动物细胞培养(中山大学实验动物中心).ppt
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动物细胞培养
中山大学实验动物中心
前 言
* 1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。
* 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。
* 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系(Gey，1952)，可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。
组织培养中热门的研究领域
1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；
2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；
3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；
4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。
组织培养的分类及基本概念
分类:
1.组织培养(Tissue Culture) 指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
2.细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。
3.器官培养(Organ Culture) 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
组织培养的细胞生物学特点:
1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖(Atavism)现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。
2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。
培养细胞的分化
细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。
* 不适应(Deadaption)
细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。
* 脱分化(去分化)(Dedifferentiation)
由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。
* 不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。
培养细胞的形态
1.贴附型：
1)成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等
2)上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等
3)游走型细胞：神经胶质细胞
4)多形型细胞：神经组织细胞
2.悬浮型：如癌细胞
培养细胞的生长和增殖
1.原代培养(Primary Culture)阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w
2.传代培养(Subculture)阶段：或称继代培养。也就是细胞系(Cell line)阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代)。
3.衰退阶段：
自发性转化(Spontaneous Transformation)：其标志是获得永生性(Immortality)或恶性性(Malignancy): 细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)。
如：BHK(仓鼠肾成纤维细胞)，F9(小鼠胚胎癌细胞)，M2R(黑色素瘤细胞)等。
培养细胞的传代培养
* 当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。
* 所谓细胞"一代"，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。
细胞传代的三个阶段
1)潜伏期(Latent phase)：
细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。
二倍体细胞该期时间长(24~96h)；
连续细胞系时间短(10~30min)。
2) 指数生长期(Logarthmic growth phase)：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数(Mitotic index，MI)表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。
* 指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制(Contact inhibition)。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。
* 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制(Density inhibition)
3)停滞期(Stagnate phase)：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞培养的基本条件
1)仪器和设备:
常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；
培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。
2)培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。
细胞培养的基本条件
3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。
由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。
细胞培养的基本条件
4)平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸监度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
常用的有PBS，Hank's等。
5)抗生素:常用为青霉素(每毫升培养液50~100单位)和链霉素(每毫升培养液50~100微克)。
6)其它添加成分：
缓冲系统，常用为HEPES(N'-2-hydroxy-ethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid) ......
动物细胞培养
中山大学实验动物中心
前 言
* 1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。
* 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。
* 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系(Gey，1952)，可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。
组织培养中热门的研究领域
1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；
2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；
3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；
4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。
组织培养的分类及基本概念
分类:
1.组织培养(Tissue Culture) 指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
2.细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。
3.器官培养(Organ Culture) 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
组织培养的细胞生物学特点:
1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖(Atavism)现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。
2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。
培养细胞的分化
细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。
* 不适应(Deadaption)
细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。
* 脱分化(去分化)(Dedifferentiation)
由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。
* 不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。
培养细胞的形态
1.贴附型：
1)成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等
2)上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等
3)游走型细胞：神经胶质细胞
4)多形型细胞：神经组织细胞
2.悬浮型：如癌细胞
培养细胞的生长和增殖
1.原代培养(Primary Culture)阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w
2.传代培养(Subculture)阶段：或称继代培养。也就是细胞系(Cell line)阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代)。
3.衰退阶段：
自发性转化(Spontaneous Transformation)：其标志是获得永生性(Immortality)或恶性性(Malignancy): 细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)。
如：BHK(仓鼠肾成纤维细胞)，F9(小鼠胚胎癌细胞)，M2R(黑色素瘤细胞)等。
培养细胞的传代培养
* 当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。
* 所谓细胞"一代"，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。
细胞传代的三个阶段
1)潜伏期(Latent phase)：
细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。
二倍体细胞该期时间长(24~96h)；
连续细胞系时间短(10~30min)。
2) 指数生长期(Logarthmic growth phase)：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数(Mitotic index，MI)表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。
* 指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制(Contact inhibition)。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。
* 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制(Density inhibition)
3)停滞期(Stagnate phase)：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞培养的基本条件
1)仪器和设备:
常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；
培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。
2)培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。
细胞培养的基本条件
3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。
由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。
细胞培养的基本条件
4)平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸监度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
常用的有PBS，Hank's等。
5)抗生素:常用为青霉素(每毫升培养液50~100单位)和链霉素(每毫升培养液50~100微克)。
6)其它添加成分：
缓冲系统，常用为HEPES(N'-2-hydroxy-ethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid) ......
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