精子发生相关基因DYS1的分析
作者：周作民 沙家豪 林 敏 王黎熔 周亚东 朱 虎
单位：南京医科大学组织学胚胎学教研室，南京 210029
关键词：无精子症；无精子症因子；DYS1基因；多聚酶链反应
解剖学报980116
摘 要 用PCR方法检测了核型正常(46，XY)的95例无精子症患者和35例严重少精
子症患者基因组DNA中的DYS1，发现4例无精子症患者有DYS1的丢失，严重少精子
患者中发现3例有DYS1的丢失。结果表明：应用PCR法检测DYS1基因片段是切实可行
的，对无精子症和严重少精子症患者的病因诊断具有一定的应用价值。
, 百拇医药
精子发生受到基因的调控，由于有关基因的丢失可导致生精障碍，出现严重少精
子或无精子，因此称之为无精子症因子(azoospermia factor, AZF)[1～3]。已经证明AZF位
于Y染色体上，是一个基因家族，许多基因与其有关，其中DYS1基因为重要的候选成
分[4,5]，并已发现部分无精子症或严重少精子症的患者基因组DNA中有DYS1的丢失[5]。
由于DYS1片段较小，其丢失在常规的染色体核型分析中不易发现，往往难以诊断。
PCR方法的发展为这一基因片段的检测创造了条件。本研究应用PCR法检测严重少精子
, 百拇医药
症或无精子症男子基因组DNA中的DYS1基因，获得了较为满意的结果，现报道如下。
材料和方法
1.病例选择
130例男性不育患者均来自不育专科门诊，根据WHO的标准，连续3次精液常规分
析，均确诊为无精子症或严重少精子症。其中无明确病因的无精子症患者95例，严重
少精子症患者35例，常规染色体核型分析均为正常(46，XY)。正常对照为50例已生育
男子，精子数>6000万/ml。
2.实验方法
, http://www.100md.com
2.1 模板DNA的提取：抽取患者静脉血1ml，抗凝，分离白细胞，经蛋白酶K处理，常规盐析法提取DNA。
2.2 寡核苷酸引物：寡核苷酸引物采用DYS1和ZFX/Y两对，DYS1扩增采用Vollrath
等[4]人设计的引物，为：
5′-TGTCACACTGCCCTAATCCT-3′和
5′-TGGTCATGACAAAAGACGAA-3′，扩增产物为132bp。ZFX/Y能扩增人X和Y染色体的部分序列，采用Asen[6]于1990年设计
的引物，为:
5′-ATAA TCACATGGAGAGCCACAAGCT-3′和
, 百拇医药
5′-GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAGT-3′，扩增产物为445bp，在本实验中作为阳性对照。(以上引物均由英国Glasgow大学的
O′ShaughnessyP J教授馈赠)
2.3 多聚酶链式反应(PCR)：反应总体积为30μl(50mmol/L KCl, 3mmol/L MgCl2,10mmol/L Tris-HCl, pH8.3,0.5U Taq DNA多聚酶，200nmol/L引物×2，40μmol/L
dNTPs，石蜡油封盖后，96.6℃变性3min。PCR反应条件为96℃变性30s，55℃退火75s，73℃延伸60s，反应共30个循环。
2.4 扩增产物的电泳：取扩增产物15μl，加入含溴酚蓝的载样缓冲液3μl，充分混
, 百拇医药
匀后点样于1.2%琼脂糖凝胶(内含1%的溴化乙锭)，30V，电泳1h，紫外灯下观察扩增条
带。
结 果
电泳结果显示，正常有生育能力男子(精子数>6 000万/ml)均可见ZFX/Y和DYS1扩
增片段。95例无精子症患者中，4例仅见ZFX/Y扩增片段，示DYS1基因的丢失或突变(附
图)。35例严重少精子症男子中，也发现3例患者有DYS1基因的丢失。
附图 电泳示正常男子(a)和部分患者(b-k)DYS1基因PCR扩增产物，其中i号患者有DYS1
的丢失
, http://www.100md.com
FigureElectrophoresis showing PCR products of DYS1 gene in normal manand some patients.
No.i patient having the deletion of DYS1.
讨 论
育龄夫妇中，约有10%患有不育症，其中一个重要的原因是男方生精障碍，表现为
严重少精子或无精子，约占不育男子的10%。除输精管道阻塞、腮腺炎病毒感染等明确
病因外，相当一部分患者找不出原因，给诊治带来困难。分子生物学技术的发展为从分
子水平探讨无精子症的病因创造了条件。早在1976年Tiepolo和Zuffardi[1]就提出在Yq11
, 百拇医药
上存在着“Y染色体精子生成基因”，由于许多男性无精子症患者均有Yq11的异常，故
将其称为“无精子症因子(azoospermia factor, AZF)”。1986年，Vergnaud[7]应用Y染色体
的质粒克隆DNA作为探针，分析Y染色体明显异常的患者，包括46，XX的男性，真两性
畸形和Y染色体长臂缺失的病例，建立了Y染色体的基因缺失图谱，为Y染色体上的基因
分析创造了条件。接着其他一些学者[2,4]也建立了Y染色体基因缺失图谱，并列出了Y染
色体上各基因片段的PCR引物序列，为用PCR方法检测Y染色体上的精子发生基因带来
, 百拇医药 了极大的方便。他们的结果发现，无精子症患者的基因缺失均发生于Y染色体的长臂，主要位于Yq11、23上，而且并非是单一基因，可能是含有多个基因片段的大家族。目
前已证明，Yq11、23中多个基因片段的丢失均可引起生精障碍[8]。但哪一个或哪几个基
因属于AZF尚未确定。1992年，我国留英学者马昆[9,10]从不育患者睾丸中分离出YRRM
基因家族，并从中克隆出两个单一基因，称为YRRM1和YRRM2，同时发现无精子症患
者和严重少精子症患者有YRRM1的丢失。我们亦发现在无精子症患者和严重少精子症
患者中有YRRM1的丢失(待发表)。Nagafuchi[5]和Kobayashi等[8]的研究发现，除YRRM
, http://www.100md.com
外，在Y染色体上还含有多个与生精相关的基因片段，主要位于DYS7c和DYS1之间。
本室曾检测了无精子症患者的DYS240基因，发现部分患者有该基因的丢失(待发表)。
本研究选择该区域内另一基因DYS1进行检测，在50例正常有生育能力男子中均有DYS1
的存在，在95例无精子症患者中发现4例有DYS1的丢失，在35例严重少精子症患者中，3例有DYS1的丢失，说明DYS1极可能为AZF的重要候选成分。
对于AZF的检测，可用Southern Blot的方法，选择合适的探针进行基因组DNA的分
析[7]。该方法需特异探针，方法较为繁琐，且不易大范围的推广应用。而PCR方法具有
, 百拇医药
方便、迅速、成本低的优点[5,8]，应用复合PCR的方法还可将多个与AZF有关的基因同
时扩增以适应临床检测的需要。本实验结果表明，用PCR方法检测DYS1基因片段是切
实可行的，对于临床诊治无精子症或严重少精子症患者具有指导意义，本室正着手建立
复合PCR方法，以便于临床应用。
收稿1997-02 修回 1997-06
参 考 文 献
[1] Tiepolo L, ZuffardiO. Localization of factors controlling spermatogenesis in thenonflu-
, http://www.100md.com
ore-scent portion of the human Ychromosome long arm. Hum Genet, 1976, 34(1):119
[2] Andersson M, Page DC, Pettay D, et al. Y autosometranslocation and mosaicism in the
etiology of 45X maleness: assignment offertility factor to distal Yq11. Hum Genet,1988, 79(1):2
[3] Vogt G, Chandley AC, Hargreave TB, et al. Microdeletion ininterval 6 of the Y chromoso-
me of males with idiopathic sertilitypoint to disruption of AZF, a human spermatogenesis
, 百拇医药
gene. Hum Genet, 1992, 89(5):491
[4] Vollrath D, Foote S, Hilton A, et al.The human Y chromosome:a 43-interval map based
on naturally occuring deletions. Science,1996, 258(2):52
[5] Nagafuchi S, Namiki M, Nakahori Y, et al. A minute deletionof the Y chromosome in men
with azoospermia.J Urol, 1993,150(5):1155
[6] Asen E, Medrano JF. Amplification of the ZFY and ZFX genesfor sex identification in
, http://www.100md.com
humans, cattle, sheep and goats. BioTechnol, 1990,8(5):1270
[7] Vergnaud G, Page DC, Simmler ML, et al. A deletion map of thehuman Y chromosome
based on DNA hybridization. Am J HumGenet, 1986, 38(2):109
[8] Kobayashi K, Mizuno K, Hida A, et al. PCR analysis of the Ychromosome long arm in
azoospermic patients:evidence for a secondlocus required for spermatogenesis Hum Mol
, 百拇医药
Genet, 1994, 3(11):1965
[9] Ma K, Sharkey A, et al. Towards the molecular localization ofthe AZF locus:mapping of
microdeletion in azoospermic men within 14subintervals of interval 6 of the human Y
chromosome. Hum Mol Genet, 1992,1(1):29
[10] Ma K, John D, et al. A Y chromosome gene family withRNA-binding protein homology.
, http://www.100md.com Candidates for the azoospermia factor AZFcontrolling human spermatogenesis. Cell,1993, 75(31):1287
ANALYSISOF DYS1 GENE RELATING TO SPERMATOGENESIS
ZhouZuomin△,Sha Jiahao, Lin Min, Wang Lirong, ZhouYadong,Zhu Hu
(Departmentof Histology and Embryology, Nanjing Medical University, Nanjing)
DYS1 is one of the improtant candidatesfor azoospermia factor (AZF). It has been proved
, 百拇医药
that the deletion of DYS1 could cause azoospermia or severeoligospermia. In this paper, PCR
was used to analyse DYS1 gene in 95 azoospermic men and 35oligospermic men with a cytol-
ogically normal Y chromosome. DYS1 deletion was found in 4azoospermic men. In iligospe-
rmic men, 3 DYS1 deletions were found. The results indicated thatPCR assay might be used to
, http://www.100md.com analyse DYS1 gene that is very useful for clinical diagnosis ofazoospermia and oligospermia. KEY WORDS Azoospermia;Azoospermiafactor; DYS1 gene, PCR
________________________
△Department of Histology and Embryology,Nanjing Medical University, Nanjing, 210029，China
《解剖学报》编辑委员会
顾 问 杨 进
, 百拇医药
主 编 章静波
副主编 徐群渊 孙品伟 许增禄 于恩华
编 委 贲长恩 蔡文琴 陈尔瑜 董新文高英茂 郭仁强 郭畹华 韩永坚 何素云
胡人义 姜均本 鞠 躬 刘 斌 饶志仁石玉秀 苏慧慈 田竟生 王国英
王云祥 吴晋宝 吴良芳 吴新智 张世馥张为龙 周长满 周明华 朱长庚
宗书东 左焕琛
(以姓氏汉语拼音为序), 百拇医药
单位：南京医科大学组织学胚胎学教研室，南京 210029
关键词：无精子症；无精子症因子；DYS1基因；多聚酶链反应
解剖学报980116
摘 要 用PCR方法检测了核型正常(46，XY)的95例无精子症患者和35例严重少精
子症患者基因组DNA中的DYS1，发现4例无精子症患者有DYS1的丢失，严重少精子
患者中发现3例有DYS1的丢失。结果表明：应用PCR法检测DYS1基因片段是切实可行
的，对无精子症和严重少精子症患者的病因诊断具有一定的应用价值。
, 百拇医药
精子发生受到基因的调控，由于有关基因的丢失可导致生精障碍，出现严重少精
子或无精子，因此称之为无精子症因子(azoospermia factor, AZF)[1～3]。已经证明AZF位
于Y染色体上，是一个基因家族，许多基因与其有关，其中DYS1基因为重要的候选成
分[4,5]，并已发现部分无精子症或严重少精子症的患者基因组DNA中有DYS1的丢失[5]。
由于DYS1片段较小，其丢失在常规的染色体核型分析中不易发现，往往难以诊断。
PCR方法的发展为这一基因片段的检测创造了条件。本研究应用PCR法检测严重少精子
, 百拇医药
症或无精子症男子基因组DNA中的DYS1基因，获得了较为满意的结果，现报道如下。
材料和方法
1.病例选择
130例男性不育患者均来自不育专科门诊，根据WHO的标准，连续3次精液常规分
析，均确诊为无精子症或严重少精子症。其中无明确病因的无精子症患者95例，严重
少精子症患者35例，常规染色体核型分析均为正常(46，XY)。正常对照为50例已生育
男子，精子数>6000万/ml。
2.实验方法
, http://www.100md.com
2.1 模板DNA的提取：抽取患者静脉血1ml，抗凝，分离白细胞，经蛋白酶K处理，常规盐析法提取DNA。
2.2 寡核苷酸引物：寡核苷酸引物采用DYS1和ZFX/Y两对，DYS1扩增采用Vollrath
等[4]人设计的引物，为：
5′-TGTCACACTGCCCTAATCCT-3′和
5′-TGGTCATGACAAAAGACGAA-3′，扩增产物为132bp。ZFX/Y能扩增人X和Y染色体的部分序列，采用Asen[6]于1990年设计
的引物，为:
5′-ATAA TCACATGGAGAGCCACAAGCT-3′和
, 百拇医药
5′-GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAGT-3′，扩增产物为445bp，在本实验中作为阳性对照。(以上引物均由英国Glasgow大学的
O′ShaughnessyP J教授馈赠)
2.3 多聚酶链式反应(PCR)：反应总体积为30μl(50mmol/L KCl, 3mmol/L MgCl2,10mmol/L Tris-HCl, pH8.3,0.5U Taq DNA多聚酶，200nmol/L引物×2，40μmol/L
dNTPs，石蜡油封盖后，96.6℃变性3min。PCR反应条件为96℃变性30s，55℃退火75s，73℃延伸60s，反应共30个循环。
2.4 扩增产物的电泳：取扩增产物15μl，加入含溴酚蓝的载样缓冲液3μl，充分混
, 百拇医药
匀后点样于1.2%琼脂糖凝胶(内含1%的溴化乙锭)，30V，电泳1h，紫外灯下观察扩增条
带。
结 果
电泳结果显示，正常有生育能力男子(精子数>6 000万/ml)均可见ZFX/Y和DYS1扩
增片段。95例无精子症患者中，4例仅见ZFX/Y扩增片段，示DYS1基因的丢失或突变(附
图)。35例严重少精子症男子中，也发现3例患者有DYS1基因的丢失。
附图 电泳示正常男子(a)和部分患者(b-k)DYS1基因PCR扩增产物，其中i号患者有DYS1
的丢失
, http://www.100md.com
FigureElectrophoresis showing PCR products of DYS1 gene in normal manand some patients.
No.i patient having the deletion of DYS1.
讨 论
育龄夫妇中，约有10%患有不育症，其中一个重要的原因是男方生精障碍，表现为
严重少精子或无精子，约占不育男子的10%。除输精管道阻塞、腮腺炎病毒感染等明确
病因外，相当一部分患者找不出原因，给诊治带来困难。分子生物学技术的发展为从分
子水平探讨无精子症的病因创造了条件。早在1976年Tiepolo和Zuffardi[1]就提出在Yq11
, 百拇医药
上存在着“Y染色体精子生成基因”，由于许多男性无精子症患者均有Yq11的异常，故
将其称为“无精子症因子(azoospermia factor, AZF)”。1986年，Vergnaud[7]应用Y染色体
的质粒克隆DNA作为探针，分析Y染色体明显异常的患者，包括46，XX的男性，真两性
畸形和Y染色体长臂缺失的病例，建立了Y染色体的基因缺失图谱，为Y染色体上的基因
分析创造了条件。接着其他一些学者[2,4]也建立了Y染色体基因缺失图谱，并列出了Y染
色体上各基因片段的PCR引物序列，为用PCR方法检测Y染色体上的精子发生基因带来
, 百拇医药 了极大的方便。他们的结果发现，无精子症患者的基因缺失均发生于Y染色体的长臂，主要位于Yq11、23上，而且并非是单一基因，可能是含有多个基因片段的大家族。目
前已证明，Yq11、23中多个基因片段的丢失均可引起生精障碍[8]。但哪一个或哪几个基
因属于AZF尚未确定。1992年，我国留英学者马昆[9,10]从不育患者睾丸中分离出YRRM
基因家族，并从中克隆出两个单一基因，称为YRRM1和YRRM2，同时发现无精子症患
者和严重少精子症患者有YRRM1的丢失。我们亦发现在无精子症患者和严重少精子症
患者中有YRRM1的丢失(待发表)。Nagafuchi[5]和Kobayashi等[8]的研究发现，除YRRM
, http://www.100md.com
外，在Y染色体上还含有多个与生精相关的基因片段，主要位于DYS7c和DYS1之间。
本室曾检测了无精子症患者的DYS240基因，发现部分患者有该基因的丢失(待发表)。
本研究选择该区域内另一基因DYS1进行检测，在50例正常有生育能力男子中均有DYS1
的存在，在95例无精子症患者中发现4例有DYS1的丢失，在35例严重少精子症患者中，3例有DYS1的丢失，说明DYS1极可能为AZF的重要候选成分。
对于AZF的检测，可用Southern Blot的方法，选择合适的探针进行基因组DNA的分
析[7]。该方法需特异探针，方法较为繁琐，且不易大范围的推广应用。而PCR方法具有
, 百拇医药
方便、迅速、成本低的优点[5,8]，应用复合PCR的方法还可将多个与AZF有关的基因同
时扩增以适应临床检测的需要。本实验结果表明，用PCR方法检测DYS1基因片段是切
实可行的，对于临床诊治无精子症或严重少精子症患者具有指导意义，本室正着手建立
复合PCR方法，以便于临床应用。
收稿1997-02 修回 1997-06
参 考 文 献
[1] Tiepolo L, ZuffardiO. Localization of factors controlling spermatogenesis in thenonflu-
, http://www.100md.com
ore-scent portion of the human Ychromosome long arm. Hum Genet, 1976, 34(1):119
[2] Andersson M, Page DC, Pettay D, et al. Y autosometranslocation and mosaicism in the
etiology of 45X maleness: assignment offertility factor to distal Yq11. Hum Genet,1988, 79(1):2
[3] Vogt G, Chandley AC, Hargreave TB, et al. Microdeletion ininterval 6 of the Y chromoso-
me of males with idiopathic sertilitypoint to disruption of AZF, a human spermatogenesis
, 百拇医药
gene. Hum Genet, 1992, 89(5):491
[4] Vollrath D, Foote S, Hilton A, et al.The human Y chromosome:a 43-interval map based
on naturally occuring deletions. Science,1996, 258(2):52
[5] Nagafuchi S, Namiki M, Nakahori Y, et al. A minute deletionof the Y chromosome in men
with azoospermia.J Urol, 1993,150(5):1155
[6] Asen E, Medrano JF. Amplification of the ZFY and ZFX genesfor sex identification in
, http://www.100md.com
humans, cattle, sheep and goats. BioTechnol, 1990,8(5):1270
[7] Vergnaud G, Page DC, Simmler ML, et al. A deletion map of thehuman Y chromosome
based on DNA hybridization. Am J HumGenet, 1986, 38(2):109
[8] Kobayashi K, Mizuno K, Hida A, et al. PCR analysis of the Ychromosome long arm in
azoospermic patients:evidence for a secondlocus required for spermatogenesis Hum Mol
, 百拇医药
Genet, 1994, 3(11):1965
[9] Ma K, Sharkey A, et al. Towards the molecular localization ofthe AZF locus:mapping of
microdeletion in azoospermic men within 14subintervals of interval 6 of the human Y
chromosome. Hum Mol Genet, 1992,1(1):29
[10] Ma K, John D, et al. A Y chromosome gene family withRNA-binding protein homology.
, http://www.100md.com Candidates for the azoospermia factor AZFcontrolling human spermatogenesis. Cell,1993, 75(31):1287
ANALYSISOF DYS1 GENE RELATING TO SPERMATOGENESIS
ZhouZuomin△,Sha Jiahao, Lin Min, Wang Lirong, ZhouYadong,Zhu Hu
(Departmentof Histology and Embryology, Nanjing Medical University, Nanjing)
DYS1 is one of the improtant candidatesfor azoospermia factor (AZF). It has been proved
, 百拇医药
that the deletion of DYS1 could cause azoospermia or severeoligospermia. In this paper, PCR
was used to analyse DYS1 gene in 95 azoospermic men and 35oligospermic men with a cytol-
ogically normal Y chromosome. DYS1 deletion was found in 4azoospermic men. In iligospe-
rmic men, 3 DYS1 deletions were found. The results indicated thatPCR assay might be used to
, http://www.100md.com analyse DYS1 gene that is very useful for clinical diagnosis ofazoospermia and oligospermia. KEY WORDS Azoospermia;Azoospermiafactor; DYS1 gene, PCR
________________________
△Department of Histology and Embryology,Nanjing Medical University, Nanjing, 210029，China
《解剖学报》编辑委员会
顾 问 杨 进
, 百拇医药
主 编 章静波
副主编 徐群渊 孙品伟 许增禄 于恩华
编 委 贲长恩 蔡文琴 陈尔瑜 董新文高英茂 郭仁强 郭畹华 韩永坚 何素云
胡人义 姜均本 鞠 躬 刘 斌 饶志仁石玉秀 苏慧慈 田竟生 王国英
王云祥 吴晋宝 吴良芳 吴新智 张世馥张为龙 周长满 周明华 朱长庚
宗书东 左焕琛
(以姓氏汉语拼音为序), 百拇医药