人LAK细胞的前体及效应细胞的研究
作者：郭晰 龚伊红 王丽 董继红 张学全
单位：100005北京中国医学科学院基础医学研究所
关键词：杀伤细胞，淋巴因子激活；杀伤细胞，天然
中华医学杂志930504 摘要 用不连续Percoll密度梯度离心法将人外周血淋巴细胞(PBL)中具有自然杀伤(NK)活性的细胞相对集中在第二层(F2)，F2细胞经r白细胞介素2培养3天后表现出淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性(F2LAK)。其活性高于F4LAK与来源于PBL的LAK细胞。酶标记免疫组化法显示F2中CD16+与CD8+细胞相对集中。故这两种细胞可能是在LAK接受体细胞。F2LAK细胞数量增殖，CD16+与CD8+细胞所占百分比变化不明显，故LAK的效应细胞也可能兼有激活的CD16+与CD8+细胞。以上结果提示，制备LAK细胞时用CD16+与CD8+细胞代替{PBL进行培养，有可能提高疗效。
, 百拇医药
80年代以来，淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞因其对肿瘤的广谱杀伤作用而受到重视。2国内外对LAK前体与效应细胞认识尚不统一。我们拟对比研究部分提纯的自然杀伤(NK)细胞与T细胞分别经r白细胞介素2(rIL2)培养后在体外对人肿瘤细胞的杀伤活性，探讨LAK细胞主要来源的前体细胞和效应细胞。
材料与方法
一、材料
1.人外周血：各种血型人新鲜抗凝全血，购自北京协和医院血库。
2.肿瘤细胞系：NK敏感细胞系：K562(人红白血病细胞系)。NK抵抗细胞系：(1)Raji,Burkitt淋巴瘤细胞系；(2)HL60，人早幼粒白血病细胞系；(3)LTEPα2，人肺腺癌细胞系。
3.单克隆抗体：CD16，军事医学科学院分子免疫室提供。CD3(Leu4)，中国医学科学院肿瘤研究所分子生化室提供。CD4(OKT4)、CD8(OKT8)，OKB7及OKDR购自美国Ortho公司。
, 百拇医药
4.人rIL2：由中国预防医学科学院病毒研究所张志清提供，活性100000U/ml。
二、方法
1.人外周血大颗粒淋巴细胞(LGL)的分离：用淋巴细胞分离液从人外周血中分离出单个核细胞。塑料培养皿中贴壁除去单核细胞，再过尼龙毛柱除去B细胞与剩余的单核细胞，从所得尼龙毛不吸附细胞中按下法〔1〕分离LGL细胞：用Percoll和3倍RPMI1640液配成60.6%Percoll，内含10%小牛血清。再制成37.83%、43.33%、45.83%及52.00%的Percoll不连续密度梯度离心柱。将尼龙毛不吸附细胞加到离心柱上，离心550×g，30分钟。逐层取出细胞，离心洗二遍后悬于培养液中。0.1%伊文兰染色鉴定，活细胞占99%以上。用细胞分离机甩片，Giemsa染色，每片计数500个细胞，算出各层LGL的百分比。
2.LAK活性诱导〔2〕：将分离出的2层与4层细胞分别加入LAK活性诱导体系，该体系组成为：RPMI1640培养液，10%混合人AB血清，5×10-5mol/L2-巯基乙醇，γIL2，1000U/ml。细胞浓度为1×106/ml。置37℃，5%CO2孵箱中培养，2天后更换一半培养液，共培养3～5天。
, 百拇医药
3.杀伤活性检测：用51Cr释放法测定，参照石卫等〔3〕的方法。Na512 CrO4为中国原子能研究所产品。杀伤活性(细胞毒性)的计算公式如下：
4.细胞表面标志检测：采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶免疫标法。试剂盒购自军事医学科学院分子免疫室。细胞用1%多聚甲醛及0.01%戊二醛固定液固定30分钟。一抗为上述诸单克隆抗体。染色步骤按试剂盒说明。最后用甘油明胶封固。在光镜下计数1000个细胞。算出阳性细胞率。
5.新鲜肺癌细胞的分离和提纯〔4〕：将手术后新鲜肺癌标本剪成小块，加入消化液(5%小牛血清RPMI含DNase 0.02mg/ml，透明质酸酶0.01ml/ml，胶原酶1mg/ml)，于37℃持续振荡2小时。用筛网除去剩余组织。细胞悬液过Ficoll密度梯度(75%，100%)柱，离心400×g，30分钟。取出第一层细胞，再过Percoll不连续密度梯度柱(10%，15%，25%)。离心25×g，7分钟。取第三层与底层细胞。塑料平皿贴壁30分钟，收集非粘附细胞。加冻存液(含90%人AB血清和10%二甲亚砜)冻存。使用前复苏。
, 百拇医药
以上操作皆在无菌条件下进行。所获细胞用Wright-Giemsa杂色鉴定，肿瘤细胞含量>95%。用0.1%伊文氏兰染色证明95%以上为活细胞。
结 果
一、NK细胞的分离与鉴定
人外周血淋巴细胞经Percoll不连续密度梯度离心后，各层细胞中LGL所占百分比分别为：F17.5%、F250%、F310%、F43%。可见LGL相对集中在F2，而F4中很少。
用51Cr释放法测定各层细胞与外周血淋巴细胞(PBL)对K562细胞的杀伤活性结果见图1。说明F2的NK活性不仅明显高于其他各层，而且高于PBL，而F4的NK活性极低。因此F2细胞被用作NK细胞富集层。F4细胞被用作NK细胞缺失层。
, 百拇医药
图1 Percoll各分层细胞与PBL对K562的杀伤活性
二、rIL2对各层细胞杀伤活性的影响
各层细胞经rIL2培养3天后细胞增殖：F22.78倍，F31.39倍，F42.47倍。对K562(为NK敏感肿瘤细胞)的杀伤活性都有所提高，但仍以培养后的F2细胞活性最高。
表1 rIL2培养前后各层细胞对6例肺癌癌细胞的杀伤活性(51Cr释放百分率) 例号
E：T*
各层细胞
F2NK
, 百拇医药
F4NK
PBL-NK
F2NK
F4NK
PBL-LAK
1
100
4.1
0
3.9
7.2
1.5
, 百拇医药
5.7
2
100
3
1
3
12
0
-
3
100
0
0
0
, 百拇医药
19
12
13
50
4
0
0
21
12
-
25
0
0
0
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18
10
4
4
100
0
0
-
10
5
-
5
100
0
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0
-
23
8
-
6
100
0
0
-
14
5
-
注：*为效应细胞数/靶细胞数，“-”为没做
, 百拇医药
从图2～4可见，培养前各层细胞对3个NK抵抗肿瘤细胞系的杀伤活性极低，或无杀伤能力。经rIL2培养后都获得了LAK活性(杀伤NK抵抗肿瘤细胞的活性)。其中F2的LAK活性提高明显高于其他各层。
图2，3 各层细胞对NK抵抗肿瘤细胞系的杀伤活性
图4 培养前后各层细胞对NK抵抗肿瘤细胞系的杀伤活性
由表1可见培养前F2及F4细胞均无明显的杀伤新鲜肺癌细胞的作用。经rIL2激活后，对6例新鲜肺癌细胞出现了LAK活性。F2LAK活性不仅高于F4LAK，而且优于rIL2激活的PBL(经典LAK)。
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三、细胞表面标志检测结果
从表2可见，培养前F2中CD16+细胞(NK)相对集中(占47%)。CD3+T淋巴细胞仍占41%。CD8+T细胞占40%。而F4中绝大多数(86%)为CD3+细胞，其中可能以CD4+的辅助性T细胞为主，因后者占60%。F2一F4中B7与DR阳性细胞极少，说明B细胞基本清除干净。
表2 IL-2培养前后F2、F4细胞的表面 F细胞
表面标志阳性率(%)
CD16
, 百拇医药 CD3
CD8
CD4
B7
DR
F2
47 43*
41 40*
40 34*
1
<0.01
<0.01
, 百拇医药
F4
1 1*
86 87*
19 27*
60
<0.01
<0.01
*经rIL2培养3天后
经rIL2培养3天后，CD16+与CD8+细胞所占百分比无明显变化。仅F4LAK中CD8+细胞较培养前有所增加。
, 百拇医药
四、LGL与LAK细胞的形态
Giensa染色示LGL细胞直径8μm～9μm，核肾形或圆形，胞浆较宽，内有嗜天青颗粒。LAK细胞体积增大，直径约12μm，胞浆中嗜天青颗明显增多。核大，染色质多，核仁明显，核分裂常见。
讨 论
酶标免疫组化法检测表面标志的结果说明F2细胞中CD16+与CD8+者分别占47%与40%，明显高于F4中的1%与19%。有文献报道〔5，6〕，一些CD3+的T细胞，尤其是在激活的情况下，也表现出与NK细胞相似的杀伤活性，称之为“NK样”或非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀伤T细胞。这种细胞同时显示CD8抗原。故本实验的F2细胞中可能相对集中了两种细胞，一种是CD16+的典型NK细胞，另一种是CD8+非MHC限制性杀伤T细胞。
, 百拇医药
经rIL2培养3天后，F2LAK对NK抵抗型肿瘤细胞系的杀伤活性增高6～60倍，特别是对部分新分离的人肺癌细胞也出现杀伤活性，而且高于来源自PBL的LAK。F4LAK的活性明显低于F2LAK。
根据以上结果可以推论：F2细胞经rIL2培养后，其产生LAK活性的前身可能兼有CD16+NK细胞与CD8+非MHC限制性杀伤T细胞两种。F4中这两种细胞的原始数量低，所以产生的LAK活性也较低。CD4+胞不可能是LAK前身，否则来源于F4的LAK活性应高于来源于F2者。
F2细胞经rIL2短期培养后，虽然增殖将近三倍，但CD16+与CD8+细胞所占百分数变化不明显，提示LAK的效应细胞也兼有激活的CD16+NK细胞与CD8+杀伤T细胞。LAK细胞比NK细胞体积增大，胞浆颗粒增多，是功能增强的形态学指征。说明LAK活性的出现不是单纯因为前体细胞数量增加，而主要是由于前体细胞经激活后变成识别与杀伤功能都有所增强的LAK效应细胞，而后又繁殖的结果。已有文献报道〔7〕，培养时间延长后效应细胞中激活的Leu 19+细胞(即杀伤性T细胞)增殖较快，CD16+细胞的数量相对下降。在本实验激活的F4细胞中，CD8+细胞增殖的情况已初步显示出这种趋势。
, 百拇医药
以上结果说明，在制备LAK细胞时，培养纯化的CD16+与CD8+细胞有可能提高其功效。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Itoh K, Tilder AB, Balch CM.Lysis of human solid tumor cells by lymphokine-activated killer cells.J Immunology, 1986,136:3910.
2 Grimm EA.Lymphokine activated killer (LAK) cell phenomenon:the precursor phenotype is serologically distinct from peripheral T lymphocytes,memory CTL,and NK cells.J Exp Med, 1983,157:884.
, http://www.100md.com
3 石卫，吴易元，张友会.天然杀伤(NK)细胞活性的测定——125IUDR及51Cr释放试验的比较.中国免疫学杂志，1986，1：14.
4 Uchida A, Mickche M. Lysis of fresh human tumor cells by autologous large granular lymphocytes from peripheral blood and pleural effusions.Int J Cancer, 1983,32:37.
5 Lanier LL.The relationship of CD16 (Leu 11)and Leu 19(NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes.J Immunology,1986,136:4480.
, 百拇医药
6 Hercend T,Schmidt RE.Characteristics and uses of natural killer cells.Immunology Today,1988,9:291.
7 Lefor AT,Mule JJ,Rosenberg SA.Lymphokine-activated killer cells.Biology and therapeutic efficacy.In:Reynolds CW,Wiltrout RH eds.Functions of nalural immune system,New York:Plenum,1989;39-56.
(收稿：1992-07-31 修回：1993-02-20), 百拇医药
单位：100005北京中国医学科学院基础医学研究所
关键词：杀伤细胞，淋巴因子激活；杀伤细胞，天然
中华医学杂志930504 摘要 用不连续Percoll密度梯度离心法将人外周血淋巴细胞(PBL)中具有自然杀伤(NK)活性的细胞相对集中在第二层(F2)，F2细胞经r白细胞介素2培养3天后表现出淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性(F2LAK)。其活性高于F4LAK与来源于PBL的LAK细胞。酶标记免疫组化法显示F2中CD16+与CD8+细胞相对集中。故这两种细胞可能是在LAK接受体细胞。F2LAK细胞数量增殖，CD16+与CD8+细胞所占百分比变化不明显，故LAK的效应细胞也可能兼有激活的CD16+与CD8+细胞。以上结果提示，制备LAK细胞时用CD16+与CD8+细胞代替{PBL进行培养，有可能提高疗效。
, 百拇医药
80年代以来，淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞因其对肿瘤的广谱杀伤作用而受到重视。2国内外对LAK前体与效应细胞认识尚不统一。我们拟对比研究部分提纯的自然杀伤(NK)细胞与T细胞分别经r白细胞介素2(rIL2)培养后在体外对人肿瘤细胞的杀伤活性，探讨LAK细胞主要来源的前体细胞和效应细胞。
材料与方法
一、材料
1.人外周血：各种血型人新鲜抗凝全血，购自北京协和医院血库。
2.肿瘤细胞系：NK敏感细胞系：K562(人红白血病细胞系)。NK抵抗细胞系：(1)Raji,Burkitt淋巴瘤细胞系；(2)HL60，人早幼粒白血病细胞系；(3)LTEPα2，人肺腺癌细胞系。
3.单克隆抗体：CD16，军事医学科学院分子免疫室提供。CD3(Leu4)，中国医学科学院肿瘤研究所分子生化室提供。CD4(OKT4)、CD8(OKT8)，OKB7及OKDR购自美国Ortho公司。
, 百拇医药
4.人rIL2：由中国预防医学科学院病毒研究所张志清提供，活性100000U/ml。
二、方法
1.人外周血大颗粒淋巴细胞(LGL)的分离：用淋巴细胞分离液从人外周血中分离出单个核细胞。塑料培养皿中贴壁除去单核细胞，再过尼龙毛柱除去B细胞与剩余的单核细胞，从所得尼龙毛不吸附细胞中按下法〔1〕分离LGL细胞：用Percoll和3倍RPMI1640液配成60.6%Percoll，内含10%小牛血清。再制成37.83%、43.33%、45.83%及52.00%的Percoll不连续密度梯度离心柱。将尼龙毛不吸附细胞加到离心柱上，离心550×g，30分钟。逐层取出细胞，离心洗二遍后悬于培养液中。0.1%伊文兰染色鉴定，活细胞占99%以上。用细胞分离机甩片，Giemsa染色，每片计数500个细胞，算出各层LGL的百分比。
2.LAK活性诱导〔2〕：将分离出的2层与4层细胞分别加入LAK活性诱导体系，该体系组成为：RPMI1640培养液，10%混合人AB血清，5×10-5mol/L2-巯基乙醇，γIL2，1000U/ml。细胞浓度为1×106/ml。置37℃，5%CO2孵箱中培养，2天后更换一半培养液，共培养3～5天。
, 百拇医药
3.杀伤活性检测：用51Cr释放法测定，参照石卫等〔3〕的方法。Na512 CrO4为中国原子能研究所产品。杀伤活性(细胞毒性)的计算公式如下：
4.细胞表面标志检测：采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶免疫标法。试剂盒购自军事医学科学院分子免疫室。细胞用1%多聚甲醛及0.01%戊二醛固定液固定30分钟。一抗为上述诸单克隆抗体。染色步骤按试剂盒说明。最后用甘油明胶封固。在光镜下计数1000个细胞。算出阳性细胞率。
5.新鲜肺癌细胞的分离和提纯〔4〕：将手术后新鲜肺癌标本剪成小块，加入消化液(5%小牛血清RPMI含DNase 0.02mg/ml，透明质酸酶0.01ml/ml，胶原酶1mg/ml)，于37℃持续振荡2小时。用筛网除去剩余组织。细胞悬液过Ficoll密度梯度(75%，100%)柱，离心400×g，30分钟。取出第一层细胞，再过Percoll不连续密度梯度柱(10%，15%，25%)。离心25×g，7分钟。取第三层与底层细胞。塑料平皿贴壁30分钟，收集非粘附细胞。加冻存液(含90%人AB血清和10%二甲亚砜)冻存。使用前复苏。
, 百拇医药
以上操作皆在无菌条件下进行。所获细胞用Wright-Giemsa杂色鉴定，肿瘤细胞含量>95%。用0.1%伊文氏兰染色证明95%以上为活细胞。
结 果
一、NK细胞的分离与鉴定
人外周血淋巴细胞经Percoll不连续密度梯度离心后，各层细胞中LGL所占百分比分别为：F17.5%、F250%、F310%、F43%。可见LGL相对集中在F2，而F4中很少。
用51Cr释放法测定各层细胞与外周血淋巴细胞(PBL)对K562细胞的杀伤活性结果见图1。说明F2的NK活性不仅明显高于其他各层，而且高于PBL，而F4的NK活性极低。因此F2细胞被用作NK细胞富集层。F4细胞被用作NK细胞缺失层。
, 百拇医药
图1 Percoll各分层细胞与PBL对K562的杀伤活性
二、rIL2对各层细胞杀伤活性的影响
各层细胞经rIL2培养3天后细胞增殖：F22.78倍，F31.39倍，F42.47倍。对K562(为NK敏感肿瘤细胞)的杀伤活性都有所提高，但仍以培养后的F2细胞活性最高。
表1 rIL2培养前后各层细胞对6例肺癌癌细胞的杀伤活性(51Cr释放百分率) 例号
E：T*
各层细胞
F2NK
, 百拇医药
F4NK
PBL-NK
F2NK
F4NK
PBL-LAK
1
100
4.1
0
3.9
7.2
1.5
, 百拇医药
5.7
2
100
3
1
3
12
0
-
3
100
0
0
0
, 百拇医药
19
12
13
50
4
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0
21
12
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25
0
0
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18
10
4
4
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0
-
10
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5
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0
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23
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6
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注：*为效应细胞数/靶细胞数，“-”为没做
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从图2～4可见，培养前各层细胞对3个NK抵抗肿瘤细胞系的杀伤活性极低，或无杀伤能力。经rIL2培养后都获得了LAK活性(杀伤NK抵抗肿瘤细胞的活性)。其中F2的LAK活性提高明显高于其他各层。
图2，3 各层细胞对NK抵抗肿瘤细胞系的杀伤活性
图4 培养前后各层细胞对NK抵抗肿瘤细胞系的杀伤活性
由表1可见培养前F2及F4细胞均无明显的杀伤新鲜肺癌细胞的作用。经rIL2激活后，对6例新鲜肺癌细胞出现了LAK活性。F2LAK活性不仅高于F4LAK，而且优于rIL2激活的PBL(经典LAK)。
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三、细胞表面标志检测结果
从表2可见，培养前F2中CD16+细胞(NK)相对集中(占47%)。CD3+T淋巴细胞仍占41%。CD8+T细胞占40%。而F4中绝大多数(86%)为CD3+细胞，其中可能以CD4+的辅助性T细胞为主，因后者占60%。F2一F4中B7与DR阳性细胞极少，说明B细胞基本清除干净。
表2 IL-2培养前后F2、F4细胞的表面 F细胞
表面标志阳性率(%)
CD16
, 百拇医药 CD3
CD8
CD4
B7
DR
F2
47 43*
41 40*
40 34*
1
<0.01
<0.01
, 百拇医药
F4
1 1*
86 87*
19 27*
60
<0.01
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*经rIL2培养3天后
经rIL2培养3天后，CD16+与CD8+细胞所占百分比无明显变化。仅F4LAK中CD8+细胞较培养前有所增加。
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四、LGL与LAK细胞的形态
Giensa染色示LGL细胞直径8μm～9μm，核肾形或圆形，胞浆较宽，内有嗜天青颗粒。LAK细胞体积增大，直径约12μm，胞浆中嗜天青颗明显增多。核大，染色质多，核仁明显，核分裂常见。
讨 论
酶标免疫组化法检测表面标志的结果说明F2细胞中CD16+与CD8+者分别占47%与40%，明显高于F4中的1%与19%。有文献报道〔5，6〕，一些CD3+的T细胞，尤其是在激活的情况下，也表现出与NK细胞相似的杀伤活性，称之为“NK样”或非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀伤T细胞。这种细胞同时显示CD8抗原。故本实验的F2细胞中可能相对集中了两种细胞，一种是CD16+的典型NK细胞，另一种是CD8+非MHC限制性杀伤T细胞。
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经rIL2培养3天后，F2LAK对NK抵抗型肿瘤细胞系的杀伤活性增高6～60倍，特别是对部分新分离的人肺癌细胞也出现杀伤活性，而且高于来源自PBL的LAK。F4LAK的活性明显低于F2LAK。
根据以上结果可以推论：F2细胞经rIL2培养后，其产生LAK活性的前身可能兼有CD16+NK细胞与CD8+非MHC限制性杀伤T细胞两种。F4中这两种细胞的原始数量低，所以产生的LAK活性也较低。CD4+胞不可能是LAK前身，否则来源于F4的LAK活性应高于来源于F2者。
F2细胞经rIL2短期培养后，虽然增殖将近三倍，但CD16+与CD8+细胞所占百分数变化不明显，提示LAK的效应细胞也兼有激活的CD16+NK细胞与CD8+杀伤T细胞。LAK细胞比NK细胞体积增大，胞浆颗粒增多，是功能增强的形态学指征。说明LAK活性的出现不是单纯因为前体细胞数量增加，而主要是由于前体细胞经激活后变成识别与杀伤功能都有所增强的LAK效应细胞，而后又繁殖的结果。已有文献报道〔7〕，培养时间延长后效应细胞中激活的Leu 19+细胞(即杀伤性T细胞)增殖较快，CD16+细胞的数量相对下降。在本实验激活的F4细胞中，CD8+细胞增殖的情况已初步显示出这种趋势。
, 百拇医药
以上结果说明，在制备LAK细胞时，培养纯化的CD16+与CD8+细胞有可能提高其功效。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Itoh K, Tilder AB, Balch CM.Lysis of human solid tumor cells by lymphokine-activated killer cells.J Immunology, 1986,136:3910.
2 Grimm EA.Lymphokine activated killer (LAK) cell phenomenon:the precursor phenotype is serologically distinct from peripheral T lymphocytes,memory CTL,and NK cells.J Exp Med, 1983,157:884.
, http://www.100md.com
3 石卫，吴易元，张友会.天然杀伤(NK)细胞活性的测定——125IUDR及51Cr释放试验的比较.中国免疫学杂志，1986，1：14.
4 Uchida A, Mickche M. Lysis of fresh human tumor cells by autologous large granular lymphocytes from peripheral blood and pleural effusions.Int J Cancer, 1983,32:37.
5 Lanier LL.The relationship of CD16 (Leu 11)and Leu 19(NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes.J Immunology,1986,136:4480.
, 百拇医药
6 Hercend T,Schmidt RE.Characteristics and uses of natural killer cells.Immunology Today,1988,9:291.
7 Lefor AT,Mule JJ,Rosenberg SA.Lymphokine-activated killer cells.Biology and therapeutic efficacy.In:Reynolds CW,Wiltrout RH eds.Functions of nalural immune system,New York:Plenum,1989;39-56.
(收稿：1992-07-31 修回：1993-02-20), 百拇医药