复合培养人工皮肤的制备
作者：马刚 杨同书 颜炜群 张林 侯立中
单位：130021 长春，白求恩医科大学应用基础医学研究所[马刚(现白求恩医科大学第一医院) 杨同书 颜炜群 侯立中]；白求恩医科大学第一医院(张林)
关键词：
中华皮肤科杂志980235.htm
随着细胞培养技术的发展和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能[1，2]。人们一直在设想用组织工程技术培养出功能性代用品来代替损伤的组织或器官。迄今这一设想在国外已取得了一些进展，其中人工皮肤的研制是一个出色的例子[3～5]。我们提出并完成了复合培养人工皮肤的制备方案，并且系统地观察了其形成过程。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
(一)皮肤角朊细胞和成纤维细胞的分离培养：取出生后24小时以内的wistar大白鼠背部皮肤，尽量去除皮下组织，切成0.5cm×0.5cm大小皮肤块，用含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的D-Hanks液洗2次。然后加中性蛋白酶(1000U/ml)，4℃条件下消化20小时。分离真皮和表皮。表皮部分再用0.25%胰蛋白酶37℃条件下消化15分钟，保温结束后弃掉胰蛋白酶，加入培养液DMEM(Gibco)，轻轻吹打后将细胞悬液通过孔径200目的尼龙网，离心滤液(1500r/min)，洗3次，最后悬浮在Green开发的培养基中[6]，用血细胞计数板做细胞计数，台盼蓝染色观察细胞活性，接种培养。AE3抗体染培养细胞。分离的真皮部分再用0.25%Ⅰ型胶原酶37℃条件下消化30～40分钟，收集细胞悬液，用DMEM培养液洗3次，最后悬浮在含15%小牛血清的DMEM培养基中，接种培养。用抗结蛋白(desmin)单克隆抗体(重庆医科大学)、抗波形蛋白(vimentin)单克隆抗体(Dako)和肌动蛋白(actin)单克隆抗体(Dako)染培养的细胞。用正常鼠皮肤做阳性对照。
, 百拇医药
(二)复合培养人工皮肤的制备：用DMEM培养基浸Ⅰ型胶原蛋白网架24小
吉林省科委资助项目(953470)时，接种传代培养的成纤维细胞，密度为2.0×105/cm2。用含15%小牛血清的DMEM培养基培养2天后，将已植入成纤维细胞的基质网架反转180度，在基质网架的另一表面植入角朊细胞，细胞密度为4.0×105/cm2，培养基改为Green开发的培养基。隔日换液一次。一周后改用液气界面培养。每日观察培养皮肤的生长情况，每周取培养皮肤组织切片HE染色观察其形成过程。
二、结果
(一)皮肤细胞的分离、培养和鉴定：我们先用中性蛋白酶消化分离真皮和表皮，中性蛋白酶消化半桥粒结构，这样从真、表皮交界基底膜处分开，避免了成纤维细胞污染。表皮部分再用胰蛋白酶消化桥粒结构，收集小圆形发亮的细胞为基底细胞，台盼蓝染色90%以上为活细胞。应用ABC法AE3染色阳性，结合形态特点，确认培养的细胞为角朊细胞。真皮部分用胶原酶消化可分离真皮细胞。培养的细胞呈梭形，免疫组化染色波形蛋白阳性、肌动蛋白和结蛋白阴性，排除了平滑肌细胞污染，说明培养的成纤维细胞较纯。
, 百拇医药
(二)复合培养人工皮肤的组织学特点：培养第1周，表皮呈1～2层，细胞扁平附着于网架上。真皮网架网孔较大，可见少量成纤维细胞呈梭形附着于网架。培养第2周，表皮呈3～4层，表面出现菲薄的角质层，颗粒层、棘细胞层和基底层分界不明显。细胞多呈扁平，核呈椭圆形，一些部位的基底细胞呈柱状单层排列。真皮内基质网架网孔较大，孔间成纤维细胞周围有基质样物质。培养第3周，表皮已分化为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层。角质层较厚，颗粒层有1～2层扁平细胞，胞体较大，细胞内有嗜碱性透明角质颗粒，棘细胞层细胞呈多角形或扁平形，基底细胞呈多角形成矮柱状，胞核浅染。真皮浅层网架的部分结构消失，细胞外基质和成纤维细胞数量增多(图1)。培养第4周表皮具有完整的角质层、颗粒层、棘细
图1 复合培养人工皮肤的组织学所见
(第3周×110)
图2 复合培养人工皮肤的组织学所见
, http://www.100md.com
(第6周×450)
胞层和基底层。真皮网架结构不明显。培养第6周其结构与正常鼠皮肤相似(图2)。
三、小结
从上述形态结构特点可以看出，随着培养时间的推移，表皮逐渐完整，真皮层中成纤维细胞和细胞外基质逐渐增多，与此同时原来的网架逐渐破坏，重新构建真皮。培养第3周形成表皮的基本结构，培养第6周时形成具有表皮和真皮基本结构的皮肤。复合培养人工皮肤做为一种体外皮肤模型在医学研究中具有重要的应用前景。
参 考 文 献
1 Nerem RM. Cellular engineering. Ann Biomed Eng, 1991,19∶529-534.
2 Langer R. Tissue engineering. Science, 1993,260∶920-926.
, 百拇医药
3 桥村悦朗, 东山真理, 吉川邦彦. Skin-bank—细胞バンクシステム. 临皮, 1996,50(增)∶181-184.
4 黑柳能光, 盐谷信幸. 生物学的创伤被覆材. Biomedical Perspeseives, 1995,4∶71-74.
5 武居良太郎, 赤池敏宏. ハィづリッド型人工脏器の现状と将来. ケミヵルユンジニやング, 1993,6∶486-491.
6 Green H, Kehircle O, Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for graffing. Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76∶5665-5668.
(收稿：1997-02-19 修回：1997-11-10), 百拇医药
单位：130021 长春，白求恩医科大学应用基础医学研究所[马刚(现白求恩医科大学第一医院) 杨同书 颜炜群 侯立中]；白求恩医科大学第一医院(张林)
关键词：
中华皮肤科杂志980235.htm
随着细胞培养技术的发展和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能[1，2]。人们一直在设想用组织工程技术培养出功能性代用品来代替损伤的组织或器官。迄今这一设想在国外已取得了一些进展，其中人工皮肤的研制是一个出色的例子[3～5]。我们提出并完成了复合培养人工皮肤的制备方案，并且系统地观察了其形成过程。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
(一)皮肤角朊细胞和成纤维细胞的分离培养：取出生后24小时以内的wistar大白鼠背部皮肤，尽量去除皮下组织，切成0.5cm×0.5cm大小皮肤块，用含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的D-Hanks液洗2次。然后加中性蛋白酶(1000U/ml)，4℃条件下消化20小时。分离真皮和表皮。表皮部分再用0.25%胰蛋白酶37℃条件下消化15分钟，保温结束后弃掉胰蛋白酶，加入培养液DMEM(Gibco)，轻轻吹打后将细胞悬液通过孔径200目的尼龙网，离心滤液(1500r/min)，洗3次，最后悬浮在Green开发的培养基中[6]，用血细胞计数板做细胞计数，台盼蓝染色观察细胞活性，接种培养。AE3抗体染培养细胞。分离的真皮部分再用0.25%Ⅰ型胶原酶37℃条件下消化30～40分钟，收集细胞悬液，用DMEM培养液洗3次，最后悬浮在含15%小牛血清的DMEM培养基中，接种培养。用抗结蛋白(desmin)单克隆抗体(重庆医科大学)、抗波形蛋白(vimentin)单克隆抗体(Dako)和肌动蛋白(actin)单克隆抗体(Dako)染培养的细胞。用正常鼠皮肤做阳性对照。
, 百拇医药
(二)复合培养人工皮肤的制备：用DMEM培养基浸Ⅰ型胶原蛋白网架24小
吉林省科委资助项目(953470)时，接种传代培养的成纤维细胞，密度为2.0×105/cm2。用含15%小牛血清的DMEM培养基培养2天后，将已植入成纤维细胞的基质网架反转180度，在基质网架的另一表面植入角朊细胞，细胞密度为4.0×105/cm2，培养基改为Green开发的培养基。隔日换液一次。一周后改用液气界面培养。每日观察培养皮肤的生长情况，每周取培养皮肤组织切片HE染色观察其形成过程。
二、结果
(一)皮肤细胞的分离、培养和鉴定：我们先用中性蛋白酶消化分离真皮和表皮，中性蛋白酶消化半桥粒结构，这样从真、表皮交界基底膜处分开，避免了成纤维细胞污染。表皮部分再用胰蛋白酶消化桥粒结构，收集小圆形发亮的细胞为基底细胞，台盼蓝染色90%以上为活细胞。应用ABC法AE3染色阳性，结合形态特点，确认培养的细胞为角朊细胞。真皮部分用胶原酶消化可分离真皮细胞。培养的细胞呈梭形，免疫组化染色波形蛋白阳性、肌动蛋白和结蛋白阴性，排除了平滑肌细胞污染，说明培养的成纤维细胞较纯。
, 百拇医药
(二)复合培养人工皮肤的组织学特点：培养第1周，表皮呈1～2层，细胞扁平附着于网架上。真皮网架网孔较大，可见少量成纤维细胞呈梭形附着于网架。培养第2周，表皮呈3～4层，表面出现菲薄的角质层，颗粒层、棘细胞层和基底层分界不明显。细胞多呈扁平，核呈椭圆形，一些部位的基底细胞呈柱状单层排列。真皮内基质网架网孔较大，孔间成纤维细胞周围有基质样物质。培养第3周，表皮已分化为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层。角质层较厚，颗粒层有1～2层扁平细胞，胞体较大，细胞内有嗜碱性透明角质颗粒，棘细胞层细胞呈多角形或扁平形，基底细胞呈多角形成矮柱状，胞核浅染。真皮浅层网架的部分结构消失，细胞外基质和成纤维细胞数量增多(图1)。培养第4周表皮具有完整的角质层、颗粒层、棘细
图1 复合培养人工皮肤的组织学所见
(第3周×110)
图2 复合培养人工皮肤的组织学所见
, http://www.100md.com
(第6周×450)
胞层和基底层。真皮网架结构不明显。培养第6周其结构与正常鼠皮肤相似(图2)。
三、小结
从上述形态结构特点可以看出，随着培养时间的推移，表皮逐渐完整，真皮层中成纤维细胞和细胞外基质逐渐增多，与此同时原来的网架逐渐破坏，重新构建真皮。培养第3周形成表皮的基本结构，培养第6周时形成具有表皮和真皮基本结构的皮肤。复合培养人工皮肤做为一种体外皮肤模型在医学研究中具有重要的应用前景。
参 考 文 献
1 Nerem RM. Cellular engineering. Ann Biomed Eng, 1991,19∶529-534.
2 Langer R. Tissue engineering. Science, 1993,260∶920-926.
, 百拇医药
3 桥村悦朗, 东山真理, 吉川邦彦. Skin-bank—细胞バンクシステム. 临皮, 1996,50(增)∶181-184.
4 黑柳能光, 盐谷信幸. 生物学的创伤被覆材. Biomedical Perspeseives, 1995,4∶71-74.
5 武居良太郎, 赤池敏宏. ハィづリッド型人工脏器の现状と将来. ケミヵルユンジニやング, 1993,6∶486-491.
6 Green H, Kehircle O, Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for graffing. Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76∶5665-5668.
(收稿：1997-02-19 修回：1997-11-10), 百拇医药