特发性血小板减少性紫癜发病机制与治疗进展 .doc
http://www.100md.com
参见附件(273KB)。
特发性血小板减少性紫癜发病机制与治疗进展
侯明
(山东大学齐鲁医院 血液科)
特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)是临床最常见的出血性疾病，约占出血性疾病总数的30%。一般认为ITP的发生是自身抗体致敏的血小板被单核-巨噬细胞系统过度破坏所致。ITP的治疗以糖皮质激素、IVIg、脾切除等非特异性手段为主，旨在减少单核巨噬细胞系统对血小板的破坏，约1/3的患者上述治疗无效，成为难治性ITP。新近研究显示，除体液免疫机制外，在ITP发病中细胞免疫机制亦起重要作用。部分患者还表现巨核细胞成熟障碍和血小板生成异常。对ITP自身免疫发病机制的深入研究令许多新的定向免疫干预措施进入临床研究阶段，本文就ITP的发病机制及针对发病机制的治疗进展作一概述。
ITP发病机制进展
一、 对自身血小板免疫耐受的丢失
一般情况下机体对自身抗原有耐受性。T细胞耐受有两种假说，一是中心耐受，即在胸腺中对自身抗原有高亲和力的T细胞被克隆剔除；二是外周耐受，即在胸腺外自身反应性T细胞在特异性或非特异性机制下被剔除或失能。中心耐受机制并不完善，一些释放到外周的T细胞仍具有潜在的自身反应性，这就需要外周机制加以抑制。剔除这些自身反应性T细胞无疑是建立免疫耐受的最终过程。然而，克隆剔除却可能使针对外来抗原的T细胞库缩小。因此为了获得免疫耐受，机体采纳了多种机制，包括免疫忽视(immune ignorance)、自身抗原的隔离、调节性细胞和(或)抗独特型抗体的抑制作用等。Schwartz等[1]报道，在健康成年个体的外周免疫器官中可发现自身反应性T细胞，其是正常组织修复的需要，是一种正常免疫的表现。然而大量研究证实，自身免疫性疾病存在免疫反应失调。据报道，针对于血小板GPIIb/IIIa的自身反应性T细胞逃离了胸腺内的选择，正常存在于外周并且保持耐受状态。ITP时外周血循环中可出现CD4+CD8+T细胞[2]，这是一群逃离了阴性选择的自身反应性T细胞，在正常情况下处于无能(anergy)状态，在发病时被激活，参与自身抗体的产生。Shenoy等[3]发现，ITP患者T细胞对于Fas介导的细胞凋亡具有抵抗作用，这可能支持自身反应性克隆的解释。免疫失耐受状态在ITP发病的作用正逐渐被认识。
(一) ITP患者T、B细胞的(寡)克隆性增生
90年代初，Semple等[4]发现将ITP患者T淋巴细胞与血小板体外共同培养后，T淋巴细胞出现针对血小板抗原的活化增殖反应。1993年，Ware等[5]在研究儿童ITP外周血T淋巴细胞的表型和克隆性时，发现部分CITP患者的T细胞中TCRβ链可变区片段存在限制性取用，携带Vβ8的克隆增加，并分离出了8个与血小板反应的T细胞克隆，进而提出了ITP中T细胞存在(寡)克隆性扩增，识别血小板抗原，诱导B淋巴细胞产生抗血小板抗体。1996年，Shimomura等[6]应用单链构象多态性(SSCP)方法，分析了ITP患者T细胞TcRβ链，发现存在明显的(寡)克隆性。2001年，Kuwana等[7]发现在ITP发病初期T细胞针对GPⅡb/III a上的多个表位发生反应，产生多克隆增殖，随着病程进展只有那些识别免疫优势表位的致病性T细胞克隆选择性扩增，并且将GPIIb/IIIa上免疫优势表位定位于含有Ca2+和Arg-Gly-Asp结合位点的两个非常局限的区域：GPⅡba18-259和ma22-262。最近，Fogarty等[8]对一批CITP患者外周血T细胞TCRV进行检测，发现切脾治疗无效患者体内TCRBV3和TCRBV15基因家族的T细胞克隆增生最明显。国内李扬秋等[9]在5例慢性ITP患者也发现了T细胞克隆性增殖。朱霞等[10]分析了ITP患者TCRBV CDR3基因，发现CITP呈T细胞寡克隆增生；并且发现不同患者增殖的T细胞寡克隆群有同样的编码基因，这些T细胞寡克隆的TCRBVCDR3主要共用三种模体，即具有相同的识别致病抗原的序列。
van der Harst等[11]用流式细胞术和Southern杂交分析来自于ITP患者外周血和脾脏的B细胞及其免疫球蛋白重链和轻链基因重排，发现11例ITP患者中10例存在克隆性B细胞群。Christie等[12]应用血小板抗体轻链分析、流式细胞术、Southern杂交及PCR技术研究了自身免疫性、异体免疫性及药物诱导的免疫性血小板减少症患者的轻链表型及免疫球蛋白基因重排，发现血小板抗体在轻链表型上经常是限制性的。Stockelberg等[13]对16例含有抗GPⅡb/Ⅲa抗体的慢性ITP患者进行了分析，发现12例患者的抗体表现了轻链限制性，但并未发现克隆性B细胞群。McMillan等[14]研究发现，在ITP患者自然出现的抗GPⅡb/Ⅲa抗体在轻链表型上呈克隆限制性，并且源自噬菌体显示库的抗体的VH 基因高度受约束。Roark等[15]对这些抗体的抗原结合区进行序列分析发现，在ITP自身抗原通过诱导亲和力选择和体细胞突变，激活有限数目的B细胞克隆增殖。我们的研究发现[16]，43例患者中16例(38)血清中至少存在一种抗血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPIb、GP I a、GPIV、GP V)IgG抗体。73 (8/l1)的血清糖蛋白特异性自身抗体表现重链限制性，仅表达一种重链亚型；80(16/20)的糖蛋白特异性抗体仅表达一种轻链表型；6例患者的糖蛋白特异性抗体既表现为轻链限制性又表现为重链限制性；用PCR分析外周血淋巴细胞免疫球蛋白重链基因重排，发现3例患者存在克隆性B细胞增殖。
ITP中自身抗体的克隆限制性反应了相应GP上存在的自身抗原表位的数量是有限的。一些研究发现，在GPⅡb、GPⅢa和GPIb的某些特定区域上存在自身抗原表位，并识别局限的独特型库；McMillan等[17]发现CITP中血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的独特型库非常局限，这些发现与ITP中抗血小板抗体的克隆限制性假说一致，提示抗体是单克隆或寡克隆起源。
(二) T细胞凋亡异常
研究表明，自身免疫性疾病是由于胸腺的阴性选择存在凋亡异常，不能清除具有潜在致病作用的自身反应性T细胞。ITP患者外周血激活的淋巴细胞增多，细胞凋亡不足与疾病的发生有关。FasL，TNFa和TRAIL都是TNF超家族的成员，与相应的受体结合诱导细胞调亡，Fas/FasL在细胞凋亡中起关键作用。
Shenoy等[3]提出，Fas信号转导途径改变与血液系统自身免疫病的发生有关。Olsson等[18]发现，在慢性ITP患者Fas、IFN-γ和IL-2Rβ表达增高；最近同一研究小组[19]对ITP患者和健康对照的CD3T淋巴细胞的基因芯片分析发现，其凋亡相关基因，如bax、A20、caspase-8、NFKBIA、calpastafin、PS0-NF-KB、TANK、caspase-1和TRADD的表达有改变。这些基因涉及到凋亡的诸多不同途径，T细胞提示凋亡途径改变。ITP患者与健康对照比较，其CD3+T细胞对于地塞米松诱导的抑制作用具有更明显的抵抗作用；与活动期ITP和健康对照比较，缓解期ITP的CD3+T细胞在不管有无地塞米松时均表现出更易于凋亡的倾向 。活动期ITP激活的T细胞的凋亡抵抗，可能导致了机体不能通过激活诱导的细胞死亡途径(AICD)清除自身反应性T淋巴细胞，导致血小板持续性免疫破坏。相反，缓解期ITP的T细胞失去了这种凋亡抵抗的特性，从而可能使疾病得以缓解。改变这种AICD抵抗可能诱导疾病缓解。最近Wu等[20]发现，儿童ITP活动期患者蛋白激酶C(PKC)活性明显增强，同时CD3+T，CD4+T和CD8+T细胞的FasL表达增加，两者呈正相关。他们认为PKC活性增强抑制了T细胞的凋亡，在ITP的免疫发病机制中起重要作用。Yoshimura等[21]研究发现ITP患者血清中sFas水平明显高于正常人，且其活化的CD8+T细胞比例显著升高，提示高浓度的sFas抑制了免疫细胞发生Fas/FasL途径介导的AICD，致使激活的T、B淋巴细胞大量积累于体内，导致体液和细胞免疫功能紊乱，血小板持续破坏。
(三) T亚群及其功能改变
1.Th1/Th2细胞亚群平衡失调：虽然血小板的破坏是由抗体介导，但现在已有充分的证据表明，抗体的产生有赖于T细胞及其分泌的细胞因子的作用。目前的研究资料表明，Thl/Th2细胞的平衡在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用，也发现其平衡失调与ITP的发生发展有关。大量研究报道[22]ITP具有Th0/Thl极化性，而有些报道则与之不相一致[23]或者相反[24]。有研究证实[25]，ITP中存在激活的血小板特异性自身反应性T细胞，它能识别并对自身抗原而产生应答，促使B淋巴细胞产生抗血小板自身抗体。目前认为，调整Thl/Th2细胞因子平衡网络是治疗自身免疫病的一种新方法。Stasi R等[59]发现，ITP患者Th1/Th2、Tc1/Tc2比率升高，Th细胞群Bcl-2 mRNA表达增加、Bax mRNA表达下降，美罗华B细胞清除治疗有效患者，上述异常的到纠正，故T亚群平衡失调与B细胞增殖、分泌抗体密切相关。
2.调节性T细胞：调节性T细胞可分为CD4+CD25+Treg细胞、Tregl和Th3等多种亚型，具有免疫抑制功能。CD4+CD25+Treg细胞主要通过直接接触抑制T细胞的活化与增殖；Tregl和Th3则主要通过分泌TGF-B发挥免疫调节作用。CD4+CD25+Treg细胞对外周免疫耐受的维持起重要作用，研究发现[26]，ITP患者发病时CD4+CD25+Treg细胞比例明显减低，治疗好转后显著增加。Yu J等[27]研究发现：ITP患者循环血CD4+CD25(hi)Foxp3+ Treg细胞与正常人相当，但接触抑制试验证实ITP患者CD4+CD25(hi) Treg细胞免疫抑制功能较正常人降低2倍，故Treg细胞功能缺陷是导致ITP患者免疫失耐受的重要原因之一。Andersson等[23]发现，慢性ITP缓解期TGF-β显著升高，认为TGF-β在疾病缓解期可起旁路免疫抑制效应。口服诱导耐受，增加体内的TGF-β可能是一种新的免疫抑制疗法。我们最近的研究发现：利用TGF-β可以体外成功诱导ITP患者GP特异性Treg细胞，该调节性T细胞可以显著抑制ITP患者GP反应性T细胞的增殖，诱导GP特异性免疫耐受。GP特异性Treg细胞发挥抑制效应需要细胞-细胞接触而不依赖于抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β1，且免疫抑制效应具有抗原特异性，为非组成性的，它需要抗原的不断刺激。GP特异性Treg细胞还可诱导ITP患者DCs致耐受性，并通过致耐受性DCs进一步发挥其诱导免疫耐受的效应，免疫相关基因如TLR8、FasL、TGFBR3、DLL1、JAG2、TLR8、IL-1β、MyD88、IFNGR1、IFNGR2、等可能通过TLR、Notch、IFN-γ信号通路参与了GP特异性调节性T细胞诱导免疫耐受的过程(待发表)。
3.天然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)：既往曾有报道慢性ITP患者的NK细胞计数增高或者正常，而活性降低，其活性降低的原因不明，而且也无法断定是原发性还是继发性，但是可以肯定会影响自身免疫的状态和血小板的破坏。NK细胞可通过抑制抗体生成而调节B细胞的功能，因此可以推断，NK细胞活性降低可导致B细胞活性增强而最终导致自身免疫性疾病的发生。最近Johansson等[28]研究了近年发现的NKT细胞，发现激活的NKT细胞能够抑制ITP的自身免疫反应。
4.T淋巴细胞功能改变：上个世纪70年代初Clancy[29]发现ITP患者的血小板与淋巴细胞共同孵育后淋巴细胞的游走功能降低，由此证明游走抑制因子(migration inhibition factot，MIF)的产生，而MIF的产生是表明发生了细胞免疫的有力佐证。Semple等[30]的研究表明，在体外将ITP患者的T淋巴细胞与血小板共同培养后，T淋巴细胞出现针对血小板抗原的活化增殖反应。Kuwana等[25]首次证明，ITP患者T细胞的活化必须接触由抗原呈递细胞加工处理后的血小板GP1Ib/IIIa抗原肽，而不是原始抗原，并认为主要由血小板GP 1I b/IIIa氨基末端促进自身反应性Th细胞的激活与自身抗体的生成。相反，检测白种人慢性ITP患者Th细胞克隆的特异性时发现，GP111aN端496-510多肽足以刺激T细胞分泌IL-2。这种明显不同的结果可能反映不同种族间T细胞反应的异质性。更重要的是，T细胞反应表位在整个血小板GPIIb/llIa分子上出现。上述结果奠定了涉及自身反应性T细胞抗原特异性疗法的基础(如修饰抑制性MHC结合多肽以抑制Th细胞)。
(四) 抗原特异性T细胞免疫失耐受
Semple等[29]发现ITP患者血小板CD80分子的表达明显增加，提示B7/CD28共刺激信号在ITP的发病中可能起重要作用。Nagahama等[31]发现在65例ITP病人中有38例血浆可溶性CDl54(sCD4OL)水平明显升高，治疗后水平回落，而且sCD40L阳性者血小板计数明显降低。阻断共刺激信号的传递可以抑制自身反应性T细胞的活化，减少自身抗体的产生，这已成为当前研究治疗ITP尤其是难治性ITP的新途径。2003年我们的体外试验表明[32]，在慢性ITP中阻断共刺激信号能够诱导血小板抗原特异性T细胞免疫耐受，并证明其耐受机制为T细胞免疫无能，提示抗原特异性T细胞免疫失耐受亦是ITP免疫发病机制的重要方面。我们新近研究发现[33]：阻断共刺激信号后诱导出的血小板抗原特异性无能T细胞不但可以显著抑制ITP患者GP反应性T细胞的增殖，还可以诱导ITP患者DCs致耐受性并通过致耐受性DCs进一步发挥其诱导免疫耐受的效应，并能显著抑制抗血小板抗体的分泌。接下来我们采用DNA微阵列分析比较了ITP患者血小板抗原特异性无能T细胞、无能T细胞诱导的耐受性DC及活化T细胞的相关基因表达谱，进一步明确了ITP患者抗原特异性T细胞免疫失耐受的分子机制，有望为ITP的治疗提供新的干预靶点(待发表)。
二、 自身抗体介导的血小板破坏增多......（后略) ......
特发性血小板减少性紫癜发病机制与治疗进展
侯明
(山东大学齐鲁医院 血液科)
特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)是临床最常见的出血性疾病，约占出血性疾病总数的30%。一般认为ITP的发生是自身抗体致敏的血小板被单核-巨噬细胞系统过度破坏所致。ITP的治疗以糖皮质激素、IVIg、脾切除等非特异性手段为主，旨在减少单核巨噬细胞系统对血小板的破坏，约1/3的患者上述治疗无效，成为难治性ITP。新近研究显示，除体液免疫机制外，在ITP发病中细胞免疫机制亦起重要作用。部分患者还表现巨核细胞成熟障碍和血小板生成异常。对ITP自身免疫发病机制的深入研究令许多新的定向免疫干预措施进入临床研究阶段，本文就ITP的发病机制及针对发病机制的治疗进展作一概述。
ITP发病机制进展
一、 对自身血小板免疫耐受的丢失
一般情况下机体对自身抗原有耐受性。T细胞耐受有两种假说，一是中心耐受，即在胸腺中对自身抗原有高亲和力的T细胞被克隆剔除；二是外周耐受，即在胸腺外自身反应性T细胞在特异性或非特异性机制下被剔除或失能。中心耐受机制并不完善，一些释放到外周的T细胞仍具有潜在的自身反应性，这就需要外周机制加以抑制。剔除这些自身反应性T细胞无疑是建立免疫耐受的最终过程。然而，克隆剔除却可能使针对外来抗原的T细胞库缩小。因此为了获得免疫耐受，机体采纳了多种机制，包括免疫忽视(immune ignorance)、自身抗原的隔离、调节性细胞和(或)抗独特型抗体的抑制作用等。Schwartz等[1]报道，在健康成年个体的外周免疫器官中可发现自身反应性T细胞，其是正常组织修复的需要，是一种正常免疫的表现。然而大量研究证实，自身免疫性疾病存在免疫反应失调。据报道，针对于血小板GPIIb/IIIa的自身反应性T细胞逃离了胸腺内的选择，正常存在于外周并且保持耐受状态。ITP时外周血循环中可出现CD4+CD8+T细胞[2]，这是一群逃离了阴性选择的自身反应性T细胞，在正常情况下处于无能(anergy)状态，在发病时被激活，参与自身抗体的产生。Shenoy等[3]发现，ITP患者T细胞对于Fas介导的细胞凋亡具有抵抗作用，这可能支持自身反应性克隆的解释。免疫失耐受状态在ITP发病的作用正逐渐被认识。
(一) ITP患者T、B细胞的(寡)克隆性增生
90年代初，Semple等[4]发现将ITP患者T淋巴细胞与血小板体外共同培养后，T淋巴细胞出现针对血小板抗原的活化增殖反应。1993年，Ware等[5]在研究儿童ITP外周血T淋巴细胞的表型和克隆性时，发现部分CITP患者的T细胞中TCRβ链可变区片段存在限制性取用，携带Vβ8的克隆增加，并分离出了8个与血小板反应的T细胞克隆，进而提出了ITP中T细胞存在(寡)克隆性扩增，识别血小板抗原，诱导B淋巴细胞产生抗血小板抗体。1996年，Shimomura等[6]应用单链构象多态性(SSCP)方法，分析了ITP患者T细胞TcRβ链，发现存在明显的(寡)克隆性。2001年，Kuwana等[7]发现在ITP发病初期T细胞针对GPⅡb/III a上的多个表位发生反应，产生多克隆增殖，随着病程进展只有那些识别免疫优势表位的致病性T细胞克隆选择性扩增，并且将GPIIb/IIIa上免疫优势表位定位于含有Ca2+和Arg-Gly-Asp结合位点的两个非常局限的区域：GPⅡba18-259和ma22-262。最近，Fogarty等[8]对一批CITP患者外周血T细胞TCRV进行检测，发现切脾治疗无效患者体内TCRBV3和TCRBV15基因家族的T细胞克隆增生最明显。国内李扬秋等[9]在5例慢性ITP患者也发现了T细胞克隆性增殖。朱霞等[10]分析了ITP患者TCRBV CDR3基因，发现CITP呈T细胞寡克隆增生；并且发现不同患者增殖的T细胞寡克隆群有同样的编码基因，这些T细胞寡克隆的TCRBVCDR3主要共用三种模体，即具有相同的识别致病抗原的序列。
van der Harst等[11]用流式细胞术和Southern杂交分析来自于ITP患者外周血和脾脏的B细胞及其免疫球蛋白重链和轻链基因重排，发现11例ITP患者中10例存在克隆性B细胞群。Christie等[12]应用血小板抗体轻链分析、流式细胞术、Southern杂交及PCR技术研究了自身免疫性、异体免疫性及药物诱导的免疫性血小板减少症患者的轻链表型及免疫球蛋白基因重排，发现血小板抗体在轻链表型上经常是限制性的。Stockelberg等[13]对16例含有抗GPⅡb/Ⅲa抗体的慢性ITP患者进行了分析，发现12例患者的抗体表现了轻链限制性，但并未发现克隆性B细胞群。McMillan等[14]研究发现，在ITP患者自然出现的抗GPⅡb/Ⅲa抗体在轻链表型上呈克隆限制性，并且源自噬菌体显示库的抗体的VH 基因高度受约束。Roark等[15]对这些抗体的抗原结合区进行序列分析发现，在ITP自身抗原通过诱导亲和力选择和体细胞突变，激活有限数目的B细胞克隆增殖。我们的研究发现[16]，43例患者中16例(38)血清中至少存在一种抗血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPIb、GP I a、GPIV、GP V)IgG抗体。73 (8/l1)的血清糖蛋白特异性自身抗体表现重链限制性，仅表达一种重链亚型；80(16/20)的糖蛋白特异性抗体仅表达一种轻链表型；6例患者的糖蛋白特异性抗体既表现为轻链限制性又表现为重链限制性；用PCR分析外周血淋巴细胞免疫球蛋白重链基因重排，发现3例患者存在克隆性B细胞增殖。
ITP中自身抗体的克隆限制性反应了相应GP上存在的自身抗原表位的数量是有限的。一些研究发现，在GPⅡb、GPⅢa和GPIb的某些特定区域上存在自身抗原表位，并识别局限的独特型库；McMillan等[17]发现CITP中血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的独特型库非常局限，这些发现与ITP中抗血小板抗体的克隆限制性假说一致，提示抗体是单克隆或寡克隆起源。
(二) T细胞凋亡异常
研究表明，自身免疫性疾病是由于胸腺的阴性选择存在凋亡异常，不能清除具有潜在致病作用的自身反应性T细胞。ITP患者外周血激活的淋巴细胞增多，细胞凋亡不足与疾病的发生有关。FasL，TNFa和TRAIL都是TNF超家族的成员，与相应的受体结合诱导细胞调亡，Fas/FasL在细胞凋亡中起关键作用。
Shenoy等[3]提出，Fas信号转导途径改变与血液系统自身免疫病的发生有关。Olsson等[18]发现，在慢性ITP患者Fas、IFN-γ和IL-2Rβ表达增高；最近同一研究小组[19]对ITP患者和健康对照的CD3T淋巴细胞的基因芯片分析发现，其凋亡相关基因，如bax、A20、caspase-8、NFKBIA、calpastafin、PS0-NF-KB、TANK、caspase-1和TRADD的表达有改变。这些基因涉及到凋亡的诸多不同途径，T细胞提示凋亡途径改变。ITP患者与健康对照比较，其CD3+T细胞对于地塞米松诱导的抑制作用具有更明显的抵抗作用；与活动期ITP和健康对照比较，缓解期ITP的CD3+T细胞在不管有无地塞米松时均表现出更易于凋亡的倾向 。活动期ITP激活的T细胞的凋亡抵抗，可能导致了机体不能通过激活诱导的细胞死亡途径(AICD)清除自身反应性T淋巴细胞，导致血小板持续性免疫破坏。相反，缓解期ITP的T细胞失去了这种凋亡抵抗的特性，从而可能使疾病得以缓解。改变这种AICD抵抗可能诱导疾病缓解。最近Wu等[20]发现，儿童ITP活动期患者蛋白激酶C(PKC)活性明显增强，同时CD3+T，CD4+T和CD8+T细胞的FasL表达增加，两者呈正相关。他们认为PKC活性增强抑制了T细胞的凋亡，在ITP的免疫发病机制中起重要作用。Yoshimura等[21]研究发现ITP患者血清中sFas水平明显高于正常人，且其活化的CD8+T细胞比例显著升高，提示高浓度的sFas抑制了免疫细胞发生Fas/FasL途径介导的AICD，致使激活的T、B淋巴细胞大量积累于体内，导致体液和细胞免疫功能紊乱，血小板持续破坏。
(三) T亚群及其功能改变
1.Th1/Th2细胞亚群平衡失调：虽然血小板的破坏是由抗体介导，但现在已有充分的证据表明，抗体的产生有赖于T细胞及其分泌的细胞因子的作用。目前的研究资料表明，Thl/Th2细胞的平衡在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用，也发现其平衡失调与ITP的发生发展有关。大量研究报道[22]ITP具有Th0/Thl极化性，而有些报道则与之不相一致[23]或者相反[24]。有研究证实[25]，ITP中存在激活的血小板特异性自身反应性T细胞，它能识别并对自身抗原而产生应答，促使B淋巴细胞产生抗血小板自身抗体。目前认为，调整Thl/Th2细胞因子平衡网络是治疗自身免疫病的一种新方法。Stasi R等[59]发现，ITP患者Th1/Th2、Tc1/Tc2比率升高，Th细胞群Bcl-2 mRNA表达增加、Bax mRNA表达下降，美罗华B细胞清除治疗有效患者，上述异常的到纠正，故T亚群平衡失调与B细胞增殖、分泌抗体密切相关。
2.调节性T细胞：调节性T细胞可分为CD4+CD25+Treg细胞、Tregl和Th3等多种亚型，具有免疫抑制功能。CD4+CD25+Treg细胞主要通过直接接触抑制T细胞的活化与增殖；Tregl和Th3则主要通过分泌TGF-B发挥免疫调节作用。CD4+CD25+Treg细胞对外周免疫耐受的维持起重要作用，研究发现[26]，ITP患者发病时CD4+CD25+Treg细胞比例明显减低，治疗好转后显著增加。Yu J等[27]研究发现：ITP患者循环血CD4+CD25(hi)Foxp3+ Treg细胞与正常人相当，但接触抑制试验证实ITP患者CD4+CD25(hi) Treg细胞免疫抑制功能较正常人降低2倍，故Treg细胞功能缺陷是导致ITP患者免疫失耐受的重要原因之一。Andersson等[23]发现，慢性ITP缓解期TGF-β显著升高，认为TGF-β在疾病缓解期可起旁路免疫抑制效应。口服诱导耐受，增加体内的TGF-β可能是一种新的免疫抑制疗法。我们最近的研究发现：利用TGF-β可以体外成功诱导ITP患者GP特异性Treg细胞，该调节性T细胞可以显著抑制ITP患者GP反应性T细胞的增殖，诱导GP特异性免疫耐受。GP特异性Treg细胞发挥抑制效应需要细胞-细胞接触而不依赖于抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β1，且免疫抑制效应具有抗原特异性，为非组成性的，它需要抗原的不断刺激。GP特异性Treg细胞还可诱导ITP患者DCs致耐受性，并通过致耐受性DCs进一步发挥其诱导免疫耐受的效应，免疫相关基因如TLR8、FasL、TGFBR3、DLL1、JAG2、TLR8、IL-1β、MyD88、IFNGR1、IFNGR2、等可能通过TLR、Notch、IFN-γ信号通路参与了GP特异性调节性T细胞诱导免疫耐受的过程(待发表)。
3.天然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)：既往曾有报道慢性ITP患者的NK细胞计数增高或者正常，而活性降低，其活性降低的原因不明，而且也无法断定是原发性还是继发性，但是可以肯定会影响自身免疫的状态和血小板的破坏。NK细胞可通过抑制抗体生成而调节B细胞的功能，因此可以推断，NK细胞活性降低可导致B细胞活性增强而最终导致自身免疫性疾病的发生。最近Johansson等[28]研究了近年发现的NKT细胞，发现激活的NKT细胞能够抑制ITP的自身免疫反应。
4.T淋巴细胞功能改变：上个世纪70年代初Clancy[29]发现ITP患者的血小板与淋巴细胞共同孵育后淋巴细胞的游走功能降低，由此证明游走抑制因子(migration inhibition factot，MIF)的产生，而MIF的产生是表明发生了细胞免疫的有力佐证。Semple等[30]的研究表明，在体外将ITP患者的T淋巴细胞与血小板共同培养后，T淋巴细胞出现针对血小板抗原的活化增殖反应。Kuwana等[25]首次证明，ITP患者T细胞的活化必须接触由抗原呈递细胞加工处理后的血小板GP1Ib/IIIa抗原肽，而不是原始抗原，并认为主要由血小板GP 1I b/IIIa氨基末端促进自身反应性Th细胞的激活与自身抗体的生成。相反，检测白种人慢性ITP患者Th细胞克隆的特异性时发现，GP111aN端496-510多肽足以刺激T细胞分泌IL-2。这种明显不同的结果可能反映不同种族间T细胞反应的异质性。更重要的是，T细胞反应表位在整个血小板GPIIb/llIa分子上出现。上述结果奠定了涉及自身反应性T细胞抗原特异性疗法的基础(如修饰抑制性MHC结合多肽以抑制Th细胞)。
(四) 抗原特异性T细胞免疫失耐受
Semple等[29]发现ITP患者血小板CD80分子的表达明显增加，提示B7/CD28共刺激信号在ITP的发病中可能起重要作用。Nagahama等[31]发现在65例ITP病人中有38例血浆可溶性CDl54(sCD4OL)水平明显升高，治疗后水平回落，而且sCD40L阳性者血小板计数明显降低。阻断共刺激信号的传递可以抑制自身反应性T细胞的活化，减少自身抗体的产生，这已成为当前研究治疗ITP尤其是难治性ITP的新途径。2003年我们的体外试验表明[32]，在慢性ITP中阻断共刺激信号能够诱导血小板抗原特异性T细胞免疫耐受，并证明其耐受机制为T细胞免疫无能，提示抗原特异性T细胞免疫失耐受亦是ITP免疫发病机制的重要方面。我们新近研究发现[33]：阻断共刺激信号后诱导出的血小板抗原特异性无能T细胞不但可以显著抑制ITP患者GP反应性T细胞的增殖，还可以诱导ITP患者DCs致耐受性并通过致耐受性DCs进一步发挥其诱导免疫耐受的效应，并能显著抑制抗血小板抗体的分泌。接下来我们采用DNA微阵列分析比较了ITP患者血小板抗原特异性无能T细胞、无能T细胞诱导的耐受性DC及活化T细胞的相关基因表达谱，进一步明确了ITP患者抗原特异性T细胞免疫失耐受的分子机制，有望为ITP的治疗提供新的干预靶点(待发表)。
二、 自身抗体介导的血小板破坏增多......（后略) ......