第17章 肿瘤的基因治疗 .doc
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第十七章肿瘤的基因治疗
基因治疗：即通过对人体遗传物质进行修正、补充或改造来达到治疗疾病的目的，或曰"以基因作为靶点的治疗"(gene-targeted theraphy)。也有人将其定义为"将遗传物质导人人体组织或细胞所进行的疾病的治疗"。这两种定义有所区别：前者强调以基因作为靶点，后者强调以基因作为手段。
第二节基因治疗的策略
* 离体(ex vivo)基因治疗：将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞、免疫细胞或其它细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内；
* 原位(in situ)基因治疗：中者是指目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部性基因治疗，这是目前应用最多的一种方法
* 体内(in vivo)基因治疗：将目的基因载体注射到血流系统进行全身性的基因治疗，尤其适用于免疫基因治疗。
* 基因治疗本质上也就是一个目的基因、载体与转染的问题。
* 分为：调节机体免疫系统；肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因
一、目的基因及其作用
根据作用机制可以将基因治疗的目的基因分为以下两大类：
(一) 调节机体免疫系统：
* 细胞因子的基因转染到机体免疫细胞(TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞)中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。
* 与免疫识别有关的基因(如HLA、B7等)转染至体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。
(二)肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因
* 抑癌基因治疗：对于肿瘤癌基因的过度活化，可以用反义核苷酸技术来进行阻断。对抑癌基因的失活，将野生型抑癌基因(如p53、p16、Rb等)转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能
* E1B缺陷的腺病毒基因治疗：利用肿瘤细胞和正常细胞中p53有无突变的差别，以E1B缺陷的腺病毒转染肿瘤组织，由于病毒的大量繁殖导致肿瘤细胞裂解死亡；而在有p53功能的正常细胞中，病毒繁殖力低下，毒性很小，从而达到选择性杀伤肿瘤细咆的目的。
* 抗血管生成基因治疗：利用重组逆转录病毒或腺病毒载体表达Angiostatin或Endostatin cDNA在体外可以抑制血管内皮细胞的生长。
* "自杀"基因基因治疗：单纯疱疹病毒胸腺咪啶激酶(HSV-TK)转染到肿瘤内，可将前体药物ACV、GCV转化为对细胞具有杀伤作用的代谢产物，特异杀伤肿瘤细胞。
* "修饰"基因治疗：利用基因技术对正常细胞进行修饰，将多药耐药基因(MDR)转染至肿瘤患者的造血干细胞，使其具有比肿瘤更强的化疗药物耐受力。
二、基因导入的方法
(一)物理/化学方法
* 裸露DNA直接注射
* 脂质体共转化：
* 受体介导的基因导入：模仿病毒感染细胞的机制，人工合成一些多肽-DNA复合物(oligoplexes)，或称之为合成病毒，使其具有病毒载体的优点，而没有病毒载体的缺点(d)。利用胞上配体的受体而摄入。
(二)病毒载体系统
* 逆转录病毒载体：
* 腺病毒载体：
三、反义核酸技术
* 反义核酸技术是其基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的RNA或DNA，以其影响靶基因的表达，抑制其功能。
* 利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达
* 体外人工合成反义寡聚核苷酸。实践中多用反义寡聚脱氧核苷酸(asODN)。
四、核酶
核酶除了剪切RNA的活性、底物的特异性外，它与RNA的互补结合，还可以起到反义核苷酸的作用(见前述)。所以，核酶可以设计来特异性地结合于作用靶点，并且以其本身的酶活性进行剪切。这些优势非常有利于利用核酶来破坏肿瘤细胞中固突变而高度表达的癌基因，如Ras、Myc等。
第三节肿瘤定向基因治疗与旁观者效应
一、给药途径
* 最多见的是向肿瘤组织直接注射，或者在超声或CT寻向下定位注射。
* 值得推荐的是：介入治疗为基础的基因治疗，即通过动脉插管将基因药物送到局部。
二、载体构建
* 某些病毒本身就有选择性感染人体组织的性能，如EB病毒对B淋巴细胞和鼻咽上皮细胞、乙型肝炎病毒对肝细胞等，为构建组织特异性病毒载体提供了便利。
* 利用肿瘤细胞表达的一些相对特异的受体来构建载体，也是定向基因治疗的一个手段
三、目的基因的调控
* 对目的基因的修饰，构建含有细胞特异性启动子序列的重组载体来调控目的基因只在肿瘤细胞中表达。这类启动子序列包括有AFP启动子(肝肿瘤细胞选择性)、PSA启动子(前列腺癌细胞选择性)、CEA启动子(大肠癌细胞选择性)和DF3/MUC-1启动子(乳腺癌细胞选择性)
* 将调控AFP表达的非编码区序列连接于要表达的目的基因(如p53、IL-2、TNF)前，就可以构建在肝癌细胞中特异表达的体系。构建含有AFP调控序列-HSV-TK基因的重组腺病毒，用以转染表达AFP的肝癌细胞株和不表达AFP的肝癌细胞株，再继以GCV处理。结果证明GCV只能杀灭表达AFP的细胞，而对不表达AFP的细胞无影响。
* 还可以借助肿瘤局部的放射线照射、局部热疗、肿瘤组织局部的缺氧、外来的诱导因素(如四环素)等来调控启动子的开与关。Egr-l启动子能够对放射线照射迅速反应，可以用来连接HSV-TK基因等，构建成病毒或质粒载体，在肿瘤局部给药后，再加以放射线外照射，启动目的基因的表达，与放射线一起协同杀伤肿瘤细胞。如以CD基因作为目的基因，由于CD基因产物能使5-FC转化为5-FU，而5-FU可以增强肿瘤细胞对放射线的敏感性，可以产生叠加效应；
四、旁观者效应
应用TK基因时观察到，即表达TK基因的肿瘤细胞周边的一些不表达TK基因的肿瘤组织也能对GCV作出反应而受到杀伤。
推测有以下可能：
① 细胞毒药物通过细胞与细胞间连接间桥被动扩散到相邻未转导细胞
② 细胞毒药物从转导细胞扩散到周围间隙，再杀伤邻近末转导细胞；
③ 未转导的肿瘤细胞受到邻近转导而死亡的肿瘤细胞发生的信号而引发凋亡
④ 其它未知的由免疫系统介导的机制。
第四节存在的问题与发展方向
* 组织和细胞选择性
* 高效率的载体
* 更富杀伤力的目的基因
* 如何与其它肿瘤治疗手段有机地结合起来，* 以及如何进行准确的疗效评价等。
第十七章肿瘤的基因治疗
基因治疗：即通过对人体遗传物质进行修正、补充或改造来达到治疗疾病的目的，或曰"以基因作为靶点的治疗"(gene-targeted theraphy)。也有人将其定义为"将遗传物质导人人体组织或细胞所进行的疾病的治疗"。这两种定义有所区别：前者强调以基因作为靶点，后者强调以基因作为手段。
第二节基因治疗的策略
* 离体(ex vivo)基因治疗：将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞、免疫细胞或其它细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内；
* 原位(in situ)基因治疗：中者是指目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部性基因治疗，这是目前应用最多的一种方法
* 体内(in vivo)基因治疗：将目的基因载体注射到血流系统进行全身性的基因治疗，尤其适用于免疫基因治疗。
* 基因治疗本质上也就是一个目的基因、载体与转染的问题。
* 分为：调节机体免疫系统；肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因
一、目的基因及其作用
根据作用机制可以将基因治疗的目的基因分为以下两大类：
(一) 调节机体免疫系统：
* 细胞因子的基因转染到机体免疫细胞(TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞)中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。
* 与免疫识别有关的基因(如HLA、B7等)转染至体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。
(二)肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因
* 抑癌基因治疗：对于肿瘤癌基因的过度活化，可以用反义核苷酸技术来进行阻断。对抑癌基因的失活，将野生型抑癌基因(如p53、p16、Rb等)转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能
* E1B缺陷的腺病毒基因治疗：利用肿瘤细胞和正常细胞中p53有无突变的差别，以E1B缺陷的腺病毒转染肿瘤组织，由于病毒的大量繁殖导致肿瘤细胞裂解死亡；而在有p53功能的正常细胞中，病毒繁殖力低下，毒性很小，从而达到选择性杀伤肿瘤细咆的目的。
* 抗血管生成基因治疗：利用重组逆转录病毒或腺病毒载体表达Angiostatin或Endostatin cDNA在体外可以抑制血管内皮细胞的生长。
* "自杀"基因基因治疗：单纯疱疹病毒胸腺咪啶激酶(HSV-TK)转染到肿瘤内，可将前体药物ACV、GCV转化为对细胞具有杀伤作用的代谢产物，特异杀伤肿瘤细胞。
* "修饰"基因治疗：利用基因技术对正常细胞进行修饰，将多药耐药基因(MDR)转染至肿瘤患者的造血干细胞，使其具有比肿瘤更强的化疗药物耐受力。
二、基因导入的方法
(一)物理/化学方法
* 裸露DNA直接注射
* 脂质体共转化：
* 受体介导的基因导入：模仿病毒感染细胞的机制，人工合成一些多肽-DNA复合物(oligoplexes)，或称之为合成病毒，使其具有病毒载体的优点，而没有病毒载体的缺点(d)。利用胞上配体的受体而摄入。
(二)病毒载体系统
* 逆转录病毒载体：
* 腺病毒载体：
三、反义核酸技术
* 反义核酸技术是其基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的RNA或DNA，以其影响靶基因的表达，抑制其功能。
* 利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达
* 体外人工合成反义寡聚核苷酸。实践中多用反义寡聚脱氧核苷酸(asODN)。
四、核酶
核酶除了剪切RNA的活性、底物的特异性外，它与RNA的互补结合，还可以起到反义核苷酸的作用(见前述)。所以，核酶可以设计来特异性地结合于作用靶点，并且以其本身的酶活性进行剪切。这些优势非常有利于利用核酶来破坏肿瘤细胞中固突变而高度表达的癌基因，如Ras、Myc等。
第三节肿瘤定向基因治疗与旁观者效应
一、给药途径
* 最多见的是向肿瘤组织直接注射，或者在超声或CT寻向下定位注射。
* 值得推荐的是：介入治疗为基础的基因治疗，即通过动脉插管将基因药物送到局部。
二、载体构建
* 某些病毒本身就有选择性感染人体组织的性能，如EB病毒对B淋巴细胞和鼻咽上皮细胞、乙型肝炎病毒对肝细胞等，为构建组织特异性病毒载体提供了便利。
* 利用肿瘤细胞表达的一些相对特异的受体来构建载体，也是定向基因治疗的一个手段
三、目的基因的调控
* 对目的基因的修饰，构建含有细胞特异性启动子序列的重组载体来调控目的基因只在肿瘤细胞中表达。这类启动子序列包括有AFP启动子(肝肿瘤细胞选择性)、PSA启动子(前列腺癌细胞选择性)、CEA启动子(大肠癌细胞选择性)和DF3/MUC-1启动子(乳腺癌细胞选择性)
* 将调控AFP表达的非编码区序列连接于要表达的目的基因(如p53、IL-2、TNF)前，就可以构建在肝癌细胞中特异表达的体系。构建含有AFP调控序列-HSV-TK基因的重组腺病毒，用以转染表达AFP的肝癌细胞株和不表达AFP的肝癌细胞株，再继以GCV处理。结果证明GCV只能杀灭表达AFP的细胞，而对不表达AFP的细胞无影响。
* 还可以借助肿瘤局部的放射线照射、局部热疗、肿瘤组织局部的缺氧、外来的诱导因素(如四环素)等来调控启动子的开与关。Egr-l启动子能够对放射线照射迅速反应，可以用来连接HSV-TK基因等，构建成病毒或质粒载体，在肿瘤局部给药后，再加以放射线外照射，启动目的基因的表达，与放射线一起协同杀伤肿瘤细胞。如以CD基因作为目的基因，由于CD基因产物能使5-FC转化为5-FU，而5-FU可以增强肿瘤细胞对放射线的敏感性，可以产生叠加效应；
四、旁观者效应
应用TK基因时观察到，即表达TK基因的肿瘤细胞周边的一些不表达TK基因的肿瘤组织也能对GCV作出反应而受到杀伤。
推测有以下可能：
① 细胞毒药物通过细胞与细胞间连接间桥被动扩散到相邻未转导细胞
② 细胞毒药物从转导细胞扩散到周围间隙，再杀伤邻近末转导细胞；
③ 未转导的肿瘤细胞受到邻近转导而死亡的肿瘤细胞发生的信号而引发凋亡
④ 其它未知的由免疫系统介导的机制。
第四节存在的问题与发展方向
* 组织和细胞选择性
* 高效率的载体
* 更富杀伤力的目的基因
* 如何与其它肿瘤治疗手段有机地结合起来，* 以及如何进行准确的疗效评价等。
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