中国临床肿瘤学教育专辑 (2007) 95

    乳腺癌BA46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫

    1

    南方医科大学南方医院肿瘤科

    2

    南方医科大学南方医院呼吸科

    3

    美国阿肯色大学医学院基因治疗中心

    尤长宣 1

    苏 瑾2

    廖旺军1

    张军一

    1

    郑航 1

    Yong Liu

    3

    Paul L Hermonat

    3

    罗荣城 1

    摘要 目的：探讨以乳腺癌特异抗原 BA46 基因转染乳腺癌患者树突状细胞(DC)诱导特

    异细胞免疫的可行性。方法：取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞

    (DC 前体细胞)，将细胞分为基因转移组及对照组，基因转移组感染携带 BA46 基因的重组腺相

    关病毒 rAAV/BA46/Neo，对照组以 293 细胞冻融液刺激，两组细胞均采用重组粒细胞巨噬细胞

    集落刺激因子(GM-CSF) 、白细胞介素4(IL-4)诱导DC前体细胞成熟。第7 天，收集悬浮细

    胞(DC)，显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析 DC 的表面标志 CD80、CD86、CD40 的表达

    情况；另取该 DC 与 T 细胞按 1：20 比例混合，含 5%人血清蛋白的 AIM-V 为培养基，同时加

    入IL-2 与 GM-CSF，共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细(CTL) ，取BA46 阳性的乳腺癌细

    胞株 Hs578T 为靶细胞，采用 51

    Cr 释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪检测 CTL 群体中

    CD8/CD4 和CD8/CD56的比值。结果：BA46 基因转导的 DC表面标志 CD80、CD86、CD40 的

    表达均明显高于对照组 DC，所激活的 T 细胞对 BA46 阳性的乳腺癌细胞株 Hs578T 有很好的杀

    伤效果，此杀伤具有抗原特异性和MHC限制性，且该T细胞中 CD8/CD4 和 CD8/CD56 的比值

    均明显高于对照组(裂解物冲击DC所激活的 T细胞)。结论：BA46 基因转导成功制备 DC，并

    诱导特异的CTL，为乳腺癌的DC基因转导疗法打下基础。

    关键词 树突状细胞；BA46；基因转移；乳腺癌

    树突状细胞(DC)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，采用体外培养 DC，特异肿瘤抗原刺激制成DC瘤苗，免疫机体从而激发特异的细胞免疫有望成为一种理

    想的肿瘤治疗手段[1， 2]。此疗法的关键是获得特异的肿瘤抗原，并将该抗原转导DC。乳腺癌是女性发病

    率最高的恶性肿瘤，BA46几乎在所有的乳腺癌细胞表达，而在乳腺以外的正常组织内不表达，以其抗原

    肽免疫转基因鼠，可在其身上诱导出特异的细胞免疫[3]

    ， 它是乳腺癌 DC治疗非常理想的肿瘤抗原。因此，本研究以腺相关病毒(AAV)以载体，成功制备高滴度的携带 BA46 基因的重组腺相关病毒

    (rAAV/BA46/Neo 病毒)[4]。在此基础上，取人外周血单个核细胞(DC 前体细胞) ，体外培养，以

    rAAV/BA46/Neo病毒转染DC前体细胞，GM-CSF、IL-4 和 TNF-a诱导 DC成熟，加入 T细胞，GM-CSF

    和 IL-2 诱导，最终获得针对 BA46 的细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL)，并检测该 CTL 对 BA46 阳性的乳腺

    癌细胞株Hs578T的杀伤效果及CTL内CD8/ CD56 和 CD8/CD56 的情况，探讨此基因转移法制备 DC，诱导CTL用于治疗乳腺癌的可行性。

    一、 材料与方法

    (一) 材料

    1. 病毒：重组乳腺癌 BA46 基因腺相关病毒(rAAV/BA46/Neo)由作者于阿肯色大学医学院基因治

    疗中心制备，病毒滴度为1×1010

    个病毒颗粒/ml

    [4]。

    96 中国临床肿瘤学教育专辑 (2007)

    2. 主要试剂：AIM-V培养基购自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自 Sigma 公司；

    AIM-V(R)无血清淋巴细胞培养基购自 GIBCO Invitrogen 公司；GM-CSF 购自 Immunex 公司；IL-4 购

    自R&D SYSTEMS公司； Anti-CD40抗体购自 Immunotech公司； anti-CD80 购自 Becton-Dickinson公司；

    anti-CD86，anti-CD4，anti-CD8，anti-CD56 均购自Pharmingen公司。

    (二) 方法

    1.人外周血 DC 的培养：取健康人外周血 50ml，Ficoll 分离，收集淋巴细胞，以 AIM-V 为培养基，调节细胞浓度为109

    /ml，培养于6孔板，每孔2.5ml，在37℃、5%二氧化碳孵箱中培养贴壁5h，轻轻洗去

    悬浮的淋巴细胞，取贴壁的单个核细胞，每孔加2.5ml含GM-CSF(终浓度为800U/ml)的AIM-V培养基，将细胞分为基因转移组和对照组(未感染病毒组)，基因转移组每孔加 rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感

    染5h后换液为每孔 3ml 含GM-CSF(终浓度为800U/ml)的 AIM-V培养基 ......