的分化和增殖。这尚待进一步研究。
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研究结论为:不同浓度通心络均可改善EPC的迁移能力和黏附能力,在100 μl时作用36 h影响最为显著(P<0.01)。这提示,通心络具有显著改善人外周血EPC迁移和黏附能力的作用,在一定浓度范围内呈明显时效与量效关系。
依据中医络病理论研制的中药通心络具有益气活血、通络止痛,使气旺血行、脉络畅通的功效。已有研究证实通心络能显著改善冠心病患者的血管内皮功能,促进NO的合成,稳定斑块,延缓动脉粥样硬化进程,故通心络胶囊能改善冠心病心绞痛症状,改善内皮舒张功能,改善心肌缺血,目前已广泛应用于临床心脑血管疾病的预防和治疗。但通心络对内皮细胞的保护作用机制尚不明确。内皮功能稳定与冠心病密切相关,内皮细胞的再生和增殖作用在动脉粥样硬化的修复和血管再狭窄中亦起重要作用。因而他们设想通心络可能通过影响EPC参与内皮的修复以改善心血管疾病的临床症状和预后。
(未完待续)
表1 不同浓度通心络36 h对外周血EPC迁移和黏附能力的影响
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组别迁移(cells×200)黏附(cells×200)
对照组 15.3±2.028.5±4.7
10 μl通心络组 16.8±1.630.7±5.2
20 μl通心络组 18.9±2.8*33.4±4.1
50 μl通心络组 20.1±1.5**40.2±5.8**
100 μl通心络组 23.2±1.7*43.8±4.7**
150 μl通心络组 19.4±2.232.8±4.5
200 μl通心络组 17.0±1.429.2±4.8
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表2 100 μl通心络对外周血EPC迁移能力变化的时效关系
组别 0 6 h 12 h 24 h 36 h
对照组14.8±3.015.2±2.815.5±1.815.9±2.515.9±3.1
通心络组 15.0±2.7 17.2±3.5 19.2±1.5* 20.3±3.4* 23.2±1.7**
(100 μl)
与对照组相比*P<0.05, **P<0.01
表3 100 μl通心络对外周血EPC黏附能力变化的时效关系
组别 0 6 h 12 h 24 h 36 h
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对照组28.2±5.129.0±4.629.3±4.529.8±5.330.3±4.8
通心络组
(100 μl)
与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
图2 贴壁的EPC培养7d后流式细胞仪示CD133阳性表达率
CD133阳性表达率为80.4%±8.3%(A1-A2),对照组内皮细胞培养7d后,流式细胞仪示CD133阳性表达率为2.7%±1.7%(B1-B2)
图3 不同浓度通心络36 h对外周血EPC迁移能力的影响
图4 100 μl通心络对外周血EPC迁移能力变化的时效关系
图5 通心络与对照组培养7d的EPC迁移数量
Transwell小室检测其迁移功能,100 μl通心络组(左图)较对照组(右图)细胞迁移数明显增加(cells×200)
图6 不同浓度通心络36 h对外周血EPC黏附功能的影响
图7 100 μl通心络对外周血EPC黏附功能影响的时效关系, http://www.100md.com