HCV和HIV-1合并感染标本中HCV基因分型
作者：钟平 段继良 刘桂珍 朱为 张伊璜
单位：200052 上海，卫生部上海生物制品研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；人类免疫缺陷病毒感染；基因型
中华传染病杂志980405 【摘要】 目的 了解丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)混合感染标本中HCV基因型情况。方法 采用了根据HCV 5′端非转译区基因组所设计的反相探针杂交测定方法(INNOLiPA,HCVⅡ)，对来自六个地区的17份抗-HCV和抗-HIV-1双阳性标本进行HCV基因型分型研究。结果 在17份标本中，7份(41.18%)为I(1b)型病毒，5份(29.41%)为Ⅱ(2a/2c)型病毒，5份(29.41%)为I型(1b)和Ⅱ(2a/2c)混合型病毒。结论 发现HCV与HIV-1合并感染标本中存在I(1b)型、Ⅱ(2a/2c)型以及I(1b)型与Ⅱ(2a/2c)型混合型HCV。值得注意的是对α-干扰素治疗不敏感并且较易趋于导致严重的慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的Ⅱ型HCV感染的比率占70.58%(12/17)。
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Genotyping of HCV in the HCV and HIV-1 co-infected samples Zhong Ping,Duan Jiliang,Liu Guizheng,et al. Shanghai Institute of Biological Products,Shanghai 200052
【Abstract】 Objective To investigate the genotypes of HCV in the HCV and HIV-1 co-infected samples.Methods Genotypes of HCV were determined by the INNO-LiPA HCVII kit based on a reverse-hybridization technique which was used for genotyping HCV and determining the variation in the 5′ untranslated regions of different HCVs.Seventeen of HCV and HIV-1 co-infected samples derived from 6 different high-risk geographic areas in China were studied.Results The results indicated that 7/17(41.18%) of samples were found to be of (1b) genotype,5/17(29.41%) were Ⅲ(2a/2c) genotype and 5/17(29.41%) were mixed-genotype with Ⅱ (1b) and Ⅲ (2a/2c).Conclusion The presence of HCV Ⅱ(1b) and Ⅲ(2a/2c) genotype as well as HCV Ⅱ and Ⅲ mixed genotype were found in HCV and HIV-1 co-infected samples.Notably,HCV Ⅱ (1b) genotype,usually fails to respond to IFN-α is apt to proceed much faster to severe chronic hepatitis,cirrhosis and hepatocellular carcinoma,had a significantly higher prevalence of 12/17 (70.58%) than other subtypes in this study.
, 百拇医药
【Key words】 HCV HIV Infection Genotype
丙型肝炎病毒(HCV)是引起绝大多数非甲非乙肝炎的致病原[1]。HCV至少存在6个主要的基因型以及它们的基因亚型[2]，另外，HCV基因型分布有明显的地区性[3]。有证据表明感染Ⅱ型HCV的患者，对α-干扰素治疗不敏感，并较易发展成为严重的慢性肝炎、甚至导致肝硬化和肝细胞癌症[4～6]。HCV与HIV-1合并感染血清/血浆中的HCV基因型分型的研究在国外已有报道[7，8]。本研究旨在了解从国内不同地区高危人群中HCV和HIV-1合并感染标本中的HCV基因型的情况，这无论对HCV和HIV-1合并感染的自然史和分子流行病调查，还是对HCV和HIV-1合并感染者的监控和治疗都有重要的意义。
材料和方法
, 百拇医药 一、实验标本和材料
(一) 标本来源 选择来自于国内六个不同地区高危人群的17份标本。这些标本已经用卫生部批检合格的抗-HCV和抗-HIV-1酶联检测试剂(科华生物制品实业有限公司)测定为抗-HCV和抗-HIV-1阳性。
(二) 试剂来源 HCV确证试剂(INNO-LIA HCV Ⅲ，批号：60930586)、HIV-1确证试剂(INNO-LIA HIV，批号：60430471)和HCV基因分型试剂(INNOLiPA HCV Ⅱ，批号：61031622)由比利时Innogenetics公司提供；脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和逆转录酶(M-MLV)购自GIBCO公司；Taq DNA聚合酶购自Promega公司；HCV PCR扩增引物由比利时Innogenetics公司提供。
二、方法
(一) 确证试验 抗-HCV和抗-HIV-1阳性确证试验方法按照比利时Innogenetics公司提供的试剂操作说明书操作。
, 百拇医药
(二) PCR扩增
1. RNA提取 参照Castillo方法[9]并稍加改良。取血浆50μl，加150μl RNA提取液和175μl苯酚∶氯仿(6∶1)混合液，混匀后置冰浴20分钟。经两次离心抽提后吸取上清液，加入等量冷异丙醇放置-20℃ 60分钟。离心弃上清，加70%冷乙醇400μl，离心14 000r/min 10分钟，弃上清，放置37℃烘干。
2.cDNA合成和套式PCR 采用第一对外引物进行cDNA合成和PCR扩增，37℃1小时，94℃5分钟，94℃1分钟55℃1分钟，72℃1分钟，45个循环，72℃5分钟。第二次扩增取第一次扩增的1μl PCR产物，扩增反应条件同第一次扩增。2%琼脂糖凝胶电泳观测结果。
(三) HCV基因型分型 按照比利时Innogenetics公司提供的INNOLiPA HCV Ⅱ说明书操作。
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结果
一、抗-HCV阳性标本确证
确证试验结果显示52.94%(9/17)含有C1+C2，C3+C4，E2/NS1，NS3，NS4，NS5条带；17.65%(3/17)含有C1+C2，C3+C4，E2/NS1，NS3和NS4条带；17.65%(3/17)含有NS3和NS4条带；11.76(2/17)含有C1+C2，NS3和NS4条带。根据该试剂的结果判断标准，在一条HCV抗原条带反应在2+或更高时；或至少两条HCV抗原条带反应在1+或更高时，结果可判为阳性。
二、抗-HIV-1阳性标本确证
确证试验结果显示76.47%(13/17)含有gp120,gp41,p31,p24,p17条带；17.65%(3/17)含有gp41,p24和p17条带；5.88%(1/17)含有gp41,p31和p24条带。根据该试剂的结果判断标准，与两条抗原条带产生反应，并且其中必须包括一条外膜蛋白条带，则判为阳性。
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三、HCV基因型的确定
根据Simmonds等[3]提出的一种被国际学术机构广泛使用的HCV基因分类法，HCV可被分类成为六大类(1～6)。其亚型为1a-1c,2a-2d,3a-3f,4a-4k,5a和6a。我国常用Okamoto HCV分型方法(Ⅰ至Ⅴ型)。两种分型命名方法之间的关系为Ⅰ(1a)、Ⅱ(1b)、Ⅲ(2a)、Ⅳ(2b)以及Ⅴ(3a)。在本研究中，我们只发现Ⅱ(1b)和Ⅲ(2a/2c)型，其中41.18%(7/17)为Ⅱ(1b)基因型；29.41%(5/17)为Ⅲ(2a/2c)基因型；29.41%(5/17)为Ⅱ(1b)和Ⅲ(2a/2c)混合基因型。Ⅱ(1b)基因亚病毒的感染占70.58%(12/17),而Ⅲ(2a/2c)基因型病毒的感染(包括与Ⅱ基因型病毒混合并感染)占58.82%(10/17),结果见附表。
附表 HCV基因型的流行情况 地区
, 百拇医药 数目
Ⅱ(1b)
Ⅲ(2a/2c)
Ⅱ(1b)+Ⅲ(2a/2c)
A
5
1(20)
3(60)
1(20)
B
4
2(50)
-
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2(50)
C
3
2(50)
-
1(33.3)
D
2
1(50)
1(50)
-
E
2
, http://www.100md.com 1(50)
1(50)
-
F
1
-
-
1(100)
合计
17
7(41.2)
5(29.4)
5(29.4)
, 百拇医药
讨论
国外已有报道HCV和HIV-1合并感染较HCV单独感染易于发展成症状性的肝病[10]。这可能与HIV-1感染诱导的免疫抑遏或两种病毒相互作用而加速HCV的复制所致[8]。一些研究报道指出，在HIV-1感染者中的HCV病毒血症要比HIV-1阴性患者高，同样，在精液也存在较高浓度的HCV，进一步证明了存在两种病毒相互作用的可能性[8]。在本研究中，考虑到现有待检标本已经多次反复冻融，可能会造成不准确的HCV病毒定量，因此没有对HCV RNA进行定量，然而在本研究中，我们发现抗-HCV阳性的HCV RNA的检出率为100%(17/17)，提示在HCV和HIV合并感染时所导致的高浓度的HCV RNA易于被PCR扩增方法检测出。我们在本研究中着重于确定在HIV和HCV合并感染标本中HCV的基因型，为探讨HCV和HIV-1合并感染的分子流行病调查的方法和更好的了解HCV和HIV-1合并感染的自然史提供一种研究模式。从附表可以看到，在每个地区(5个地区)都存在至少两种基因型以上，即Ⅱ(1b)、Ⅲ(2a/2c)以及Ⅱ(1b)与Ⅲ(2a/2c)混合基因型。由于我们所研究的HCV和HIV-1合并感染的标本有限，然而我们可以确定，在同一地区的HCV和HIV-1合并感染人群中，至少有两种HCV基因型的流行，其原因可能是由于：(1) 高危人群的流动性；(2) 在高危人群中，由于HCV在体内的免疫逃逸和遗传变异而造成HCV基因型流行的多样性。另外，国内HCV基因型以Ⅱ(1b)为主。值得注意的是，对α-干扰素治疗不敏感的并且较易趋于导致严重的慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的HCVⅡ(1b)基因型，感染的比率占70.58%(12/17)。这对HCV和HIV-1混合感染者的肝病治疗以及疾病的转归带来了更大的困难，应该引起包括流行病学家和临床医生的重视。另外，我们在有限的研究标本中没有发现HCV基因型与相应血浆中的HCV抗体谱之间的关系。综上所述，我们发现在不同地区的高危人群中的HCV和HIV-1合并感染者中，至少流行两种基因型的HCV。由于HCV和HIV-1合并感染所造成体内高滴度的HCV极易造成感染者的肝脏损害和造成HCV的传播，因此，对HCV和HIV-1合并感染者应该加以监控和治疗。
, 百拇医药
参考文献
1 Choo QL, Weiner AJ, Overby LR, et al. Hepatitis C virus: The major causative agent of viral non-A non-B hepatitis. British Medical Bullettin, 1990, 46:423-441.
2 Simmonds, P, Albert A, Alter H, et al, A proposed system for the nomenclature of hepatitis C virus genotypeas. Hepatology, 1994, 19:1321-1324.
3 杜绍财，陶其敏，朱凌，等.丙型肝炎表达基因5′-末端非编码区酶切分型研究.中华医学杂志，1993,73:7-9.
, 百拇医药
4 陆志檬，张东华，童葵塘，等.HCV基因型和病毒量与干扰素疗效的关系.中华传染病杂志，1995，13:65-67.
5 Qu D, Li JS, Vitvitskin L, et al. Hepatitis C virus genotypes in France: comparison of clinical features of patients infected with HCV type 1a and 1b. J Hepatology, 1994,21:70-75.
6 Shev S, Widell A, Foberg U, et al. HCV genotypes in Swedish blood donors as correlated to epidemiology, liver disease and hepatitis C virus antibody profile. Infection, 1995,23:253-257.
, http://www.100md.com
7 Mendel I, Clotteau L, Lambert S, et al. Hepatitis C virus infection in an HIV-positive population in Normandy: antibodies, HCV RNA and genotype prevalence. J Medical Virology, 1995,47:231-236.
8 Cribier B, Rey D, Schimm C, et al. High hepatitis C viraemia and impaired antibody response in patients coinfected with HIV. AIDS, 1995,9:1131-1136.
9 Castillo I, Bartolome J, Antonio J, et al. Comparison of several PCR procedures for detection of serum HCV RNA using different regions of the HCV genome. J Virological Methods, 1992, 38:71-80.
10 Eyster ME, Diamondstone LS, Lien JM, et al. Natural history of hepatitis C virus infection in multitransfused hemophiliacs:effect of coinfection with human immunodeficiency virus. AIDS, 1993,6:602-607.
(收稿：1997-07-28 修回：1998-04-24), 百拇医药
单位：200052 上海，卫生部上海生物制品研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；人类免疫缺陷病毒感染；基因型
中华传染病杂志980405 【摘要】 目的 了解丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)混合感染标本中HCV基因型情况。方法 采用了根据HCV 5′端非转译区基因组所设计的反相探针杂交测定方法(INNOLiPA,HCVⅡ)，对来自六个地区的17份抗-HCV和抗-HIV-1双阳性标本进行HCV基因型分型研究。结果 在17份标本中，7份(41.18%)为I(1b)型病毒，5份(29.41%)为Ⅱ(2a/2c)型病毒，5份(29.41%)为I型(1b)和Ⅱ(2a/2c)混合型病毒。结论 发现HCV与HIV-1合并感染标本中存在I(1b)型、Ⅱ(2a/2c)型以及I(1b)型与Ⅱ(2a/2c)型混合型HCV。值得注意的是对α-干扰素治疗不敏感并且较易趋于导致严重的慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的Ⅱ型HCV感染的比率占70.58%(12/17)。
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Genotyping of HCV in the HCV and HIV-1 co-infected samples Zhong Ping,Duan Jiliang,Liu Guizheng,et al. Shanghai Institute of Biological Products,Shanghai 200052
【Abstract】 Objective To investigate the genotypes of HCV in the HCV and HIV-1 co-infected samples.Methods Genotypes of HCV were determined by the INNO-LiPA HCVII kit based on a reverse-hybridization technique which was used for genotyping HCV and determining the variation in the 5′ untranslated regions of different HCVs.Seventeen of HCV and HIV-1 co-infected samples derived from 6 different high-risk geographic areas in China were studied.Results The results indicated that 7/17(41.18%) of samples were found to be of (1b) genotype,5/17(29.41%) were Ⅲ(2a/2c) genotype and 5/17(29.41%) were mixed-genotype with Ⅱ (1b) and Ⅲ (2a/2c).Conclusion The presence of HCV Ⅱ(1b) and Ⅲ(2a/2c) genotype as well as HCV Ⅱ and Ⅲ mixed genotype were found in HCV and HIV-1 co-infected samples.Notably,HCV Ⅱ (1b) genotype,usually fails to respond to IFN-α is apt to proceed much faster to severe chronic hepatitis,cirrhosis and hepatocellular carcinoma,had a significantly higher prevalence of 12/17 (70.58%) than other subtypes in this study.
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【Key words】 HCV HIV Infection Genotype
丙型肝炎病毒(HCV)是引起绝大多数非甲非乙肝炎的致病原[1]。HCV至少存在6个主要的基因型以及它们的基因亚型[2]，另外，HCV基因型分布有明显的地区性[3]。有证据表明感染Ⅱ型HCV的患者，对α-干扰素治疗不敏感，并较易发展成为严重的慢性肝炎、甚至导致肝硬化和肝细胞癌症[4～6]。HCV与HIV-1合并感染血清/血浆中的HCV基因型分型的研究在国外已有报道[7，8]。本研究旨在了解从国内不同地区高危人群中HCV和HIV-1合并感染标本中的HCV基因型的情况，这无论对HCV和HIV-1合并感染的自然史和分子流行病调查，还是对HCV和HIV-1合并感染者的监控和治疗都有重要的意义。
材料和方法
, 百拇医药 一、实验标本和材料
(一) 标本来源 选择来自于国内六个不同地区高危人群的17份标本。这些标本已经用卫生部批检合格的抗-HCV和抗-HIV-1酶联检测试剂(科华生物制品实业有限公司)测定为抗-HCV和抗-HIV-1阳性。
(二) 试剂来源 HCV确证试剂(INNO-LIA HCV Ⅲ，批号：60930586)、HIV-1确证试剂(INNO-LIA HIV，批号：60430471)和HCV基因分型试剂(INNOLiPA HCV Ⅱ，批号：61031622)由比利时Innogenetics公司提供；脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和逆转录酶(M-MLV)购自GIBCO公司；Taq DNA聚合酶购自Promega公司；HCV PCR扩增引物由比利时Innogenetics公司提供。
二、方法
(一) 确证试验 抗-HCV和抗-HIV-1阳性确证试验方法按照比利时Innogenetics公司提供的试剂操作说明书操作。
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(二) PCR扩增
1. RNA提取 参照Castillo方法[9]并稍加改良。取血浆50μl，加150μl RNA提取液和175μl苯酚∶氯仿(6∶1)混合液，混匀后置冰浴20分钟。经两次离心抽提后吸取上清液，加入等量冷异丙醇放置-20℃ 60分钟。离心弃上清，加70%冷乙醇400μl，离心14 000r/min 10分钟，弃上清，放置37℃烘干。
2.cDNA合成和套式PCR 采用第一对外引物进行cDNA合成和PCR扩增，37℃1小时，94℃5分钟，94℃1分钟55℃1分钟，72℃1分钟，45个循环，72℃5分钟。第二次扩增取第一次扩增的1μl PCR产物，扩增反应条件同第一次扩增。2%琼脂糖凝胶电泳观测结果。
(三) HCV基因型分型 按照比利时Innogenetics公司提供的INNOLiPA HCV Ⅱ说明书操作。
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结果
一、抗-HCV阳性标本确证
确证试验结果显示52.94%(9/17)含有C1+C2，C3+C4，E2/NS1，NS3，NS4，NS5条带；17.65%(3/17)含有C1+C2，C3+C4，E2/NS1，NS3和NS4条带；17.65%(3/17)含有NS3和NS4条带；11.76(2/17)含有C1+C2，NS3和NS4条带。根据该试剂的结果判断标准，在一条HCV抗原条带反应在2+或更高时；或至少两条HCV抗原条带反应在1+或更高时，结果可判为阳性。
二、抗-HIV-1阳性标本确证
确证试验结果显示76.47%(13/17)含有gp120,gp41,p31,p24,p17条带；17.65%(3/17)含有gp41,p24和p17条带；5.88%(1/17)含有gp41,p31和p24条带。根据该试剂的结果判断标准，与两条抗原条带产生反应，并且其中必须包括一条外膜蛋白条带，则判为阳性。
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三、HCV基因型的确定
根据Simmonds等[3]提出的一种被国际学术机构广泛使用的HCV基因分类法，HCV可被分类成为六大类(1～6)。其亚型为1a-1c,2a-2d,3a-3f,4a-4k,5a和6a。我国常用Okamoto HCV分型方法(Ⅰ至Ⅴ型)。两种分型命名方法之间的关系为Ⅰ(1a)、Ⅱ(1b)、Ⅲ(2a)、Ⅳ(2b)以及Ⅴ(3a)。在本研究中，我们只发现Ⅱ(1b)和Ⅲ(2a/2c)型，其中41.18%(7/17)为Ⅱ(1b)基因型；29.41%(5/17)为Ⅲ(2a/2c)基因型；29.41%(5/17)为Ⅱ(1b)和Ⅲ(2a/2c)混合基因型。Ⅱ(1b)基因亚病毒的感染占70.58%(12/17),而Ⅲ(2a/2c)基因型病毒的感染(包括与Ⅱ基因型病毒混合并感染)占58.82%(10/17),结果见附表。
附表 HCV基因型的流行情况 地区
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Ⅱ(1b)
Ⅲ(2a/2c)
Ⅱ(1b)+Ⅲ(2a/2c)
A
5
1(20)
3(60)
1(20)
B
4
2(50)
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C
3
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1(33.3)
D
2
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E
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1(50)
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合计
17
7(41.2)
5(29.4)
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讨论
国外已有报道HCV和HIV-1合并感染较HCV单独感染易于发展成症状性的肝病[10]。这可能与HIV-1感染诱导的免疫抑遏或两种病毒相互作用而加速HCV的复制所致[8]。一些研究报道指出，在HIV-1感染者中的HCV病毒血症要比HIV-1阴性患者高，同样，在精液也存在较高浓度的HCV，进一步证明了存在两种病毒相互作用的可能性[8]。在本研究中，考虑到现有待检标本已经多次反复冻融，可能会造成不准确的HCV病毒定量，因此没有对HCV RNA进行定量，然而在本研究中，我们发现抗-HCV阳性的HCV RNA的检出率为100%(17/17)，提示在HCV和HIV合并感染时所导致的高浓度的HCV RNA易于被PCR扩增方法检测出。我们在本研究中着重于确定在HIV和HCV合并感染标本中HCV的基因型，为探讨HCV和HIV-1合并感染的分子流行病调查的方法和更好的了解HCV和HIV-1合并感染的自然史提供一种研究模式。从附表可以看到，在每个地区(5个地区)都存在至少两种基因型以上，即Ⅱ(1b)、Ⅲ(2a/2c)以及Ⅱ(1b)与Ⅲ(2a/2c)混合基因型。由于我们所研究的HCV和HIV-1合并感染的标本有限，然而我们可以确定，在同一地区的HCV和HIV-1合并感染人群中，至少有两种HCV基因型的流行，其原因可能是由于：(1) 高危人群的流动性；(2) 在高危人群中，由于HCV在体内的免疫逃逸和遗传变异而造成HCV基因型流行的多样性。另外，国内HCV基因型以Ⅱ(1b)为主。值得注意的是，对α-干扰素治疗不敏感的并且较易趋于导致严重的慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的HCVⅡ(1b)基因型，感染的比率占70.58%(12/17)。这对HCV和HIV-1混合感染者的肝病治疗以及疾病的转归带来了更大的困难，应该引起包括流行病学家和临床医生的重视。另外，我们在有限的研究标本中没有发现HCV基因型与相应血浆中的HCV抗体谱之间的关系。综上所述，我们发现在不同地区的高危人群中的HCV和HIV-1合并感染者中，至少流行两种基因型的HCV。由于HCV和HIV-1合并感染所造成体内高滴度的HCV极易造成感染者的肝脏损害和造成HCV的传播，因此，对HCV和HIV-1合并感染者应该加以监控和治疗。
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参考文献
1 Choo QL, Weiner AJ, Overby LR, et al. Hepatitis C virus: The major causative agent of viral non-A non-B hepatitis. British Medical Bullettin, 1990, 46:423-441.
2 Simmonds, P, Albert A, Alter H, et al, A proposed system for the nomenclature of hepatitis C virus genotypeas. Hepatology, 1994, 19:1321-1324.
3 杜绍财，陶其敏，朱凌，等.丙型肝炎表达基因5′-末端非编码区酶切分型研究.中华医学杂志，1993,73:7-9.
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4 陆志檬，张东华，童葵塘，等.HCV基因型和病毒量与干扰素疗效的关系.中华传染病杂志，1995，13:65-67.
5 Qu D, Li JS, Vitvitskin L, et al. Hepatitis C virus genotypes in France: comparison of clinical features of patients infected with HCV type 1a and 1b. J Hepatology, 1994,21:70-75.
6 Shev S, Widell A, Foberg U, et al. HCV genotypes in Swedish blood donors as correlated to epidemiology, liver disease and hepatitis C virus antibody profile. Infection, 1995,23:253-257.
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7 Mendel I, Clotteau L, Lambert S, et al. Hepatitis C virus infection in an HIV-positive population in Normandy: antibodies, HCV RNA and genotype prevalence. J Medical Virology, 1995,47:231-236.
8 Cribier B, Rey D, Schimm C, et al. High hepatitis C viraemia and impaired antibody response in patients coinfected with HIV. AIDS, 1995,9:1131-1136.
9 Castillo I, Bartolome J, Antonio J, et al. Comparison of several PCR procedures for detection of serum HCV RNA using different regions of the HCV genome. J Virological Methods, 1992, 38:71-80.
10 Eyster ME, Diamondstone LS, Lien JM, et al. Natural history of hepatitis C virus infection in multitransfused hemophiliacs:effect of coinfection with human immunodeficiency virus. AIDS, 1993,6:602-607.
(收稿：1997-07-28 修回：1998-04-24), 百拇医药