先天性心脏病家系心室肌球蛋白轻链1基因的限制酶切片段长度多态性分析
作者：王永业 Geouge Jackowski Qinwei Shi
单位：030001 太原，山西医学院生物学教研室(王永业)，加拿大多伦多儿童医院(Geouge Jackowski Qinwei Shi)
关键词：心脏缺损，先天性；肌球蛋白；限制酶切片段长度多态性
中华医学杂志940406.htm 摘要 利用人心室肌球蛋白轻链1cDNA探针对先天性心脏病患者家系心室肌球蛋白轻链1基因进行了限制酶切片段长度多态性分析。从患有4种不同先天性心脏病的9个家系40名成员和13例无血缘关系患者的分析结果，发现有2个家系呈现限制性酶切片段多态性，但这种限制性酶切片段多态性似与先天性心脏病的发生没有联系。
心室肌球蛋白轻链1(ventricular myosin light chain 1 ，VMLC1)是人心室肌中主要的肌球蛋白轻链[1]。我们曾由91例患有不同类型的先天性心脏病(CHD)患儿的心脏活检中发现，其中27%的心房肌球蛋白含有心室肌球蛋白轻链。在所研究的室间隔缺损(VSD)和法乐氏四联症(TOF)的患者中，有50%在心房中检出心室肌球蛋白轻链[2]。因此设想，CHD患者中VMLC1基因在心房的异常高表达，很可能是由于VMLC1基因的突变，特别是基因的组织特异性调控区的突变所致。为此，我们对CHD家系进行了限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析，现将结果报道如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.样品来源：受检对象共53例，均为加拿大籍人。其中17名正常人，16例VSD、8例TOF、5例房间隔缺损(ASD)患者和7例肺动脉瓣狭窄(PS)患者。其中40例来自9个家系(家系1-9)，其余13例为无血缘关系患者。
按Boyum[3]经Wottawa等[4]改良的方法，分别取各成员的静脉血，分离其白细胞。由白细胞分离基因组DNA[5]。
2.基因组DNA的RFLP分析：探针选用我们构建的人VMLC1 cDNA克隆[6]，PstI切割并标记[7]，以离心柱层析技术分离出标记的人VMLC1 cDNA探针[8]。取10μg基因组DNA，限制酶按5U/μgDNA进行保温消化过夜。酶解后以1%琼脂糖凝胶进行电泳分离、变性、转移至硝酸纤维素膜(bio-rad)、进行Southern印迹杂交和放射自显影[9]。
, 百拇医药 结 果
经MspI、PstI、XbaI、BamHI、HaeIII、Bg1I、Bg1II以及SacI等8种限制性内切酶进行酶解，结果发现，只有MspI和PstI的酶切图谱呈现RFLP。在53例受检者中只有4例发现RFLP阳性。其中3例为VSD患者，1名为正常人。在3例VSD患者中有2例为同一个家系。在该家系的7个子女中，就有6个患VSD，其中2个患儿具有MspI的RFLP(图1A)，1个患儿同时还具有PstI的RFLP(图1B)，其余成员包括双亲在内均不表现RFLP阳性。
家系2-5以及13例无血缘关系患者的酶谱分析结果，由于不呈现有RFLP阳性故从略。而家系7-9也不呈现RFLP，但与家系6一起进行实验，其结果见图2。
在家系6中，有2人，即母亲(正常人)及其子(VSD患者)呈现PstI的RFLP阳性(图2)。
, 百拇医药
A：MspI酶解图型 B：PstI酶解图型
图1 为一个VSD家系(家系1)VMLC1基因RFLP放射自显影图。A和B的右边第2泳道分别出现一个1.1kb和一个2.0kb的额外区带；A的左边第四泳道出现一个1.7kb和一个0.6kb二个额外区带，而在B中则为正常图型(○：女性；□：男性；：女性患者；：男性患者)
图2 4个不同CHD家系(家系6-9)VMLC1基因RFLP放射自显影图，家系6的母亲及其儿子均呈现一个390bp的额外区带讨 论
我们用人VMLC1 cDNA作探针，对患有不同CHD的9个家系的40名成员和13例无关患者进行了VMLC1基因的RFLP分析。研究中所使用的主要限制性内切酶有MspI、PstI以及XbaI等。在所分析的一个VSD家系的7个子女中就有6个为VSD患者，因此，该家系的遗传因素似乎起着重要的作用。然而经检测，在该家系的9个成员中，只有2个患VSD同胞发现RFLP，而双亲和其余5个同胞，尽管母亲与其余4个同胞都是VSD患者，但均未检出RFLP。提示，2个VSD同胞的RFLP不是由双亲遗传来的，而且这种RFLP的存在与VSD的发生也没有联系。
, 百拇医药
在所分析的另一家系(图2)的3个成员中，父亲和儿子为VSD患者，母亲为正常人，但结果儿子和母亲呈现相同特点的RFLP，而患有VSD的父亲却不呈现这种RFLP，这一结果提示，该家系的这种RFLP是可遗传的，但与VSD的发生也无联系。
由于我们进行RFLP分析所使用的探针是人VMLC1 cDNA探针，此探针仅含有VMLC1基因的编码序列，因此所检测的RFLP可能只反映包括VMLC1基因内含子和外显子在内的结构区的突变，而对于发生在该基因5′-调控区的突变就未能检出，值得进一步研究。
此外，Southern印迹技术有一定的局限性：(1)位于限制性内切酶识别位点以外的点突变，应用Southern印迹技术难于检出；而如果这种点突变是发生在基因的重要的顺式调节元件之内的点突变，也能引起基因的异常表达；(2)由于琼脂糖凝胶电泳的分辨度的限制，对于基因序列中小的插入或缺失性突变也难以检出；(3)由于从患者获得的DNA样品量的限制，不允许试用尽可能多种的限制性内切酶。应当指出，某一种限制酶不存在RFLP，并不意味着其他的限制酶的RFLP也不存在。
, 百拇医药
参考文献
1.Barton P J, Cohen A, Robert B, et al. The myosin alkali light chains of mouse ventricular and slow skeletal muscle are indistinguishable and are encoded by the same gene. JBiol Chem, 1985，260：8578
2.Shi QW, Danilczyk U, Wang JX, et al. Expression of ventricular myosin subunits in the atria of children with congenital heart malformations. Cire Res, 1991，69：1601
3.Boyum A. Isolation of mononrclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monouclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation ag lg. Scand JClin Lab Invest, 1986，21[Supp1 97]：77
, 百拇医药
4.Wottawa A, Klein G, Altmann H. Eine Methode Zur Isolierung menschllcher, und tierischer Lymphozyten mit Ficoll-Urografin. Wien Klin Wochenschr, 1974，86：161
5.Lehrach H, Diamond D, Wozney JM, et al. RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions：a critical reexamination.Biochemistry, 1977，16：4743
6.Hoffmann E, Shi QW, Floroff M, et al. Molecular cloning and complete nucleotide sequence of a human ventricular myosin light chain 1. Nucleic Acids Res, 1986，137：266
, 百拇医药
7.Feinberg AP, Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Addendum. Anal Biochem, 1984，137：266
8.Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1982
9.Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol, 1975，98：503
(收稿：1993-05-20 修回：1993-12-20), 百拇医药
单位：030001 太原，山西医学院生物学教研室(王永业)，加拿大多伦多儿童医院(Geouge Jackowski Qinwei Shi)
关键词：心脏缺损，先天性；肌球蛋白；限制酶切片段长度多态性
中华医学杂志940406.htm 摘要 利用人心室肌球蛋白轻链1cDNA探针对先天性心脏病患者家系心室肌球蛋白轻链1基因进行了限制酶切片段长度多态性分析。从患有4种不同先天性心脏病的9个家系40名成员和13例无血缘关系患者的分析结果，发现有2个家系呈现限制性酶切片段多态性，但这种限制性酶切片段多态性似与先天性心脏病的发生没有联系。
心室肌球蛋白轻链1(ventricular myosin light chain 1 ，VMLC1)是人心室肌中主要的肌球蛋白轻链[1]。我们曾由91例患有不同类型的先天性心脏病(CHD)患儿的心脏活检中发现，其中27%的心房肌球蛋白含有心室肌球蛋白轻链。在所研究的室间隔缺损(VSD)和法乐氏四联症(TOF)的患者中，有50%在心房中检出心室肌球蛋白轻链[2]。因此设想，CHD患者中VMLC1基因在心房的异常高表达，很可能是由于VMLC1基因的突变，特别是基因的组织特异性调控区的突变所致。为此，我们对CHD家系进行了限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析，现将结果报道如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.样品来源：受检对象共53例，均为加拿大籍人。其中17名正常人，16例VSD、8例TOF、5例房间隔缺损(ASD)患者和7例肺动脉瓣狭窄(PS)患者。其中40例来自9个家系(家系1-9)，其余13例为无血缘关系患者。
按Boyum[3]经Wottawa等[4]改良的方法，分别取各成员的静脉血，分离其白细胞。由白细胞分离基因组DNA[5]。
2.基因组DNA的RFLP分析：探针选用我们构建的人VMLC1 cDNA克隆[6]，PstI切割并标记[7]，以离心柱层析技术分离出标记的人VMLC1 cDNA探针[8]。取10μg基因组DNA，限制酶按5U/μgDNA进行保温消化过夜。酶解后以1%琼脂糖凝胶进行电泳分离、变性、转移至硝酸纤维素膜(bio-rad)、进行Southern印迹杂交和放射自显影[9]。
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经MspI、PstI、XbaI、BamHI、HaeIII、Bg1I、Bg1II以及SacI等8种限制性内切酶进行酶解，结果发现，只有MspI和PstI的酶切图谱呈现RFLP。在53例受检者中只有4例发现RFLP阳性。其中3例为VSD患者，1名为正常人。在3例VSD患者中有2例为同一个家系。在该家系的7个子女中，就有6个患VSD，其中2个患儿具有MspI的RFLP(图1A)，1个患儿同时还具有PstI的RFLP(图1B)，其余成员包括双亲在内均不表现RFLP阳性。
家系2-5以及13例无血缘关系患者的酶谱分析结果，由于不呈现有RFLP阳性故从略。而家系7-9也不呈现RFLP，但与家系6一起进行实验，其结果见图2。
在家系6中，有2人，即母亲(正常人)及其子(VSD患者)呈现PstI的RFLP阳性(图2)。
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A：MspI酶解图型 B：PstI酶解图型
图1 为一个VSD家系(家系1)VMLC1基因RFLP放射自显影图。A和B的右边第2泳道分别出现一个1.1kb和一个2.0kb的额外区带；A的左边第四泳道出现一个1.7kb和一个0.6kb二个额外区带，而在B中则为正常图型(○：女性；□：男性；：女性患者；：男性患者)
图2 4个不同CHD家系(家系6-9)VMLC1基因RFLP放射自显影图，家系6的母亲及其儿子均呈现一个390bp的额外区带讨 论
我们用人VMLC1 cDNA作探针，对患有不同CHD的9个家系的40名成员和13例无关患者进行了VMLC1基因的RFLP分析。研究中所使用的主要限制性内切酶有MspI、PstI以及XbaI等。在所分析的一个VSD家系的7个子女中就有6个为VSD患者，因此，该家系的遗传因素似乎起着重要的作用。然而经检测，在该家系的9个成员中，只有2个患VSD同胞发现RFLP，而双亲和其余5个同胞，尽管母亲与其余4个同胞都是VSD患者，但均未检出RFLP。提示，2个VSD同胞的RFLP不是由双亲遗传来的，而且这种RFLP的存在与VSD的发生也没有联系。
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在所分析的另一家系(图2)的3个成员中，父亲和儿子为VSD患者，母亲为正常人，但结果儿子和母亲呈现相同特点的RFLP，而患有VSD的父亲却不呈现这种RFLP，这一结果提示，该家系的这种RFLP是可遗传的，但与VSD的发生也无联系。
由于我们进行RFLP分析所使用的探针是人VMLC1 cDNA探针，此探针仅含有VMLC1基因的编码序列，因此所检测的RFLP可能只反映包括VMLC1基因内含子和外显子在内的结构区的突变，而对于发生在该基因5′-调控区的突变就未能检出，值得进一步研究。
此外，Southern印迹技术有一定的局限性：(1)位于限制性内切酶识别位点以外的点突变，应用Southern印迹技术难于检出；而如果这种点突变是发生在基因的重要的顺式调节元件之内的点突变，也能引起基因的异常表达；(2)由于琼脂糖凝胶电泳的分辨度的限制，对于基因序列中小的插入或缺失性突变也难以检出；(3)由于从患者获得的DNA样品量的限制，不允许试用尽可能多种的限制性内切酶。应当指出，某一种限制酶不存在RFLP，并不意味着其他的限制酶的RFLP也不存在。
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参考文献
1.Barton P J, Cohen A, Robert B, et al. The myosin alkali light chains of mouse ventricular and slow skeletal muscle are indistinguishable and are encoded by the same gene. JBiol Chem, 1985，260：8578
2.Shi QW, Danilczyk U, Wang JX, et al. Expression of ventricular myosin subunits in the atria of children with congenital heart malformations. Cire Res, 1991，69：1601
3.Boyum A. Isolation of mononrclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monouclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation ag lg. Scand JClin Lab Invest, 1986，21[Supp1 97]：77
, 百拇医药
4.Wottawa A, Klein G, Altmann H. Eine Methode Zur Isolierung menschllcher, und tierischer Lymphozyten mit Ficoll-Urografin. Wien Klin Wochenschr, 1974，86：161
5.Lehrach H, Diamond D, Wozney JM, et al. RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions：a critical reexamination.Biochemistry, 1977，16：4743
6.Hoffmann E, Shi QW, Floroff M, et al. Molecular cloning and complete nucleotide sequence of a human ventricular myosin light chain 1. Nucleic Acids Res, 1986，137：266
, 百拇医药
7.Feinberg AP, Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Addendum. Anal Biochem, 1984，137：266
8.Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1982
9.Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol, 1975，98：503
(收稿：1993-05-20 修回：1993-12-20), 百拇医药