创新发展络病学 推进中医药国际化进程 络病理论指导血管病变防治研究取得系列重要进展——第三届国际络病学大会学术报告及系列研究报道(7)
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在第三届国际络病学大会上,有多项动物试验结果公布,其内容主要涉及冠状动脉早期炎症反应、血管内皮损伤、内膜增殖和通心络干预对氧化应激损伤、代谢综合征及骨髓间充质干细胞移植的影响等。这些研究报告使我们更新了许多旧的概念,开阔了眼界,开拓了思路,把我们带入了更深、更广的研究领域,并提高了认识起点。
据上海长征医院吴宗贵教授报告,血管外膜也参与了动脉粥样硬化(AS)的发生发展。血管外膜除了具有末梢神经和滋养血管外,还具有分泌功能。国外学者通过剥除兔颈动脉外膜的方法研究了血管外膜对血管内膜增生的影响,结果显示,外膜剥除后内膜发生增生。
CD40和CD40配体系统作为重要的炎症信号通路,在AS发生和斑块稳定中起重要作用。
通心络超微粉是在络病理论指导下研制的中药复方制剂,由人参、水蛭、全蝎等多种纯天然中药精制而成,具有补益心气、活血通络的作用,适用于络气虚乏、血瘀络阻患者,并能改善内皮功能,具有抗AS和稳定斑块的作用,因此对冠心病AS性疾病有很好的防治作用。但其是否能抑制血管外膜损伤所致血管内膜AS斑块形成及CD40表达?为此,刘永、汤月霞、梁春、吴宗贵等进行了一项动物试验。
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通心络抑制兔血管外膜损伤致内膜AS斑块形成及CD40表达的研究
方法
动物模型制备及动脉外膜损伤方法
研究者将16只雄性新西兰大白兔随机分为两组:对照组(n=8)以蒸馏水灌胃;通心络组(n=8)以通心络[(0.3 g/kg·d)]混悬液灌胃。
以3%戊巴比妥予以兔麻醉后固定,行颈前正中切口分离双侧颈总动脉约4 cm ;采用0.2%Ⅱ型胶原酶包绕浸渍左侧颈总动脉,浸渍30 min后钝性剥除血管外膜;右侧颈动脉不作外膜损伤。术后给以高脂饲料(含2%胆固醇,5%脂肪,余为普通饲料)喂养12周。
标本提取及病理学检测
于建模前及12周后,研究者经兔耳中心动脉采血5 ml,用全自动生化分析仪测血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;12周后在麻醉下活体状态取双侧颈总动脉,置入10%福尔马林中固定24小时,常规石腊包埋,4~6 μm 厚度连续切片;常规烤片、脱蜡、水化后进行HE染色,光镜下观察血管壁形态学变化,进行病理图像分析(BIOQUANT—TCW98),测量管腔面积以及内、外弹力板包绕面积。以内弹力板包绕面积减去管腔面积为内膜面积(I),以外弹力板包绕面积减去内弹力板包绕面积为中膜面积(M)。以I/M比值表示增生程度。
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动脉标本CD40表达检测
石蜡切片经干燥箱烤片2小时后,常规脱蜡至水,3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶20分钟,0.01M PBS洗涤,0.1 M枸橼酸盐缓冲液热抗原修复,0.01 M PBS洗涤,滴加正常山羊血清封闭20分钟。滴加一抗(CD40抗体),4℃过夜,0.01 M PBS洗涤后滴加生物素化偶联的二抗,37℃孵育20分钟,PBS洗涤3 分钟×3次后滴加辣根过氧化物酶偶联的链霉卵白素,37℃孵育20分钟,PBS洗涤5分钟×4次后滴加DAB室温显色。显微镜下控制显色时间约5~8分钟后蒸馏水洗涤,苏木素轻度复染,脱水,封片。以PBS液替代一抗为阴性对照。确定免疫阳性染色的域值,固定不变,检测CD40阳性染色的平均光密度(AOD),以阳性染色面积百分率代表CD40表达的相对含量。
统计学处理
采用SPSS-l0.0统计软件包进行统计学处理。所有资料均采用均数±标准差(X±s)表示,两组间比较采用t检验,双侧P <0.05为有统计学显著差异。
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结果
血生化指标(表1)
试验前两组动物的各项血生化指标比较均无显著差异(P>0.05);第12周末,通心络组的TC、LDL-C水平均显著低于对照组(P<0.05),TG无显著差异(P>0.05)。
病理形态观察及定量分析
光镜下对照组左侧动脉管腔明显变窄且大小不规则,内膜明显增厚,脂质斑块弥漫,内有大量泡沫细胞积聚,几乎覆盖于整个管腔表面,中膜平滑肌细胞排列紊乱。相比,右侧动脉内膜增厚及脂质斑块情况较轻。通心络组内膜增生相对较轻,斑块较小(图1~4)。定量分析显示,通心络组动脉内膜/中膜厚度比值小于对照组[(0.47±0.06)对(1.16±0.09),P<0.01]。
免疫组化检测结果
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通心络组和对照组均可见染成棕黄色的CD40阳性表达信号,通心络组信号强度明显较对照组弱(图5~8)。阳性表达信号主要存在于动脉粥样硬化斑块区,肩部表达更多。PBS代替CD40抗体对比试验结果呈阴性。信号强度结果分析提示,通心络组CD40信号强度显著低于对照组[(0.17±0.04) 对 (0.36±0.07),P<0.01]。
讨论
气血相关的络病理论认为,气作为络病理论的重要组成部分,可能涵盖了西医学神经内分泌免疫调节功能,提出“气络-NEI网络”具有高度相关性和内在一致性的观点。清代何梦瑶在《医碥·气》中所言:“气一耳,以其行于脉外,则曰卫气;行于脉中,则曰营气”,血管外膜的损伤可看作血管局部“卫气”受损, “气络-NEI网络” 调控失常。该研究发现,通心络可能是通过改善“气络-NEI网络”,而发挥其抗AS作用的。这从一个侧面反映了“气络-NEI网络”在络病理论“脉络-血管系统病”中的重要作用。
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CD40和CD40配体系统作为重要的炎症信号通路,是AS发病的关键环节,与斑块的发生和发展密切相关;阻断CD40-CD40配体系统可抑制炎症反应,从而减轻动脉粥样硬化病变。
在该研究中血管外膜损伤侧有明显的AS斑块形成,而对侧未损伤外膜的颈动脉未见AS病变形成。提示通心络超微粉可以明显抑制外膜损伤所致的AS斑块形成和CD40表达。提示通心络超微粉在降低血胆固醇水平和斑块局部CD40表达的同时,可以明显抑制因外膜损伤而致的AS斑块形成,推测通心络防治动脉粥样硬化的作用可能与其降低胆固醇水平、抑制CD40系统有关。
表1 试验前后两组动物的各项血生化指标比较(X±s)
组 别 通心络组 对照组
实验前(n=8) 12周后(n=8) 实验前(n=8) 12周后(n=8)
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TC (mmol/L) 1.24±0.05* 16.20±1.73** 1.19±0.04 34.27±2.14
LDL-C(mmol/L) 0.51±0.03* 7. 96±0.45** 0.53±0.03 19.34±0.98
TG (mmol/L) 1.22±0.05* 2.06±0.09* 1.25±0.06 2. 38±0.08
与相应对照组比较,*P >0.05;**P <0.01; TC:总胆固醇,TG:甘油三酯,LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇。
图1 对照组左侧颈动脉 HE染色×40
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图2 对照组右侧颈动脉 HE染色×40
图3 通心络组左侧颈动脉 HE染色 ×40
图4 通心络组右侧颈动脉 HE染色 ×40
图5 对照组左侧颈动脉 SP法DAB染色×100
图6 对照组右侧颈动脉 SP法DAB染色×100
图7 通心络组左侧颈动脉 DAB染色×100
图8 通心络组右侧颈动脉 DAB染色×100, 百拇医药