黄芪中有效成分环黄芪醇皂甙和黄芪甲甙的含量测定
作者：李玲玲 张水龙
单位：李玲玲 张水龙(厦门 361012 厦门市药品检验所)
关键词：黄芪；环黄芪醇皂甙；黄芪甲甙；薄层扫描法
980306摘要 黄芪对心血管系统作用的主要有效成分是黄芪皂甙，黄芪皂甙大部分是以环黄芪皂醇为甙元的皂甙，其中黄芪甲甙含量最高。本文以双波长薄层扫描λS=500nm,λR=700nm测定环黄芪醇皂甙和黄芪甲甙的含量。
Quantitative determination of cycloastragenoside
and astragaloside Ⅳ in radix astragali
Li Lingling(Li LL),Zhang Shuilong
, 百拇医药
(Zhang SL)(Xiamen Institute For Durg Control,Xiamen 361012)
ABSTRACT The methods for TLC-densitometric determination of cycloastragenoside and astragaloside Ⅳ in radix astragali has been established.Samples were saponifed by methanol containing 2% potassium hydroxide and extracted with chloroform-n-butanol.Other samples were not saponifed and were directly extracted with chloroform-n-butanol.The spots were scanning with CS-930 scaner(Shimadzu) at λS=500nm and λR=700nm for cycloastragenoside and astragaloside Ⅳ.The average recovery was 95.8%.
, 百拇医药
KEY WORDS radix astragali,cycloasgenoside,astragaloside Ⅳ,TLC-scanning
黄芪为常用中药之一，含有黄芪的中成药制剂，常将它作为定性、定量的指标药味。国内外对黄芪皂甙作了深入研究，已分离鉴定了数十种黄芪皂甙，如乙酰黄芪皂甙Ⅰ,黄芪皂甙Ⅰ、Ⅱ，黄芪皂甙Ⅰ-Ⅷ等，黄芪皂甙乙，绵毛黄芪皂甙Ⅰ-ⅩⅥ，其中黄芪皂甙Ⅳ(Astragaloside Ⅳ)又称黄芪甲甙，为主要成分[1]，而乙酰黄芪皂甙Ⅰ，异黄芪皂甙Ⅰ、Ⅱ，黄芪皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ都以环黄芪皂醇(cycloastragenol)为甙元，各种皂甙以配糖体部分不同而分类。不同品种的黄芪所含有的黄芪皂甙单体存在着差异，文献报道膜荚黄芪、蒙古黄芪及同属近缘植物所含的黄芪皂甙有11～17种单体，由于黄芪中所含皂甙结构相似，含量测定方法较为繁琐，文献报道黄芪甲甙含量测定方法有薄层层析-紫外分光光度法[2]，比色法[3]，薄层扫描法[4]和高效液相色谱法[5]所述测定方法实际测定的是原生的黄芪甲甙和皂化水解转化的黄芪甲甙(即环黄芪皂醇类黄芪皂甙转化为黄芪甲甙)，未见文献报道两种状态下黄芪甲甙含量分析。本文比较两种状态下黄芪甲甙的含量，进一步了解黄芪质量优劣。
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1 实验部分
1.1 仪器与试药
薄层扫描仪：Shimadzu CS-930薄层扫描仪，所用试剂为分析纯，黄芪甲甙(中国药品生物制品检定所)，黄芪(厦门医药站)，经作者鉴定为内蒙黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch) Bge. var. mongholicus(Bge.) Hsiao]和膜荚黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.]。
1.2 层析与扫描条件
吸附剂：硅胶G薄层板，厚0.5mm,105℃活化1h置干燥器中备用；展开剂：氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)下层溶液；展距15cm,显色剂15%硫酸乙醇溶液,105℃烘约10～15min,双波长反射法锯齿扫描λS=500nm,λR=700nm,狭缝1.25mm×1.25mm,线性参数SX=3,检测信号峰面积。
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1.3 标准曲线的制备
精密称取黄芪甲甙对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。精密吸取对照品溶液1,2,3,4和5μl点于同一薄层板上，按上述条件展开，显色，扫描测定，以点样微克数为横坐标(X),斑点峰面积积分值为纵坐标(Y),计算回归方程为Y=803.9+5174.7X,r=0.9995,n=10，线性范围1～5μg。
1.4 样品的测定
1.4.1 供试品溶液制备(未皂化)[6]：取黄芪粉末(40目)3g,精密称定，加40ml甲醇浸渍过夜，置索氏提取器中提取4h,提取液置水浴上蒸干，残渣加水10ml溶解，用水饱和的正丁醇(20,15和10ml)萃取，合并正丁醇液，以5%碳酸氢钠溶液洗涤3次(10,10和10ml),以水10ml洗涤1次，弃水层，取正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加水5ml溶解，置于D101大孔吸附树脂柱(1.2×10cm)内用水50ml洗脱，弃水液，再以70%乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣以甲醇2ml溶解，作为供试品溶液(甲)。
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1.4.2 供试品溶液制备(皂化)[7]：精密称取黄芪药材粗粉约2g置于索氏提取器中，加2%氢氧化钾甲醇液浸渍过夜，加热回流5h,提取液蒸干，加水30ml,以氯仿-正丁醇(2∶1)混合液(40,30,30和30ml)萃取，合并萃取液加1%磷酸二氢钾溶液50ml洗涤，弃水相，再以40ml水洗涤1次，有机相蒸干，残渣加甲醇溶解，定容2ml,即为供试品溶液(乙)。
1.4.3 样品测定：分别精密吸取对照品溶液2和4μl,供试品(甲)、(乙)8μl,按上述条件测定，以外标二点法计算黄芪甲甙含量，结果见附表。
附表 样品测定结果(n=3) 样品
来源
黄芪甲甙
环黄芪醇皂甙(以黄芪甲甙计)
, 百拇医药
含量(%)
RSD(%)
含量(%)
RSD(%)
1*1
河南
0.100
4.7
0.159
4.8
2*1
河南
, 百拇医药 0.086
4.2
0.125
3.9
3*1
内蒙古
0.062
3.8
0.089
4.1
4*1
山西
0.112
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3.5
0.142
2.9
5*1
山西
0.096
4.1
0.137
3.1
6*2
山西
0.136
2.7
, 百拇医药
0.176
2.6
7*2
山西
0.102
2.6
0.153
3.2
8*2
山西
0.117
4.3
0.169
, 百拇医药
2.5
9*2
山西
0.124
3.9
0.171
3.2
10*2
内蒙古
0.109
2.8
0.146
4.3
, 百拇医药
注：*1为蒙古黄芪；*2为膜荚黄芪
1.5稳定性试验
分别精密吸取对照品溶液2和4μl,按上述条件展开，显色，每隔0.5h测定一次斑点峰面积积分值，结果表明3h内积分值稳定，RSD为2.1%。
1.6 精密度试验
在同一薄层板上精密点上6个相同量的对照品，按上述方法测定，6个面积积分值平均为25102.3，RSD为2.6%。
1.7 加样回收率试验
在已测定含量的药材粗粉中加入一定量的对照品，按样品制备方法制备供试品溶液，同样品测定项下操作，测得平均回收率为95.8%，RSD为3.2%(n=6)。
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2 讨 论
2.1 黄芪甲甙有多种含量测定方法，但由于方法不同，可能引起误差。
2.2 黄芪中十几种皂甙，以黄芪甲甙含量最高，对有效成分及其作用机理进行研究，发现黄芪有明显的正性肌力和改善心肌缺血功效的有效成分为黄芪皂甙Ⅳ，黄芪皂甙Ⅳ通过增强钙调素心肌收缩蛋白对钙离子的敏感性产生正性肌力作用，黄芪甲甙是主要有效成分，故可以黄芪甲甙作为黄芪质量优劣衡量指标。而环黄芪醇皂甙是多种皂甙共有相同的甙元，黄芪的清除超氧阴离子自由基的功效是黄芪甙混合物作用的结果，说明黄芪甲甙以外其它皂甙也具生理活性。在中成药制剂中，成份复杂，仅黄芪皂甙十余种，常互相干扰影响测定结果，将含同一母核的环黄芪醇皂甙都转化为黄芪甲甙，大大减斑点数，并能有效去除杂质干扰，且能全面考查其它有效成分的含量，为比较原植物中环黄芪醇皂甙的总量和原生态的黄芪甲甙含量，故本文做了上述实验。
2.3 环黄芪醇皂甙含有相同的甙元母核，因配糖体部分不同而分为多种皂甙，环黄芪醇皂甙的配糖体上有3个取代位置有变化，黄芪甲甙配糖体3个位置均相联羟基-OH，而其它环黄芪醇皂甙配糖体上或联接-OH，或的联接-OAc,利用皂化反应原理，在氢氧化钾的作用下，将-OAc皂化为-OH，也就是所有的环黄芪醇皂甙多转化为黄芪甲甙。
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参考文献
1 余灏，杨胜华.黄芪皂甙分析方法研究近况.华西药学杂志，1993，8(3)∶163.
2 吴乃居，陈鸿英，董锡山.黄芪愈伤组织中增强免疫活性成分的含量研究.中成药，1989，11(2)∶9.
3 俞家华，曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲甙的含量测定.中药通报，1986，11(9)∶38.
4 鲁静，王宝琴.黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药，1992，14(6)∶34.
5 原田正敏.繁用生药の成分定量.天然药物分析ラタ集.东京：广川书店，1989∶34.
6 李玲，苏健.黄芪及其复方制剂中黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药，1993，15(6)∶10.
7 李玲玲，李敏玲，何金山.复方升白灵中黄芪甲甙的薄层扫描法测定.药物分析杂志，1996，16(1)∶28.
收稿日期：1997-07-03, http://www.100md.com
单位：李玲玲 张水龙(厦门 361012 厦门市药品检验所)
关键词：黄芪；环黄芪醇皂甙；黄芪甲甙；薄层扫描法
980306摘要 黄芪对心血管系统作用的主要有效成分是黄芪皂甙，黄芪皂甙大部分是以环黄芪皂醇为甙元的皂甙，其中黄芪甲甙含量最高。本文以双波长薄层扫描λS=500nm,λR=700nm测定环黄芪醇皂甙和黄芪甲甙的含量。
Quantitative determination of cycloastragenoside
and astragaloside Ⅳ in radix astragali
Li Lingling(Li LL),Zhang Shuilong
, 百拇医药
(Zhang SL)(Xiamen Institute For Durg Control,Xiamen 361012)
ABSTRACT The methods for TLC-densitometric determination of cycloastragenoside and astragaloside Ⅳ in radix astragali has been established.Samples were saponifed by methanol containing 2% potassium hydroxide and extracted with chloroform-n-butanol.Other samples were not saponifed and were directly extracted with chloroform-n-butanol.The spots were scanning with CS-930 scaner(Shimadzu) at λS=500nm and λR=700nm for cycloastragenoside and astragaloside Ⅳ.The average recovery was 95.8%.
, 百拇医药
KEY WORDS radix astragali,cycloasgenoside,astragaloside Ⅳ,TLC-scanning
黄芪为常用中药之一，含有黄芪的中成药制剂，常将它作为定性、定量的指标药味。国内外对黄芪皂甙作了深入研究，已分离鉴定了数十种黄芪皂甙，如乙酰黄芪皂甙Ⅰ,黄芪皂甙Ⅰ、Ⅱ，黄芪皂甙Ⅰ-Ⅷ等，黄芪皂甙乙，绵毛黄芪皂甙Ⅰ-ⅩⅥ，其中黄芪皂甙Ⅳ(Astragaloside Ⅳ)又称黄芪甲甙，为主要成分[1]，而乙酰黄芪皂甙Ⅰ，异黄芪皂甙Ⅰ、Ⅱ，黄芪皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ都以环黄芪皂醇(cycloastragenol)为甙元，各种皂甙以配糖体部分不同而分类。不同品种的黄芪所含有的黄芪皂甙单体存在着差异，文献报道膜荚黄芪、蒙古黄芪及同属近缘植物所含的黄芪皂甙有11～17种单体，由于黄芪中所含皂甙结构相似，含量测定方法较为繁琐，文献报道黄芪甲甙含量测定方法有薄层层析-紫外分光光度法[2]，比色法[3]，薄层扫描法[4]和高效液相色谱法[5]所述测定方法实际测定的是原生的黄芪甲甙和皂化水解转化的黄芪甲甙(即环黄芪皂醇类黄芪皂甙转化为黄芪甲甙)，未见文献报道两种状态下黄芪甲甙含量分析。本文比较两种状态下黄芪甲甙的含量，进一步了解黄芪质量优劣。
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1 实验部分
1.1 仪器与试药
薄层扫描仪：Shimadzu CS-930薄层扫描仪，所用试剂为分析纯，黄芪甲甙(中国药品生物制品检定所)，黄芪(厦门医药站)，经作者鉴定为内蒙黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch) Bge. var. mongholicus(Bge.) Hsiao]和膜荚黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.]。
1.2 层析与扫描条件
吸附剂：硅胶G薄层板，厚0.5mm,105℃活化1h置干燥器中备用；展开剂：氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)下层溶液；展距15cm,显色剂15%硫酸乙醇溶液,105℃烘约10～15min,双波长反射法锯齿扫描λS=500nm,λR=700nm,狭缝1.25mm×1.25mm,线性参数SX=3,检测信号峰面积。
, http://www.100md.com
1.3 标准曲线的制备
精密称取黄芪甲甙对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。精密吸取对照品溶液1,2,3,4和5μl点于同一薄层板上，按上述条件展开，显色，扫描测定，以点样微克数为横坐标(X),斑点峰面积积分值为纵坐标(Y),计算回归方程为Y=803.9+5174.7X,r=0.9995,n=10，线性范围1～5μg。
1.4 样品的测定
1.4.1 供试品溶液制备(未皂化)[6]：取黄芪粉末(40目)3g,精密称定，加40ml甲醇浸渍过夜，置索氏提取器中提取4h,提取液置水浴上蒸干，残渣加水10ml溶解，用水饱和的正丁醇(20,15和10ml)萃取，合并正丁醇液，以5%碳酸氢钠溶液洗涤3次(10,10和10ml),以水10ml洗涤1次，弃水层，取正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加水5ml溶解，置于D101大孔吸附树脂柱(1.2×10cm)内用水50ml洗脱，弃水液，再以70%乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣以甲醇2ml溶解，作为供试品溶液(甲)。
, http://www.100md.com
1.4.2 供试品溶液制备(皂化)[7]：精密称取黄芪药材粗粉约2g置于索氏提取器中，加2%氢氧化钾甲醇液浸渍过夜，加热回流5h,提取液蒸干，加水30ml,以氯仿-正丁醇(2∶1)混合液(40,30,30和30ml)萃取，合并萃取液加1%磷酸二氢钾溶液50ml洗涤，弃水相，再以40ml水洗涤1次，有机相蒸干，残渣加甲醇溶解，定容2ml,即为供试品溶液(乙)。
1.4.3 样品测定：分别精密吸取对照品溶液2和4μl,供试品(甲)、(乙)8μl,按上述条件测定，以外标二点法计算黄芪甲甙含量，结果见附表。
附表 样品测定结果(n=3) 样品
来源
黄芪甲甙
环黄芪醇皂甙(以黄芪甲甙计)
, 百拇医药
含量(%)
RSD(%)
含量(%)
RSD(%)
1*1
河南
0.100
4.7
0.159
4.8
2*1
河南
, 百拇医药 0.086
4.2
0.125
3.9
3*1
内蒙古
0.062
3.8
0.089
4.1
4*1
山西
0.112
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3.5
0.142
2.9
5*1
山西
0.096
4.1
0.137
3.1
6*2
山西
0.136
2.7
, 百拇医药
0.176
2.6
7*2
山西
0.102
2.6
0.153
3.2
8*2
山西
0.117
4.3
0.169
, 百拇医药
2.5
9*2
山西
0.124
3.9
0.171
3.2
10*2
内蒙古
0.109
2.8
0.146
4.3
, 百拇医药
注：*1为蒙古黄芪；*2为膜荚黄芪
1.5稳定性试验
分别精密吸取对照品溶液2和4μl,按上述条件展开，显色，每隔0.5h测定一次斑点峰面积积分值，结果表明3h内积分值稳定，RSD为2.1%。
1.6 精密度试验
在同一薄层板上精密点上6个相同量的对照品，按上述方法测定，6个面积积分值平均为25102.3，RSD为2.6%。
1.7 加样回收率试验
在已测定含量的药材粗粉中加入一定量的对照品，按样品制备方法制备供试品溶液，同样品测定项下操作，测得平均回收率为95.8%，RSD为3.2%(n=6)。
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2 讨 论
2.1 黄芪甲甙有多种含量测定方法，但由于方法不同，可能引起误差。
2.2 黄芪中十几种皂甙，以黄芪甲甙含量最高，对有效成分及其作用机理进行研究，发现黄芪有明显的正性肌力和改善心肌缺血功效的有效成分为黄芪皂甙Ⅳ，黄芪皂甙Ⅳ通过增强钙调素心肌收缩蛋白对钙离子的敏感性产生正性肌力作用，黄芪甲甙是主要有效成分，故可以黄芪甲甙作为黄芪质量优劣衡量指标。而环黄芪醇皂甙是多种皂甙共有相同的甙元，黄芪的清除超氧阴离子自由基的功效是黄芪甙混合物作用的结果，说明黄芪甲甙以外其它皂甙也具生理活性。在中成药制剂中，成份复杂，仅黄芪皂甙十余种，常互相干扰影响测定结果，将含同一母核的环黄芪醇皂甙都转化为黄芪甲甙，大大减斑点数，并能有效去除杂质干扰，且能全面考查其它有效成分的含量，为比较原植物中环黄芪醇皂甙的总量和原生态的黄芪甲甙含量，故本文做了上述实验。
2.3 环黄芪醇皂甙含有相同的甙元母核，因配糖体部分不同而分为多种皂甙，环黄芪醇皂甙的配糖体上有3个取代位置有变化，黄芪甲甙配糖体3个位置均相联羟基-OH，而其它环黄芪醇皂甙配糖体上或联接-OH，或的联接-OAc,利用皂化反应原理，在氢氧化钾的作用下，将-OAc皂化为-OH，也就是所有的环黄芪醇皂甙多转化为黄芪甲甙。
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参考文献
1 余灏，杨胜华.黄芪皂甙分析方法研究近况.华西药学杂志，1993，8(3)∶163.
2 吴乃居，陈鸿英，董锡山.黄芪愈伤组织中增强免疫活性成分的含量研究.中成药，1989，11(2)∶9.
3 俞家华，曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲甙的含量测定.中药通报，1986，11(9)∶38.
4 鲁静，王宝琴.黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药，1992，14(6)∶34.
5 原田正敏.繁用生药の成分定量.天然药物分析ラタ集.东京：广川书店，1989∶34.
6 李玲，苏健.黄芪及其复方制剂中黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药，1993，15(6)∶10.
7 李玲玲，李敏玲，何金山.复方升白灵中黄芪甲甙的薄层扫描法测定.药物分析杂志，1996，16(1)∶28.
收稿日期：1997-07-03, http://www.100md.com