冬虫夏草对环孢素A的急慢性肾毒性的防护作用
作者：赵学智 黎磊石
单位：200003上海长征医院肾内科(赵学智)，南京市金陵医院肾脏科(黎磊石)
关键词：环孢霉素类；冬虫夏草；紧病变；显微镜检查，电子
中华医学杂志930708 摘要 为了观察冬虫夏草对环孢素A(CsA)的急慢性肾毒性的防护作用。对CsA不同给药剂量、用药时间鼠的肾组织病理形态作对照研究。急性实验第15天光镜形态观察，见CsA组近曲管上皮细胞大量均一性空泡变性、坏死、细胞崩解脱落；电镜见线粒体严重肿胀，形态异常，虫草治疗组上述改变较轻。微机定量分析证明，CsA组近、远曲管细胞截面积较虫草组小。慢性实验可风了不同取材时间CsA组90%近曲管均有空泡变性及坏死，同时有间质水肿、轻度纤维化，电镜下可见线粒不同程度缩小、变形，虫草组线粒体形态基本正常。组织定量分析显示：在不同实验时间CsA组近、远曲管面积及肾小球相对面积较虫草组小，而间质面积较虫草组为大，随实验时间的延长这种差异愈加明显。
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环孢素A(CsA)肾毒性除致肾功能改变外，组织学改变亦较具特征，受损的主要部位是对缺血非常敏感的皮髓交界处近曲小管，用药剂量及疗程对不同组织损伤程度亦不相同。我国传统中药冬虫夏草(简称虫草)具有刺激体外培养肾小管上皮细胞增殖的作用，提高动物耐缺氧能力，无论对缺血性及药物性肾损害均有明显防护作用。我们对实验15天及3个月大鼠肾组织形态进行研究，并应用微机图象处理系统，定量分析肾小球及近、远曲小管面积，进行对照性研究，以期进一步探讨虫草对CsA肾毒性的保护作用。
材料及方法
一、材料
1.材料来源：雄性SD大鼠(金陵医院动物室提供)；CsA为瑞士Sandoz公司产品；四川产正品天然虫草加工成水溶液(浓度50%)；异博定为江苏江阴制药厂产。
2.动物分组及实验方法：(1)急性实验：大鼠(体重200±30g)被随机分为3组，每组12只，实验15天。CsA组：CsA每天50mg/kg加牛乳中每天上午8～9时给大鼠经口腔灌服；CsA+虫草组：同时灌服虫草水溶液每天1.0g/只，CsA组加等量生理盐水；CsA加异博定组：同时加服异博定每天0.4mg/kg，实验第15天宰杀大鼠取肾组织制片。(2)慢性实验：大鼠(体重180±25g)被随机分为两组，每组26只，实验3个月。CsA组：CsA 30mg/kg隔日灌服；CsA+虫草组：隔日同服虫草水溶液0.5g/只，CsA组加等量生理盐水，分别在实验第2、4、6、12周宰杀大鼠取肾组织制片。
, 百拇医药
3.光、电镜制片：光镜组织为常规石蜡切片，行HE、PAM染色，Olympus显微镜观察；常规电镜制片，JEM-1200 EX透射电镜观察。
4.图象处理系统：Olympus显微镜、摄象机、图象显示器、电子探测器(Mouse)、Boat 386微机及附件，每视野共512×512个点。
二、方法
1.光、电镜观察：分别对肾小球、肾小管、肾血管、间质及上述部位的细胞器进行观察描述，并作组间对照。
2.定量分析：每组取3张切片，每张切片观测多于5个视野。
视野选择标准：在同一视野内观测一个经球门正切的肾小球，同时测球周近、远曲管及间质面积。测量指标：平均每个肾小球所占观测视野的百分面积(%)，每个肾小球绝对面积(光点总数)；平均每个近、远曲管截面占观测视野的百分面积；每个肾小管绝对面积，均为扣除管腔面积后细胞所占面积；肾间质占每视野的百分面积。
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三、统计学处理
所有数据以±s表示，组间差异用t检验。
结 果
一、急性实验组织形态观察及定量分析结果
1.光镜：CsA组可见近曲管细胞内大小均一性空泡变性、坏死、上皮细胞胞浆脱落，重者仅余基底膜，可见细胞内包涵体及微钙化灶，病变以皮髓交界处为重，异博定组病变稍轻，虫草组仅见空泡变性，偶见细胞坏死但范围小。CsA组血管以渗出性病变为主，内皮细胞增生，部分血管壁增厚，轻度透明变，虫草组基本正常。肾小球以充血为主，轻度系膜基质增生，3组无明显差异。CsA组肾间质可见血管充血、间质水肿，而虫草组仅见少量淋巴细胞浸润，无明显水肿(图1，2)。
图1 急性实验CSA组可见较广泛的肾小管细胞空泡变性,坏死,及上皮细胞浆脱落×100
, 百拇医药
图2 急性实验虫草组见轻度空泡变性,偶见细胞坏死 ×400
2.电镜：CsA组线粒体肿胀、嵴模糊，可见外膜破裂，仅剩余含少量嗜饿性结构，亦可见线粒体固缩，内质网高度扩张，细胞核染色质边集、核碎裂、核孔减少或消失，核中电子密度低。虫草组除见线粒体轻度肿胀外未见其他改变。
3.组织定量分析结果(表1)。
表1 急性实验肾组织定量分析结果(±s) 组别
近曲管百分面积(%)
远曲管百分面积(%)
近曲管绝对面积
远曲管绝对面积
肾小球百分面积(%)
, 百拇医药
肾小球绝对面积
肾间质百分面积(%)
CsA组
0.012±0.003
0.024±0.006
760±143*
1292±256*
0.098±0.017
6128±524
0.093±0.018
虫草组
, http://www.100md.com
0.015±0.002
0.036±0.009
965±153
2410±570
0.103±0.012
6381±1574
0.077±0.016
异博定组
0.012±0.002
0.029±0.006
804±100*
, 百拇医药
1916±384△
0.098±0.02
6170±1299
0.079±0.015
CsA及异博定组与虫草组比较△P<0.05 P<0.01
二、慢性实验组织形态观察及定量分析结果
1.光镜：实验第2、4周CsA组各级肾小管均可见空泡变性(近曲管大于90%)及坏死性病变，刷状缘脱落，部分胞浆与基底膜分离，虫草组近曲管见少量空泡变性及单细胞坏死性病变。CsA组肾间质可见水肿及间质出血灶，轻度纤维化，血管病变以内皮细胞增生、肿胀为主，第6周后见透明变性及血客壁轻度增生，CsA组肾小球内可见大量红细胞及丝球体肿胀，上述部分病变在虫草组亦可见到，但较CsA组明显为轻(图3，4)。
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图3 慢性实验CSA组可见肾小管
细胞空泡变性
图4 慢性实验虫草组肾小管结构
基本正常 ×400
2.电镜：CsA组可见线粒体肿胀、嵴排列不规则，变短变小，内质网扩张，虫草组上述病变较轻。
3.组织定量分析结果(表2)。
表2 慢性实验肾组织定量分析结果(±s) 时间
组别
近曲管百分面积(%)
远曲管百分面积(%)
, 百拇医药
近曲管绝对面积
远曲管绝对面积
肾小球百分面积(%)
肾小球绝对面积
肾间质百分面积(%)
第二周
CsA
0.013±0.002
0.034±0.006
880±123△
2110±522△
, 百拇医药 0.091±0.01△
5944±770△
0.106±0.017
虫草
0.014±0.002
0.034±0.006
924±117
2307±457
0.116±0.018
7574±1203
0.1±0.015
, 百拇医药
第四周
CsA
0.018±0.007
0.033±0.004
871±105△
2081±439△
0.099±0.015*
6518±986
0.123±0.016△
虫草
0.018±0.003
, http://www.100md.com
0.044±0.018
1199±223
2894±1150
0.114±0.02
7481±1368
0.084±0.029
第六周
CsA
0.014±0.002
0.035±0.008
898±129
2335±565
, 百拇医药
0.1±0.013
6917±1009
0.136±0.024△
虫草
0.02±0.016
0.037±0.006
999±105
2427±386
0.1±0.018
6675±1171
0.074±0.015
, 百拇医药 第十二周
CsA
0.013±0.003
0.041±0.008
903±181
2719±577
0.111±0.01△
7337±783△
0.14±0.024△
虫草
0.026±0.002
, 百拇医药
0.048±0.017
1063±139
3167±1132
0.137±0.018
8979±1167
0.07±0.027
CsA与同期虫草组比较：P<0.05 △P<0.01
讨 论
CsA所致肾组织形态损伤以对缺血、缺氧最为敏感的皮髓交界处近曲小管损伤为甚。大量实验证明，近曲管细胞胞浆内均一性空泡变性已被认为是CsA肾毒性的特征性改变之一〔1〕 ，这种空泡变性与肾毒性程度相平行，但与肾功能改变程度并不一致〔2〕，这种病理改变作为血泫动力学异常的结果或与血流动力学异常一起共同导致肾功能异常。本实验证明在给大鼠大剂量CsA后，由急性肾毒性引起的病理形态改变基本与上述相符，以近曲管急性病变为主，大量空泡及坏死形成，可见微钙化灶，甚至小管结构消失，只遗留单层基底膜，而虫草组仅见空泡变性，偶见小范围坏死区。电镜观察证实虫草可减轻细胞线粒体肿胀，为以往实验证明的虫草对线粒体膜Na+*K+-ATP、Ca2+-ATP酶活性的改善提供了形态学依据。
, 百拇医药
组织定量分析显示：虫草组肾近、远曲管绝对面积均较对照组为大，有非常显著的统计学意义，与对照组小管细胞变性坏死重，细胞崩解脱落，截面积减少有关，间质面积虫草组低于对照组。Boble等〔3〕对ARF肾组织定量分析中观察到，多尿期近曲管细胞肿胀、面 积增大，而当病变进一步加重，细胞出现不可逆性坏死必病变时其面积较正常对照组明显为小，有显著统计学意义。本实验取材时细胞坏死病变较重，可能处于上述改变的后一阶段。
CsA引起慢性肾毒性作用的组织学改变主要以肾小管萎缩、间质纤维化及血管病变为主要特征〔4〕。在不同实验时期均可见肾小球相对及绝对面积虫草组大于对照组，可能与CsA使肾入球动脉收缩、肾小球灌注减少有关〔5〕。Perico等〔6〕的实验得到相似结果，我们用连续切片的方法，按照不同层次肾小球截面积大小推算肾小球体积，证明CsA组鼠肾小球体积明显小于应用溶媒作对照的鼠肾小球，且这种改变与肾小球滤过率下降呈正相关，说明了肾小球大小与肾血流量变化间的联系。另外的实验发现〔3〕，ARF时肾小球Bowman囊较对照组扩大、球内毛细血管袢面积缩小、肾小球总面积缩小。肾小管间质相对面积在不同实验阶段虫草组均小于CsA组，且随实验时间的延长差异愈加明显，以第4～12周为甚，可能是CsA致慢性间质增生、纤维化的结果。
, 百拇医药
总之，本研究证明虫草对以上病理损害均有改善作用，为虫草的保护性效应提供了形态学依所。
参考文献
1 Hedman,L.Svalander C.Tubular vacuolizalion in kidney graft biopsis in different cyclosporine protocols.Trans-plant Proc,1988,XX[suppl]:722.
2 Mihatsch MJ.Ryffel B,Hermlem,et al.Morphology of cyclosporine nephrotoxicity in the rat.Clin Nephrol,1986,25[suppl l].s2.
3 Boble A,Christensen J,Kokot F,et al.Acute renal failure in man:New aspects concerning pathogenesis.Amorphometric study.Am J Nephrol,1990,10:374.
, 百拇医药
4 Myer B D.Cyclosporine nephrotoxicity.Kidney Int,1986,30:964.
5 English J,Evan A,Houghton DC,et al.Cyclosporine-induced acute renal dysfunction in the rat.Evidence of arteriolar vasoconstriction with preservation of tubular function.Transplantation,1987,44:135.
6 Perico N,Remuzzi A,Imbertio,et al.Morphometrical analysis of glomerular changes induced by cyclosporine in the rat.Am J Kid ney Dis,1991,17:537.
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(收稿：1992-08-22 修回：1993-03-20), 百拇医药
单位：200003上海长征医院肾内科(赵学智)，南京市金陵医院肾脏科(黎磊石)
关键词：环孢霉素类；冬虫夏草；紧病变；显微镜检查，电子
中华医学杂志930708 摘要 为了观察冬虫夏草对环孢素A(CsA)的急慢性肾毒性的防护作用。对CsA不同给药剂量、用药时间鼠的肾组织病理形态作对照研究。急性实验第15天光镜形态观察，见CsA组近曲管上皮细胞大量均一性空泡变性、坏死、细胞崩解脱落；电镜见线粒体严重肿胀，形态异常，虫草治疗组上述改变较轻。微机定量分析证明，CsA组近、远曲管细胞截面积较虫草组小。慢性实验可风了不同取材时间CsA组90%近曲管均有空泡变性及坏死，同时有间质水肿、轻度纤维化，电镜下可见线粒不同程度缩小、变形，虫草组线粒体形态基本正常。组织定量分析显示：在不同实验时间CsA组近、远曲管面积及肾小球相对面积较虫草组小，而间质面积较虫草组为大，随实验时间的延长这种差异愈加明显。
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环孢素A(CsA)肾毒性除致肾功能改变外，组织学改变亦较具特征，受损的主要部位是对缺血非常敏感的皮髓交界处近曲小管，用药剂量及疗程对不同组织损伤程度亦不相同。我国传统中药冬虫夏草(简称虫草)具有刺激体外培养肾小管上皮细胞增殖的作用，提高动物耐缺氧能力，无论对缺血性及药物性肾损害均有明显防护作用。我们对实验15天及3个月大鼠肾组织形态进行研究，并应用微机图象处理系统，定量分析肾小球及近、远曲小管面积，进行对照性研究，以期进一步探讨虫草对CsA肾毒性的保护作用。
材料及方法
一、材料
1.材料来源：雄性SD大鼠(金陵医院动物室提供)；CsA为瑞士Sandoz公司产品；四川产正品天然虫草加工成水溶液(浓度50%)；异博定为江苏江阴制药厂产。
2.动物分组及实验方法：(1)急性实验：大鼠(体重200±30g)被随机分为3组，每组12只，实验15天。CsA组：CsA每天50mg/kg加牛乳中每天上午8～9时给大鼠经口腔灌服；CsA+虫草组：同时灌服虫草水溶液每天1.0g/只，CsA组加等量生理盐水；CsA加异博定组：同时加服异博定每天0.4mg/kg，实验第15天宰杀大鼠取肾组织制片。(2)慢性实验：大鼠(体重180±25g)被随机分为两组，每组26只，实验3个月。CsA组：CsA 30mg/kg隔日灌服；CsA+虫草组：隔日同服虫草水溶液0.5g/只，CsA组加等量生理盐水，分别在实验第2、4、6、12周宰杀大鼠取肾组织制片。
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3.光、电镜制片：光镜组织为常规石蜡切片，行HE、PAM染色，Olympus显微镜观察；常规电镜制片，JEM-1200 EX透射电镜观察。
4.图象处理系统：Olympus显微镜、摄象机、图象显示器、电子探测器(Mouse)、Boat 386微机及附件，每视野共512×512个点。
二、方法
1.光、电镜观察：分别对肾小球、肾小管、肾血管、间质及上述部位的细胞器进行观察描述，并作组间对照。
2.定量分析：每组取3张切片，每张切片观测多于5个视野。
视野选择标准：在同一视野内观测一个经球门正切的肾小球，同时测球周近、远曲管及间质面积。测量指标：平均每个肾小球所占观测视野的百分面积(%)，每个肾小球绝对面积(光点总数)；平均每个近、远曲管截面占观测视野的百分面积；每个肾小管绝对面积，均为扣除管腔面积后细胞所占面积；肾间质占每视野的百分面积。
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三、统计学处理
所有数据以±s表示，组间差异用t检验。
结 果
一、急性实验组织形态观察及定量分析结果
1.光镜：CsA组可见近曲管细胞内大小均一性空泡变性、坏死、上皮细胞胞浆脱落，重者仅余基底膜，可见细胞内包涵体及微钙化灶，病变以皮髓交界处为重，异博定组病变稍轻，虫草组仅见空泡变性，偶见细胞坏死但范围小。CsA组血管以渗出性病变为主，内皮细胞增生，部分血管壁增厚，轻度透明变，虫草组基本正常。肾小球以充血为主，轻度系膜基质增生，3组无明显差异。CsA组肾间质可见血管充血、间质水肿，而虫草组仅见少量淋巴细胞浸润，无明显水肿(图1，2)。
图1 急性实验CSA组可见较广泛的肾小管细胞空泡变性,坏死,及上皮细胞浆脱落×100
, 百拇医药
图2 急性实验虫草组见轻度空泡变性,偶见细胞坏死 ×400
2.电镜：CsA组线粒体肿胀、嵴模糊，可见外膜破裂，仅剩余含少量嗜饿性结构，亦可见线粒体固缩，内质网高度扩张，细胞核染色质边集、核碎裂、核孔减少或消失，核中电子密度低。虫草组除见线粒体轻度肿胀外未见其他改变。
3.组织定量分析结果(表1)。
表1 急性实验肾组织定量分析结果(±s) 组别
近曲管百分面积(%)
远曲管百分面积(%)
近曲管绝对面积
远曲管绝对面积
肾小球百分面积(%)
, 百拇医药
肾小球绝对面积
肾间质百分面积(%)
CsA组
0.012±0.003
0.024±0.006
760±143*
1292±256*
0.098±0.017
6128±524
0.093±0.018
虫草组
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0.015±0.002
0.036±0.009
965±153
2410±570
0.103±0.012
6381±1574
0.077±0.016
异博定组
0.012±0.002
0.029±0.006
804±100*
, 百拇医药
1916±384△
0.098±0.02
6170±1299
0.079±0.015
CsA及异博定组与虫草组比较△P<0.05 P<0.01
二、慢性实验组织形态观察及定量分析结果
1.光镜：实验第2、4周CsA组各级肾小管均可见空泡变性(近曲管大于90%)及坏死性病变，刷状缘脱落，部分胞浆与基底膜分离，虫草组近曲管见少量空泡变性及单细胞坏死性病变。CsA组肾间质可见水肿及间质出血灶，轻度纤维化，血管病变以内皮细胞增生、肿胀为主，第6周后见透明变性及血客壁轻度增生，CsA组肾小球内可见大量红细胞及丝球体肿胀，上述部分病变在虫草组亦可见到，但较CsA组明显为轻(图3，4)。
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图3 慢性实验CSA组可见肾小管
细胞空泡变性
图4 慢性实验虫草组肾小管结构
基本正常 ×400
2.电镜：CsA组可见线粒体肿胀、嵴排列不规则，变短变小，内质网扩张，虫草组上述病变较轻。
3.组织定量分析结果(表2)。
表2 慢性实验肾组织定量分析结果(±s) 时间
组别
近曲管百分面积(%)
远曲管百分面积(%)
, 百拇医药
近曲管绝对面积
远曲管绝对面积
肾小球百分面积(%)
肾小球绝对面积
肾间质百分面积(%)
第二周
CsA
0.013±0.002
0.034±0.006
880±123△
2110±522△
, 百拇医药 0.091±0.01△
5944±770△
0.106±0.017
虫草
0.014±0.002
0.034±0.006
924±117
2307±457
0.116±0.018
7574±1203
0.1±0.015
, 百拇医药
第四周
CsA
0.018±0.007
0.033±0.004
871±105△
2081±439△
0.099±0.015*
6518±986
0.123±0.016△
虫草
0.018±0.003
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0.044±0.018
1199±223
2894±1150
0.114±0.02
7481±1368
0.084±0.029
第六周
CsA
0.014±0.002
0.035±0.008
898±129
2335±565
, 百拇医药
0.1±0.013
6917±1009
0.136±0.024△
虫草
0.02±0.016
0.037±0.006
999±105
2427±386
0.1±0.018
6675±1171
0.074±0.015
, 百拇医药 第十二周
CsA
0.013±0.003
0.041±0.008
903±181
2719±577
0.111±0.01△
7337±783△
0.14±0.024△
虫草
0.026±0.002
, 百拇医药
0.048±0.017
1063±139
3167±1132
0.137±0.018
8979±1167
0.07±0.027
CsA与同期虫草组比较：P<0.05 △P<0.01
讨 论
CsA所致肾组织形态损伤以对缺血、缺氧最为敏感的皮髓交界处近曲小管损伤为甚。大量实验证明，近曲管细胞胞浆内均一性空泡变性已被认为是CsA肾毒性的特征性改变之一〔1〕 ，这种空泡变性与肾毒性程度相平行，但与肾功能改变程度并不一致〔2〕，这种病理改变作为血泫动力学异常的结果或与血流动力学异常一起共同导致肾功能异常。本实验证明在给大鼠大剂量CsA后，由急性肾毒性引起的病理形态改变基本与上述相符，以近曲管急性病变为主，大量空泡及坏死形成，可见微钙化灶，甚至小管结构消失，只遗留单层基底膜，而虫草组仅见空泡变性，偶见小范围坏死区。电镜观察证实虫草可减轻细胞线粒体肿胀，为以往实验证明的虫草对线粒体膜Na+*K+-ATP、Ca2+-ATP酶活性的改善提供了形态学依据。
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组织定量分析显示：虫草组肾近、远曲管绝对面积均较对照组为大，有非常显著的统计学意义，与对照组小管细胞变性坏死重，细胞崩解脱落，截面积减少有关，间质面积虫草组低于对照组。Boble等〔3〕对ARF肾组织定量分析中观察到，多尿期近曲管细胞肿胀、面 积增大，而当病变进一步加重，细胞出现不可逆性坏死必病变时其面积较正常对照组明显为小，有显著统计学意义。本实验取材时细胞坏死病变较重，可能处于上述改变的后一阶段。
CsA引起慢性肾毒性作用的组织学改变主要以肾小管萎缩、间质纤维化及血管病变为主要特征〔4〕。在不同实验时期均可见肾小球相对及绝对面积虫草组大于对照组，可能与CsA使肾入球动脉收缩、肾小球灌注减少有关〔5〕。Perico等〔6〕的实验得到相似结果，我们用连续切片的方法，按照不同层次肾小球截面积大小推算肾小球体积，证明CsA组鼠肾小球体积明显小于应用溶媒作对照的鼠肾小球，且这种改变与肾小球滤过率下降呈正相关，说明了肾小球大小与肾血流量变化间的联系。另外的实验发现〔3〕，ARF时肾小球Bowman囊较对照组扩大、球内毛细血管袢面积缩小、肾小球总面积缩小。肾小管间质相对面积在不同实验阶段虫草组均小于CsA组，且随实验时间的延长差异愈加明显，以第4～12周为甚，可能是CsA致慢性间质增生、纤维化的结果。
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总之，本研究证明虫草对以上病理损害均有改善作用，为虫草的保护性效应提供了形态学依所。
参考文献
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(收稿：1992-08-22 修回：1993-03-20), 百拇医药