创新发展络病学推进中医药国际化进程 络病理论指导血管病变防治研究取得系列重要进展——第三届国际络病学大会学术报告及系列研究报道(9-2)
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当前,对缺血性心脏病的治疗仍面临着重大挑战,治疗多集中于抑制心室重构及继发的心力衰竭,却无法促使已坏死的心肌再生,而坏死的心肌是心梗所致损伤的关键。近几年的突破性研究进展是细胞心肌成形术,它通过外部干预,如干细胞或心肌细胞移植,或者把末梢循环血干细胞或骨髓衍生的干细胞移植到心肌受损部位,帮助梗死心肌修复,对心肌梗死后的心室重构产生有益作用。
在细胞心肌成形术的备选细胞中,骨髓间充质干细胞(MSC)是研究的重点,因为其容易获取并具有可塑性,可在体外增殖,在体内、体外都能分化成不同类型的细胞和组织,包括内皮细胞、上皮细胞和心肌细胞。体外研究也表明,MSC具有诱导分化生成肌细胞的能力。
细胞心肌成形术对梗死后心脏产生有益作用的前提是植入的细胞能够在目标区存活,进而可能分化形成心肌和微血管,分泌细胞因子,从而逆转心室重构。心肌梗死后的机体内环境是供体细胞在体内能否存活的最重要因素。
通心络在运用骨髓间充质干细胞对梗死后猪模型心脏实施细胞心肌成形术中的促进作用(一)
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北京阜外心血管病医院尤士杰、杨跃进、赵京林、张健、段炼、钱海燕、张海涛等的试验研究目的是对急性心肌梗死(AMI)和再灌注损伤后的猪模型立即进行心肌内自体MSC注射,以观察植入细胞能否改善心肌功能和通心络能否通过促进活体内MSC的存活而有益于心肌功能的改善。
尤士杰等对28只10月龄中国猪(体重30 kg±5 kg)进行MSC分离、培养,制备心肌梗死模型,并将其平均分为4组:对照组(n=7,第1组),单一小剂量通心络干预治疗组(n=7,第2组),单一MSC移植干预治疗组(n=7,第3组)和同时进行MSC移植加通心络干预治疗组(n=7,第4组)。在再灌注后30分钟,于每只 试验动物的梗死区及其周边区注入含3×107个细胞的自体MSC悬浮液500 μl,给予对照组动物注入等体积的葡萄糖达尔贝科改良依格尔培养(DMEM)液。从实施MSC移植前3天至移植后4天使用通心络[0.05 g/(kg·d)]进行干预治疗,并通过多种手段了解通心络干预对MSC移植的影响。
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组织学分析
通心络减轻心肌组织纤维化和炎症细胞浸润 细胞移植6周后,他们采用苏木精伊红(HE)和马森(Masson)染色并电镜下观察炎症细胞浸润情况(图1)。结果显示,对照组和第2、3组心肌梗死部位严重纤维化并出现慢性炎症细胞浸润,心肌细胞存活很少。第4组纤维化和慢性炎症细胞浸润较轻,梗死区有心肌细胞存活。以上提示,通心络+MSC干预可显著减轻心肌组织纤维化和炎症细胞浸润,减小梗死面积。
通心络增强心脏梗死区移植MSC的存活能力 为测定体内移植MSC的存活和分化能力,他们采用荧光显微镜观察并计数对二脒基苯基吲哚(DAPI)和心脏肌钙蛋白T(cTn-T)呈阳性的细胞(为分化的类心肌细胞)。结果显示,第3组几乎观察不到DAPI标记的阳性细胞,第4组可见较多DAPI标记的阳性细胞,第4组DAPI标记的阳性细胞数显著多于第3组(P<0.0001)。以上提示,通心络+MSC干预组心脏梗死区的移植MSC细胞生存率显著高于单纯移植MSC组(P<0.0001)。
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通心络提高移植MSC的成心肌和微血管分化效率 为确定分化的心肌和生成的血管来源于植入的体内MSC,在移植6周后,他们检测了血管性假血友病因子(vWF)、α-平滑肌肌动蛋白(SM-actin)、α-横纹肌肌动蛋白、心脏肌钙蛋白T(cTn-T)、间隙连接蛋白43 (Cx43)抗体,并采用免疫荧光分析。结果显示,第3、4组DAPI标记的细胞对α-横纹肌肌动蛋白、心脏cTn-T表达呈阳性(图2 A、B),DAPI标记的细胞参与血管生成,并对SM-actin和vWF表达呈阳性(图2 C)。特别是第4组,植入的MSC分化为DAPI阳性染色心肌细胞的有效率,显著高于第3组(P<0.0001)。以上提示,通心络干预组部分植入的MSC已经分化成心肌和微血管,通心络+MSC组移植的MSC成心肌分化效率显著高于单纯移植MSC组(P<0.0001)。
通心络促进植入MSC细胞间联结通讯的建立 他们通过测定梗死部位Cx43的细胞间染色密度,研究了心肌梗死区DAPI标记的阳性细胞间的联结通讯(图3)。结果显示,第3、4组DAPI标记的细胞表达Cx43(图3A),第4组由Cx43实现的细胞间联结通讯显著优于第3组(P<0.0001,图3B)。以上提示,通心络干预组心肌梗死区DAPI标记的阳性细胞间联结通讯已经建立,且通心络+MSC组的联结通讯显著优于单纯移植MSC组(P<0.0001)。
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通心络增加毛细血管密度 为测定梗死心肌及周边区的毛细血管密度,他们根据组织切片vWF抗体的免疫组化染色计数每个高倍视野下阳性染色的毛细血管。结果显示,移植6周后,与对照组比较,第2、3组梗死区毛细血管密度无显著差异(P>0.05);与第3组比较,第4组梗死区毛细血管密度增加了105%,梗死周边区毛细血管密度为(8.9±1.9)/HPF,显著大于其他3组(P<0.0001)。以上提示,通心络+MSC干预可显著增加梗死心肌及周边区的毛细血管密度。(未完待续)
图1 各组梗死区炎症细胞浸润电镜图像(HE和Masson染色,A:400×,B:40×)
图2 心脏梗死区移植的MSC分化为心肌和血管的免疫荧光图像(400×)
图3 活体内植入的MSC细胞间联结通讯的免疫荧光图像(400×), 百拇医药