逆转生命的时钟 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读
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逆转生命的时钟 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读
获得克隆蛙示意图。
获得iPS细胞示意图。
英国科学家约翰·格登在青蛙的卵与体细胞之间转换DNA，培育出世界上第一只“克隆”蛙；日本科学家山中伸弥基于约翰·格登的理念，将普通皮肤重新变回多能干细胞……79岁的约翰·戈登、50岁的山中伸弥，两位学者因在细胞核重编程研究领域的杰出贡献，获得2012年诺贝尔生理学或医学奖。他们的重大贡献在于从理论上颠覆了人们对自然发育分化的传统观念，即认为干细胞分化为体细胞是不可逆的过程，从而为获取多能干细胞增添了一个新的途径。而以此为核心技术的再生医学研究也将得以快速的发展，人类逆转生命的时钟，实现生命的再造不再是遥不可及的梦想。
精彩的贡献
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“今年的诺贝尔生理学或医学奖颁给了从事干细胞研究的科学家，这对从事干细胞研究的人来说是一件喜事，也说明了干细胞研究的重要性。”中国医学科学院血液学研究所、国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝教授如是说。
“其实，约翰·格登和山中伸弥的获奖在预料之中，可谓实至名归。”中国科学院广州生物医药与健康研究院潘光锦研究员如是说。
“所谓细胞核重编程，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。”潘光锦解释说，按照对生命孕育、生长和成熟的传统看法，在生殖细胞配子(精子和卵子)结合形成胚胎的孕育之初，胚胎中的所有细胞都是不成熟的细胞，它们可以分化发育为身体的各种器官和组织。例如，从胚胎细胞可以分化为神经细胞，再生成大脑、脊髓和周围神经，形成神经系统。但是，它们形成之后，就成为定性、定型的特化细胞。当这些神经细胞、肝细胞等特化成熟后，就不能逆转回到过去的非成熟细胞，即意味着生命是不可以逆转的。然而，约翰·格登和山中伸弥的研究却打破了这一固有观念，发现成熟细胞可以逆转回原始状态，被重编程为多功能的干细胞。他们的精彩成果彻底改变了人类对细胞和生物体发展的认识，关于细胞命运调控和发育的教科书内容已经被重新改写。
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除此之外，韩忠朝认为，约翰·格登和山中伸弥的突出贡献还在于其免除了使用人体胚胎提取干细胞的伦理道德制约。细胞是构成人体组织器官的基本单位，人体大约由200多种类型的60万亿个细胞构成。在人的一生中，身体内各种细胞需要不断地更新，而这些新陈代谢的任务就是由一类特殊的细胞——干细胞来完成。胚胎干细胞是最原始的干细胞，能分化成人体各个组织的各种细胞，因此具有重大的科学研究价值和临床应用前景。但是，用传统技术来分离人胚胎干细胞需要破坏人的胚胎，从而面临着严重的伦理学挑战。一些伦理学要求严格的国家甚至禁止人胚胎干细胞的研究。他们两人分别采用不同的方法使细胞重编程，使终末分化成熟的细胞变回为多潜能的原始干细胞，实现了成熟细胞的“返老还童”。这种通过不破坏人胚胎的方法获取胚胎干细胞，为科学研究和临床应用提供了不违背伦理道德的途径。
在此次获得诺奖之前，他们的研究成果几乎包揽了拉斯克基础医学奖、沃尔夫医学奖等所有医学界大奖。“我们很惊奇地发现，诺贝尔医学或生理学奖也开始不计较时间的考验而提前颁发了。山中伸弥从2006年发表研究成果至今才区区6年，迄今尚未证明是否最后能用于人体治疗。但这在一个侧面也说明了这项研究的巨大贡献。”韩忠朝对记者说。
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重大的价值
潘光锦介绍，早在上世纪50年代，约翰·格登就向分化细胞的不可逆性发出了挑战，在一个经典的青蛙实验中发现了“细胞的特化是可逆的”这一颠覆性的结论：他用来自蝌蚪肠道的成熟分化细胞的细胞核替换掉了卵细胞内不成熟的细胞核，这一修改后的卵细胞最终仍发育成一只正常的蝌蚪。蝌蚪分化细胞的细胞核在移植进入卵母细胞质中后，能指导卵细胞发育为性成熟的成体青蛙。“这是世界上首次证明成熟的细胞核在一定情况下可以逆转为原始状态。”约翰·格登在实验中所使用的体细胞核移植技术通常被称为克隆技术。潘光锦说，随后，这一发现又在其他的动物实验中得到了证实。而哺乳动物体细胞核移植的首次成功，则是大家所熟悉的克隆羊“多利”的诞生。
约翰·格登的发现是一个革命性的改变，理论价值很大，无数实验室的工作都构建在他这项开创性的研究之上。“但这一发现的实用性却显得不足，这是因为细胞核移植不仅烦琐和复杂，难度高，成功率低，而且由于需要提供卵细胞，还存在伦理问题。”潘光锦畅谈道：“40多年后，山中伸弥进一步弥补了这些缺憾，神奇的研究重新验证并深化了格登的发现。”
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2006年，山中伸弥等在对24个胚胎干细胞高表达的候选基因进行筛选后，最终确定了Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4起关键作用的4个因子，借助这4个“引擎”就可以使成熟的体细胞重编程为多能干细胞。通过慢病毒载体介导，山中伸弥将这4种因子导入小鼠的皮肤细胞中，最终获得了具有强大的自我更新和分化潜能的多能干细胞，这些能发育成各种组织的细胞被命名为诱导多能干细胞(iPS细胞)。这一开创性的研究成果发表于国际知名期刊《细胞》上，引起了全世界的轰动。
“当时有人认为山中伸弥的成功是运气，是偶然，但却被越来越多的工作给予证实。”随后，他与美国威斯康星大学詹姆斯·汤姆森博士同时在在人体细胞中也完成了这一壮举。潘光锦介绍，小鼠、人等不同物种iPS细胞的成功不断证明了细胞命运是可以通过基因调节转换的。
两位专家表示，约翰·格登和山中伸弥的研究具有重要价值：其生物学价值在于可对细胞进行人工主动调控和干预，实现细胞水平的生命再造，为研究发育本身提供了新思路，同时避免了异体移植产生的免疫排斥反应，是人类真正进入生命再造时代的开始；其次，其医学价值也相当重要：人体上有众多的体细胞，这项技术意味着生产人自体干细胞有了无穷无尽的“原料”，为再生医学的研究应用带来了新的希望。此外，通过iPS细胞技术诱导分化成的特定类型的细胞，还可以作为药物筛选的模型，进一步保证新药筛选的成功率。
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引领的热潮
其实早在1998年，詹姆斯·汤姆森博士领导的小组就在《science》上发表建立了世界首个人胚胎干细胞系的研究成果，由此产生了再生医学的概念，引起了世界各国对干细胞研究的热潮。曾经师从汤姆森博士的潘光锦谈到，而基于约翰·格登的开创性工作之后，山中伸弥又掀起了新一轮iPS细胞的研究热潮。6年来，全世界科研人员你追我赶，关于iPS细胞的研究成果相继发表于众多世界顶级学术期刊。
“2005年左右，我国也从国家战略上对iPS细胞的研究给予了重视和支持，并有许多重量级的成果受到世界瞩目。”潘光锦谈到，2009年，中国科学院动物研究所周琪研究员在《自然》上报告首次利用iPS细胞，通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞的全能性。
中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿研究员发现了维生素C能够极大促进体细胞“变身”为iPS细胞，从而扫除体细胞“变身”为iPS细胞的分子障碍，也发现了体细胞变身过中间充质表皮细胞转换的重要作用。这些研究相继以封面文章发表在干细胞顶级杂志《细胞-干细胞》上，引起了国内外同行的广泛关注。“此外，其他一些关于iPS细胞机制的研究国内也多有贡献，我们在这个研究热潮中并不落后，且占据了一席之地。”潘光锦评价道。
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据介绍，2011年，我国在iPS细胞研究领域发表的论文数量仅逊于美国和日本，居于世界第三位；但在干细胞领域发表论文的总数量已经超过日本跃居世界第二。
专家认为，论文的数量虽然反映我国在这一领域紧跟世界，但是在基础研究的原创性上仍需努力。潘光锦尤其强调，除了在基础研究领域，我国的iPS细胞研究要走在世界前列，还需要在临床治疗上多下功夫，把眼光从技术突破延伸到临床应用领域。而且就这一点而言，我们与国外处于同一起跑线上。“我国人群病种多样，为研究提供了得天独厚的材料，加之患者的依从性较好，国家对新医疗技术也非常支持。”潘光锦表示，目前他们也在开展有关的工作，希望今后几年能针对退行性病变如老年痴呆和脊髓损伤等患者进行iPS细胞治疗。
应用的桎梏
尽管iPS细胞为再生医学和一些遗传疾病的治疗提供了希望，但韩忠朝强调：当前iPS细胞只是具备了临床应用前景，还没有在临床试验中显示出实用价值。
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山中伸弥本人是一个比较严谨的科学家，他充分认识到了iPS细胞目前的研究状态，曾说“制造iPS细胞就像制造癌细胞”，他也不认为iPS细胞现在就能取代胚胎干细胞。因此，韩忠朝提醒，我们在庆祝干细胞领域的科学家获得诺奖的同时，也要清晰地认识到iPS细胞在科学研究和临床应用方面的局限性，iPS细胞技术还有待时间的进一步验证，这些问题也决定了这项技术未来的发展方向。
韩忠朝认为，首先是细胞的安全性问题。最初制备iPS细胞需要病毒载体的参与，需要向正常细胞中转入一些原癌基因，这成为iPS细胞安全性的重大隐患。随着科学技术的不断发展，一些不依赖于病毒载体参与的方法得以问世，先后创建了腺病毒载体技术、蛋白转染技术、小RNA技术等一系列非整合重编程技术，制备iPS细胞的方法变得越来越安全。期待在不久的将来，没有病毒、没有转基因、高效快速获得iPS细胞的技术会被建立。
另外，iPS细胞是否真能代替胚胎干细胞也值得进一步研究明确。研究发现，iPS细胞和胚胎干细胞在一些我们未曾关注的方面存在不少差异。例如，iPS细胞表现出更糟糕的基因组稳定性，这使其在再生医学方面的临床应用安全性受到比胚胎干细胞更严重的挑战。韩忠朝提醒，iPS细胞的机制还未被完全阐明。比如，为什么引进一些外源的基因，或是小分子物质，就能够诱导终末分化的细胞成为原始的多潜能细胞？iPS细胞的原始性和肿瘤细胞的低分化性是否存在一定的共同点？此外，许多人认为iPS细胞用于本人不会产生免疫排异，但不少研究结果却发现并非如此。
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在采访中，潘光锦也表示，iPS细胞的获得毕竟是一个人工过程，其基因组有无发生改变；通过这一技术分化出的各种细胞与人体本身的细胞是否具有同样功能；移植后的细胞在人体长期存在是否安全；如何进一步提高iPS细胞的分化效率，并控制其质量……“这些都是困扰iPS细胞技术的瓶颈，目前国际上也都处于探索阶段，但前景很好”。
iPS细胞研究还处于实验室阶段，这一领域面临的挑战依然很多。潘光锦坦言：“iPS细胞技术是再生医学的核心技术，或许还有诸多不成功的因素存在，但目前看来，iPS细胞研究具有一切可成功的现象和特征，前景不可限量，以此为依托，我们大有可为，但需要各国科学家的共同努力。”
(图片来源：www.bjd.com.cn) (本报记者 白 毅)
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人物名片
约翰·格登：
1933年出生于英国Dippenhall。1960年在牛津大学获得博士学位，随后在加州理工学院从事博士后研究。自1972年加入英国剑桥大学，担任细胞生物学教授，曾任该校麦格达伦学院院长。目前在剑桥大学格登研究所工作。
山中伸弥：
1962年出生于日本大阪。1987年在神户大学获得医学学士学位(MD)，接受整形外科医生培训，之后转为基础科研。1993年在大阪市立大学获得博士学位(PhD)，之后工作于美国旧金山格拉德斯通研究所和日本奈良先端科学技术大学院大学。目前是京都大学教授，同时供职于格拉德斯通研究所。
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生命逆转研究 在质疑中前行
在质疑中前行
无论是约翰·格登的实验，还是山中伸弥的研究结果，在开始无一例外受到质疑，因为成熟的体细胞是如何逆转而成为可分化的多能干细胞，一直是个诱人但又难解的谜。
约翰·格登的研究其实也是站在前人的肩上。生命逆转的最初设想来自德国生物学家汉斯·斯佩曼。他在其1938年出版的《胚胎发育和诱导作用》一书中提出，移植细胞核可能会产生新生命，即克隆动物。做法是把一个细胞的细胞核提取出来后，核移植到一个去除细胞核的卵子中，看看这种组装的细胞是否能发育为胚胎甚至生命。
不过，斯佩曼并没有做这个实验，接力火炬交到了美国生物学家伯里格斯和金手里。1952年，他们两位提取了豹蛙囊胚细胞的细胞核，然后移植到另一个豹蛙的去掉细胞核的卵细胞中。最后组装的卵细胞先是发育成了蝌蚪，最后发育为一只成体蛙。研究人员当时的结论是，由于囊胚细胞是分化早期的胚胎细胞，因此存在全能分化性，可以发育为成体蛙。
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但是，成熟的体细胞的细胞核组装到去核卵细胞中是否也能发育为成体动物呢？一些研究人员随后进行了研究。他们用分化后期的蛙类胚胎细胞的细胞核移植到同类动物的去核卵子中，结果只能发育到蝌蚪，而不能发育到成体蛙。这说明，越原始越不成熟的胚胎细胞越具有全能分化的能力，而已经具备一定分化能力的胚胎细胞则不一定能分化为成熟个体。
正是在这样的基础之上，格登的研究就引起了质疑，因为他用的不仅不是早期的胚胎细胞，而且根本就不是胚胎细胞，其全能分化性非常之差。最先提出质疑的是他的学生史密斯，因为史密斯也用青蛙的小肠上皮细胞进行实验，却没有得出与格登相同的结果。
史密斯认为，格登用的是青蛙小肠上皮细胞中未进行减数分裂的原始生殖细胞，而非已分化的成体细胞，因为大多数蛙类蝌蚪期的肠上皮细胞中有2%~5%是没有进行减数分裂的原始生殖细胞，这些细胞具有更好的全能分化性，它们拥有能发育成一个新个体的全部遗传信息。同时，格登的实验只有2%的成功率也反证了他采用的小肠细胞中那些占2%~5%比例的细胞拥有全能分化性。所以，格登实验得出的结果并非完全被学术界所肯定。
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但是，格登也好，史密斯也好，他们采用的实验动物都是两栖类动物，并不能全部取代和说明所有动物或生命都能如此逆转。英国爱丁堡罗斯林研究所伊恩·威尔穆特等人对更高级的哺乳动物绵羊进行的克隆研究，则为格登提供了有力支持——1996年7月5日，维尔穆特等人采用已经分化的成熟体细胞乳腺细胞，孕育出一个更高级的生命——克隆羊“多利”。
由于高级哺乳动物已经成熟的体细胞更难逆转和生成新生命，多利的成功使得成熟体细胞(细胞核)可以重新逆转发育成生命得到了认可。不过，这并不意味着对山中伸弥获得的诱导多能干细胞(iPS细胞)的认可。
山中伸弥等人采用的是小鼠胚胎成纤维细胞和成体尾巴成纤维细胞，也有人怀疑采用的是未分化的胚胎细胞，而非胚胎成纤维细胞。因此，需要对山中伸弥等人的研究进行验证。
验证首先由山中伸弥自己完成。在小鼠身上获得了iPS细胞后，2007年，山中伸弥等人采用分别来自一位36岁女性的表皮细胞和一位69岁男性的结缔组织细胞进行了研究，获得了同样结果。而且，山中伸弥等人将成体细胞转化为iPS细胞的效率更高一些，约每5000个细胞就能制造1个诱导多能干细胞系。这种高效能保证他们在每项实验中都能得到数个诱导多能干细胞系。
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也是在2007年，美国威斯康星大学詹姆斯·汤姆森团队的研究再次验证了山中伸弥等人成体干细胞可以逆转的结果。汤姆森等人采用的是胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞，不过，采用的诱导基因并不完全等同于山中伸弥等人采用的基因。而且，在转化效率上，汤姆森等人的研究需要1万个细胞才能分离出1个诱导多能干细胞系。值得一提的是，汤姆森研究团队这一研究的第一作者是华裔女科学家俞君英。
也是在同年，威尔穆特宣称，相比于克隆胚胎技术，将体细胞转变成iPS细胞的新技术是今后治疗疑难病症的关键技术，比使用胚胎干细胞更具潜在优势。虽然威尔穆特当时“在5年内可以获得iPS细胞治病救人”的预言并没有实现，但是这一应用在动物身上得到验证。
2010年12月8日，日本东京庆应义塾大学冈野荣之的研究小组宣称，他们将4种基因移植到人体皮肤细胞中，诱导皮肤细胞生成iPS细胞，再把这些细胞注射到一只瘫痪的绒猴(美洲产小型长尾猴)体内进行治疗。这只绒猴是因为颈部脊椎受损而致高位截瘫，颈部以下四肢失去运动功能，不能正常行走和活动。治疗6周后，绒猴能到处蹦跳，接近于受伤前的正常运动水平。此外，其用前肢抓握物体的力量也恢复到80%。
但是，iPS细胞能否全面应用到临床治病救人还有许多难题需要攻克，可能还有待时日。据悉，2013年，山中伸弥所领导的团队将进行第一例利用iPS细胞分化细胞的人体临床试验，他们希望用人工制造的视网膜色素上皮细胞治疗黄斑变性。我们期待着! (张田勘)
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