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微生物药物学ppt课件:第13章——抗肿瘤抗生素.ppt
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    第十三章

    抗肿瘤抗生素及肿瘤细胞耐药性

    一些常见抗肿瘤药物对DNA作用的顺序特异性

    一些作用于DNA

    鸟嘌呤N2的抗肿瘤抗生素的机制

    DNA的立体模型(A)，以及一些药物

    对DNA小沟处碱基的作用模式(B)

    第一节蒽环类抗肿瘤抗生素---一、柔红霉素和阿霉素

    柔红霉素和阿霉素的作用机制

    * 对柔红霉素和阿霉素的作用机制研究发现，其与DNA的嵌入形成2：1的DNR-CGTACG复合物，并确定了蒽环类抗生素结构中的三个功能部分：

    * 1)嵌入(环B-D)；

    * 2)A环的锚链(如C9-OH)；

    * 3)氨基糖;

    * 每一部分对生物学功能起着重要的作用。

    * 另外一个重要的发现是：甲醛分子能够使这类药物将药物分子中柔毛霉胺的N3与DNA分子中鸟嘌呤N2进行共价结合.

    由甲醛分子介导的2：1 DNR-CGCGCG共价复合物的三维结构

    箭头所示为甲醛分子介导的共价交链。

    A：从DNA小沟所示；B：从DNA大沟所示。

    另外一个蒽环类抗肿瘤抗生素诺加霉素(nogalamycin，Ng)，它对DNA的嵌入模式跨越小沟和大沟.

    二、双嵌入类化合物

    * 对柔红霉素的结构改造，合成了双柔红霉素类化合物WP631和WP652，其具有比柔红霉素和阿霉素更强的生物活性(化学结构如图所示)。

    * 这两种双柔红霉素类化合物嵌入DNA的模式不同：WP631优先嵌入到具有CG(A/T)(A/T)CG的一个六核苷的顺序中，并在两个甙元之间包裹四个碱基对；而WP652与一个四核苷顺序结合，如PyGTPu。

    三、蒽环类抗生素的其他一些作用机制

    * 一般地，蒽环类抗生素对DNA和RNA具有较高的亲和力，因此认为这类抗生素通过将其分子非极性插入到DNA双螺旋的碱基来发挥抗肿瘤的作用，故也称之为如上所述的嵌入型DNA结合机制。

    * 但根据对这类抗生素的结构、理化特性和毒副作用的研究，发现还有一个重要的作用机制：线粒体作为亚细胞作用靶位。

    * 其可能通过以下机制来影响线粒体。

    1、与脂质的亲和力

    * 对这类抗肿瘤抗生素心脏毒性的研究表明：其细胞毒性的主要作用靶位是线粒体膜。

    * 在线粒体的内膜富含心磷脂(cardiolipin，CL)，阿霉素与这种物质的亲和力比磷脂酸高80倍。

    * 在线粒体膜上存在有很多具有一定功能的酶，如NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶和细胞色素C还原酶等，这些酶功能的正常发挥需要一定量的心磷脂。

    * 因此，当蒽环类抗生素与膜上的心磷脂结合后，就在不同程度上影响了这些酶的功能，这就是所谓的群集活性(clustering activity)。

    阿霉素的群集活性，即其与心磷脂结合后影响线粒体复合物I-III，其作用模式可以是：阿霉素-心磷脂(双磷脂酰甘油)复合物与酶促复合物I-III移动在一起(a)；也可以是：阿霉素-心磷脂(双磷脂酰甘油)复合物与酶促复合物I-III分开(b)。这两种情况下，酶活性都受到抑制。

    2、钙浓度与膜去极化

    * 体外研究表明：在一定的钙浓度下，线粒体起着钙储存的作用从细胞质收集，蒽环类抗生素具有影响稳态钙浓度的作用。

    * 这种作用模式使阿霉素保持为一种弱的氧化剂，来氧化蛋白质上关键的巯基(这种蛋白为钙离子传运通道或孔)。确实，巯基还原剂能够保护钙离子外排。

    * 蒽环类抗生素对钙稳态影响的分子机制似乎又是自由基调节机制。自由基也损坏通过肌质网对钙的收集。

    3、金属离子的络合

    * 实验表明：在有DNA存在时，ADR-Fe+3复合物显著地刺激从H2O2产生羟基自由基。这与观察到的ADR-Fe鳌合物与DNA形成稳定的三元复合物相一致，这种三元复合物本身就是一种活化的氧化还原催化剂。

    * ADR-Fe+3复合物存在的情况下，自由基的形成也对真核细胞血影膜(ghost membrance)进行氧化破坏。

    * Gianni等的研究表明：ARD-Fe+3复合物的循环降低分子氧。随着Fe+3 还原成Fe+2，形成一种阿霉素自由基，其可能介导药物的毒性作用。

    阿霉素与一种普通金属离子之间形成

    的双复合物(a)和单复合物(b)

    4、自由基的诱导

    * 在1970年至1980年间，人们开始认识到阿霉素的心脏毒性并非其本身的结构所致，而是由于在体内被还原成为半醌自由基。

    * 该自由基在厌氧条件下相当不稳定，它很容易地将氧还原成为超氧化物，超氧化物离子可以进一步使脂质过氧化。超氧化物将启动导致产生活性.OH和H2O2的级联放大反应。这些自由基都涉及到对细胞的损伤，包括DNA的断裂、DNA-蛋白的交链，以及蛋白质的破坏。

    * 由于心脏组织中基本不存在具有解毒作用的酶类，因此，其毒性往往比其他组织要大。另外，蒽环的氧化还原循环抑制了谷光苷肽超氧酶的活性.

    多重作用机制:

    * 蒽环类抗肿瘤抗生素进入胞内与线粒体发生交互作用后，引起一系列的生物学效应：

    * 一是导致细胞色C的释放，其诱导细胞发生调亡；

    * 二是产生自由基，导致脂质过氧化、DNA断裂和蛋白质破坏，以及钙离子释放；

    * 三是与金属离子形成复合物，导致自由基的产生；

    * 四是与脂质发生交互作用，导致膜结构的改变和某些酶的抑制；

    * 五是抑制某些酶的活性。

    蒽环类抗肿瘤抗生素的生物学效应和分子作用机制

    第二节丝裂霉素C

    * 丝裂霉素是一类强效抗生素，于1950年由日本微生物学家从Streptomycescaesoitosus的发酵培养物中发现。其家族成员之一丝裂霉素C(mitomycin C，MC)。

    * 由于丝裂霉素C对实体瘤具有广谱的抗肿瘤活性，已于上世纪60年代被用于临床癌症化疗。

    * MC是乳房、肺，前列腺癌症联合化疗的一种重要药物，也是少数几种有效的抗结肠癌药物之一，并且是治疗表皮膀胱癌所选择的药物之一和单一治疗非小细胞型肺癌的最具活性的药物。

    丝裂霉素类的化学结构

    一、丝裂霉素通过与DNA交联，作为一种强效的细胞毒损伤物质

    * 早期的分子药物学关于MC的研究揭示了这类抗肿瘤抗生素的一种特殊能力：MC和该族化合物的其它成员能够使DNA链产生交联。

    * 尽管DNA被一些简单的化学合成双功能烷化剂交联的现象提早两年已被发现，但丝裂霉素却是具有这种功能的唯一一种天然抗生素。

    * 关于丝裂霉素具有这种烷化作用的证据已被确证。例如：伴随着交联，药物分子只结合在一条DNA链上。

    * 丝裂霉素主要是作为一种DNA复制抑制剂而发挥抗细胞活性已被证实,很多证据揭示，这种抑制基本上是由MC诱导的交联造成的。

    二、生物还原性药物活性：

    丝裂霉素C作为原型起作用

    * 在Lyer和Szybalski的经典论文中(1964)第一次描述了有关MC分子机制的另一个独特的特征是：DNA交联和烷化活性需要还原醌，这才使得药物转化为高活性的烷基化形式。这种特性被认为在癌症化疗中很重要。

    * 相对于生长在有氧环境下的细胞，MC和甲基丝裂霉素对培养在缺氧条件下细胞有选择性细胞毒性，这可通过O2抑制丝裂霉素的还原活性来解释。

    * 这些发现使人们得到这样一个假设：丝裂霉素拥有独特的抗肿瘤选择性，即作用于于实体瘤的缺氧区，这些区域通常对放射治疗和其它需氧治疗有抗性。

    三、由MC导致的DNA烷化和交联的机制

    *DNA交联剂是癌症化疗药物的重要成员，最好的例子是合成药物苯丁酸氮芥、氮芥、卡氮芥，以及环磷酰胺等。

    * 与合成药物相比，MC是这类化合物中唯一的天然来源的物质，有更复杂的化学结构和作用机制。

    * MC的复杂性提供了很好的机会来研究它的结构、还原机制、DNA损伤、生物活性等与化疗效应之间的关系。

    KW-2149与BMS-181174的化学结构

    以及经谷胱苷肽活化的机制

    FR900482和FR66979的还原活化机制

    丝裂霉素C与DNA单功能和双功能

    活化形成加合物的机制

    由MC在对DNA引起交联时的两步反应

    活化形式的MC中C-10氧原子与DNA之间的

    CpG顺序-特异性的H-键

    箭头指向作为共价反应靶位的鸟嘌呤

    MC单加合物存在下，专为CG-CG序列交联

    单烷化的MC-DNA加合物模式

    MC在C4pG5中鸟嘌呤G5残基的N2位烷化；通过MC分子中C10与鸟嘌呤G15之间的键的作用可以形成交链的加合物。

    第三节 博莱霉素类抗肿瘤抗生素

    * 一、博莱霉素类抗生素的结构特征

    * 博莱霉素(bleomycin ，BLM)是一族具有独特结构和作用的广谱抗菌抗肿瘤抗生素，是日本微生物化学研究所梅泽宾夫首先从轮枝链霉菌(Streptomyces vertillus )中分离到的，属于糖肽类抗生素。

    * BLM组分繁多，在天然组份中结构衍生物有十几个。

    泰莱霉素(talisomycin)被称为第三代博莱霉素，其疗效比博莱霉素好，而毒副作用较小。泰莱霉素的化学结构。

    一、博莱霉素类抗生素的作用机制

    * 有些抗肿瘤药物具有断裂DNA的功能，其中许多是通过氧化还原系统来活化这些药物分子，形成具有自由基状态的药物。

    * 博莱霉素和培洛霉素属于这类抗肿瘤抗生素。

    1、博莱霉素-金属-O2 复合物氧化还原特性

    * BLM能同时结合氧及氧化还原活性过渡态金属离子，如：铁、钴、锌、镍、铜。

    * 这些离子与BLM的假肽部分的几个氨基组成螯合物。

    * 这些复合物中最稳定的是与钴形成的螯合物。六个配位键使结合不可逆。

    * BLM-Fe2+与O2形成三元加合物，结合到DNA上并在Fe2+氧化为Fe3+后对DNA脱氧核糖C4'位进行亲核攻击。

    在有氧(a)或无氧(b)情况下，将分别导致DNA链的切割，以及在DNA链保持完整的情况下释放游离碱基和产生一种氧化性破坏的糖。

    1、博莱霉素-金属-O2 复合物氧化还原特性

    * 与其他金属离子形成的加合物仅在十分有限的条件下才被激活。而Fe2+的再生允许三元复合物BLM-Fe2+-O2保持催化活性。据估计，一个BLM分子可产生8～10个DNA裂缝。

    * 因此，BLM可以被看作一个小的核酸内切酶。

    A：金属离子Co(III)与PEP的结合模式。来源于PEP的5个氮供体原子和1个氢过氧化物基团与钴以特有的几何性状结合；其赤道面上的配体包括腺嘌呤上的次级胺、嘧啶N5的P、咪唑的N1，以及酰胺氮上的H；其轴向对CoPEP的配体为Man-NH2和HO2-(对CodPEP的配体为A-NH2和HO2-)。

    B：CodPEP-CGTACG复合物的三维结构。红色的圆球代表钴离子；CodPEP的金属结合结构域在靠近G8-T9的DNA小沟中结合；注意HO2-基团与T9的H4'邻近。

    C：CodPEP的嘧啶环通过识别一个鸟嘌呤碱基的氢键与G8-C5碱基对结合，形成一个三联体。

    2、与核酸的相互作用，在DNA上的切割转移性

    * BLM在GC碱基对的水平上切割DNA。二噻唑和末端氨基部分通过使BLM在DNA上结合更稳定对BLM的作用机制起到很大作用，无论Fe2+再生的机制实际如何，复合物在初始GC碱基对水平的时间比Fe2+再生的必要时间长，因为BLM经常可发起另一次对反链DNA上(无序列特异性位点，根据第一切割位点而定+1或-1C)的亲核进攻。

    * 这将导致频繁的双链DNA断裂：平均一个双链裂为6～8个DNA单链。

    3、在染色质上的切割特异性

    * 在染色质水平上，限制因素不是由BLM所识别的GC碱基对，而是药物对这些序列的趋近性。已经证实，BLM优先在活跃的被转录的染色质结构域水平上切割DNA；而且，在这些结构域中，优先在连接两个相邻的染色体的DNA连接处切割。

    * 当染色质在DNA凝胶电泳前经过足够数量的BLM处理后将导致寡核小体梯度的产生。

    * 端粒合成序列也可以被BLM切割。

    4、其他核酸的切割

    * BLM还可以在一定的部位切割RNA。例如，BLM可在一个特定的位置消化5S rRNA、酵母 tRNA、枯草芽孢杆菌tRNA，以及HIV1的一个mRNA转录产物。

    * 总之，BLM结合并从单链和双链伸长连接处破坏这些分子。

    5、与蛋白质的相互作用，BLM水解酶

    * BLM水解酶催化BLM脱氨失活，此酶在动物细胞及酵母细胞内都存在。酵母基因序列已经测定，而BLM水解酶与半胱氨酸蛋白酶家族有相似性。该蛋白在细胞中位置尚未确定。

    * 尽管各种细胞对BLM的抵抗作用都归结于此酶，例如B淋巴瘤、肺癌、大肠癌，BLM水解酶对BLM的特异性及其保护细胞不受BLM伤害的机理仍不明了。其实，它的活性在细胞提取物中十分易测，但在完整的细胞中测定困难。

    * 然而，有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64可能通过抑制BLM水解酶活性而加强BLM活性。

    6、博莱霉素抑制蛋白BRP

    * BRP是一类对BLM有高度特异性的BLM结合蛋白。他们在产生BLM或BLM衍生物，如泰莱霉素的微生物菌体中被发现。

    * 编码这些蛋白的一个基因，还在具有几种抗生素抗性的Tn5细菌转座子中被发现。这一基因很短(ca.400bp)，且其编码的这些蛋白在细胞核中组成二聚体。

    * 它们通过与BLM形成稳定的可阻止BLM接近DNA的复合物使BLM失活。

    三、博莱霉素的毒理学

    1、博莱霉素对动物细胞的作用

    * 用14C标记的BLM通过放射自显影表明BLM起先位于细胞膜水平，几小时后博莱霉素就位于细胞核了。......（后略) ......