甘草甜素对小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用
作者：葛淑芬 兰行简 盐田 觉
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院口腔科(葛淑芬、兰行简)；日本金医科大学齿科口腔外科(盐田 觉)
关键词：甘草甜素；纤维肉瘤；抑制，肿瘤；细胞周期
中华口腔医学杂志980607 【摘要】 目的 探讨甘草甜素的抗肿瘤作用和机制。方法 利用小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞株，通过细胞生长状态检测、光电镜水平的形态学观察、细胞周期分析等方法，观察甘草甜素对纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用。结果 甘草甜素600mg/L以上浓度能抑制纤维肉瘤细胞的增殖，且随其浓度的增加，作用时间的延长，抑制效果越显著；甘草甜素可引起纤维肉瘤细胞形态学改变，可使纤维肉瘤细胞G1期向S期移行受阻。结论 甘草甜素抑制纤维肉瘤细胞增殖的最低有效浓度为600 mg/L以上；甘草甜素的抗肿瘤机制可能是通过干扰G1期细胞的某些代谢或/和阻碍DNA合成的启动来实现的。
, 百拇医药
The inhibiting effect of glycyrrhizin on proliferation of the mice submandibular gland fibrosarcoma cell line in vitro
Ge Shufen, Lan Xingjian, Satoru Shiota, Deptment of Oral Maxillofacial Surgery, The First Hospital, China Medical University, Shengyang 110001
【Abstract】 Objective To study the inhibiting effect of glycyrrhizin on proliferation of the cell line of mice submandibular gland fibrosarcome in vitro.Methods Light and electronic microscope examination, proliferative state of cells and cycle phase analysis were used.Results Administration of glycyrrhizin above 600 mg/L could inhibit cell proliferation, and the effect was dose and time dependent. The morphological change of the cell line affected by glycyrrhizin could be seen with light and electronic microscope. Cell cycle phase analysis showed gLycyrrhizin gould stop cells shifting from G1 to S phase.Conclusion The Lowest inhibition concentration of glycyrrhizin to the cell line was above 600 mg/L, The antineoplastic effect of glycyrrhizin was possibly accomplished by interfering metabolism of G1 phase cells or/and blocking initiation of DNA synthesis.
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【Key words】 Glycyrrhizin Fibrosarcoma Suppressor, tumor Antineoplastic cell cycle
甘草甜素(glycyrrhizin, GL)是中药甘草根茎中的主要成份，具有抗炎、抗过敏、抗病毒、解毒、调节机体的免疫功能等多种作用。有资料报道GL具有防癌、抑癌和防止癌转移的作用。我们就GL对小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用进行了观察研究，为开发新的抗肿瘤中草药提供实验基础和理论依据。
材料与方法
1.细胞株：应用20-甲基胆蒽诱发小鼠颌下腺纤维肉瘤分离培养[1]。
2.药物：实验组：(GL组：日本ミノファゲン药本铺生产)。取指数生长期的纤维肉瘤细胞，按7×103/ml接种于60 mm平皿内，37℃、5%CO2孵箱内培养，24 h后加药。以500～1000 mg/L的不同浓度添加，连续5天。计算细胞增减数：加药后逐日各剂量组取3个平皿计数，取其均值。观察细胞生长曲线：将加药后每天测得细胞数连成半对数曲线，即细胞生长曲线。计算不同时间、不同药物浓度下的细胞生长抑制率：
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细胞生长抑制率=1-(给药组细胞增长数)/(对照组细胞增长数)×100%
阳性对照组：(放线菌素D.日本万有药株式会社生产)以12.5～500 μg/L的不同浓度添加。其培养条件、药物添加方法及观察指标同实验组。空白对照组：纤维肉瘤细胞+培养液。上述每组实验均重复3次，取其均值。
3.细胞形态学观察：用相差显微镜、光镜、扫描电镜观察各给药组加药后不同时间的细胞形态变化。
4.细胞周期分析：用流式细胞术行细胞周期分析。即GL及放线菌素D添加24h后用胰蛋白酶+EDTA液消化，70%乙醇固定，用RNase(100 000 mg/L)，37℃处理20 min，吖啶染色(50 mg/L)，细胞周期时相分析。
结果
1.实验组与阳性对照组细胞生长曲线证明：GL 600mg/L以上、放线菌素D 12.5μg/L以上浓度时，随浓度的增加、时间的延长、对纤维肉瘤细胞的增殖抑制越显著，与空白对照组相比差异显著(表1，2)。各组药物添加后的细胞生长抑制率具有以上规律。GL不同浓度添加后细胞增减数的方差分析结果表明：GL 600 mg/L以上浓度抑制瘤细胞效果非常显著，且各组浓度间的差异有显著性(F>0.01，P<0.01)。我们认为600 mg/L为抑制瘤细胞生长的最低有效浓度。
, 百拇医药
2.细胞形态学观察：相差显微镜观察可见，对照组的肿瘤细胞为圆形、椭圆形及纺锤形，细胞突起发达(图1)。GL添加后随浓度、作用时间变化，平皿内浮游细胞数增多，细胞突起变短并消失；细胞质内可见空泡变性，细胞核浓缩、变性、甚至崩解(图2)。放线菌素D添加后细胞大小及周围突起的改变不明显，但细胞核膨胀、结构不清、并有溶解，在胞质内亦可见到空泡变性(图3)。Giemsa染色光镜观察基本与相差显微镜所见一致。扫描电镜下空白对照组细胞核发达，细胞周围有细长的树枝状突起，细胞表面微绒毛发达，可见小球形结构(图4)。GL 1000mg/L添加24 h后细胞表面的小球形结构及微绒毛不发达，细长的细胞突起伸延也减弱，细胞核的膨隆减弱，细胞表面出现散在的1.0 μm小孔样凹陷(图5)。放线菌素D100μg/L添加24 h后观察结果与GL有相同之处(图6)。
3.细胞周期分析：GL 600mg/L及放线菌素D500μg/L添加后24h，将培养细胞通过流式细胞仪检测方法分析，结果：GL作用的瘤细胞在G1期显著蓄积，培养细胞从G1期向S期的移行受到阻碍。放线菌素D作用的瘤细胞G2期、M期细胞的相对比例增大。即G2期、M期细胞受到阻碍。
, 百拇医药
讨论
1.GL的抗肿瘤作用：癌的发生与机体的免疫状态有关，调节免疫功能可消灭体内残留的恶性肿瘤细胞。近年来国内外关于GL调节机体免疫机能的报道不少[2～4]，我们认为，GL的免疫调节功能可间接对肿瘤细胞有抑制作用。GL可治疗皮肤癌、肝癌，并可抑制恶性肿瘤的转移[5，6]。动物实验证明GL对化学致癌剂致癌有阻断作用，因此可预防人类肿瘤[7，8]。本实验系统观察了GL对小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用。结果证明：GL对小鼠纤维肉瘤细胞的增殖有抑制作用，GL 600mg/L以上浓度添加时能引起纤维肉瘤细胞的形态改变。
表1 甘草甜素添加后逐日的细胞增减数(
±s) 甘草甜素
(mg/L)
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纤维肉瘤细胞数
1天
2天
3天
4天
5天
空白对照
3.25±0.25
11.55±0.30
53.44±3.56
*
*
500
, 百拇医药
2.75±0.25
2.94±0.18
7.00±0
10.60±0.13
14.57±0.18
600
1.94±0.60
0.63±0.13
0.25±0
-
-
700
, 百拇医药
1.88±0.13
0.50±0
0.13±0.13
-
-
800
1.44±0.19
0.25±0
-
-
-
900
1.13±0.13
, 百拇医药
0.19±0.06
-
-
-
1000
0.94±0.19
0.13±0
-
-
-
注：接种细胞数7×106/L *培养皿细胞已满无法计数表2 放线菌素D添加后逐日的细胞增减数(±s) 放线菌素D
, 百拇医药
(μg/L)
纤维肉瘤细胞数
1天
2天
3天
4天
5天
空白对照
3.50±0.50
14.50±2.50
78.98±0.72
*
*
, 百拇医药
12.5
1.62±0.13
0.88±0.13
0.38±0.13
0.19±0.06
-
25
1.50±0
0.75±0
0.13±0.13
-
-
50
, 百拇医药
1.00±0
0.50±0
0.13±0
-
-
100
0.63±0.13
0.25±0
0.07±0.06
-
-
300
0.50±0
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0.19±0.06
-
-
-
500
0.38±0.13
0.07±0.06
-
-
-
注：接种细胞数7×106/L，*同表1
2.GL抗肿瘤的作用机制：本实验结果GL可使瘤细胞表面的微绒毛及细胞突起不发达、细胞核膨隆减弱，细胞表面出现散在的小孔样凹陷，说明细胞代谢受到抑制。根据细胞周期分析结果可见：GL可使纤维肉瘤细胞G1期向S期移行受阻，提示其抗肿瘤作用可能是通过干扰G1期细胞的某些代谢或(和)阻碍DNA合成来实现。阳性对照的放线菌素D为抗生素类抗肿瘤药物，已通过动物实验应用于临床，并且对肉瘤的治疗效果好。放线菌素D可使纤维肉瘤细胞G2期、M期均受到阻碍，提示其抗肿瘤作用可能是通过干扰DNA合成后期向有丝分裂期过渡或(和)干扰细胞有丝分裂来实现的。
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3.本实验利用小鼠诱发肉瘤瘤株，通过体外实验观察了GL对肉瘤细胞的直接杀伤作用。人类瘤株与小鼠诱发瘤株相比，在肿瘤形态学和免疫学特征上更为直接，但因肉瘤在口腔颌面部发病率较低、肿瘤来源受限，瘤株不易建立。诱发瘤株容易获得，可重复；在研究肿瘤移植和转移方面优于人类肿瘤。就药物实验而言，体外实验比体内实验更具直接性，弥补了体内实验的不足。但体外实验脱离机体的内环境，不能反映出药物对机体的毒性作用。故今后还将就GL的抗肿瘤作用进行动物实验研究；并且力争建立人的肉瘤细胞系，以使研究结论更准确、更完善。
中草药药源丰富、价格低廉、毒副作用小，对放疗和化疗有增效减毒作用，在恶性肿瘤的治疗上有其独到之处。GL不仅能够通过调节机体的免疫功能对肿瘤细胞有间接抑制作用，并且通过体外实验证明它对小鼠的纤维肉瘤细胞亦有直接杀伤能力。因此GL可望作为一种新的抗肿瘤中草药，将具有广泛的临床应用前景。
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图1 空白对照组纤维肉瘤细胞的相差显微镜像(高倍) 图2 GL 1 000 mg/L添加24小时后的相差显微镜像(高倍) 图3 放线菌素D 100μg/L添加24小时后的相差显微镜像(高倍) 图4 空白对照组纤维肉瘤细胞的扫描电镜像 图5 GL 1 000 mg/L 添加24小时后的扫描电镜像 图6 放线菌素D100μg/L添加24小时后的扫描电镜像
参考文献
1 葛淑芬，盐田 觉.20-三甲基胆蒽诱发小鼠颌下腺纤维肉瘤及其超微结构的研究.中国医科大学学报，1994，23：319-321.
2 熊谷 郎.甘草，特にグリチルリチンの药理作用と临床应用への问题点.Minophagen Medical Review, 1980, 25:185.
3 李铁民(综述).甘草甜素免疫调节作用研究进展.中草药，1993，24：553-556.
, 百拇医药
4 Abe N, Ebina T, Ishida N. Interferon induction by glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid in mice. Microbiol Immunol, 1982, 26:535-539.
5 玉井定美，原 仲一.グリチルリチンによる恶性肿の转移抑制现象.Minophagen Medical Review, 1968, 13:47.
6 渡 伸三，马良生.化学物质による肝がんの发生とその防御に关する超微形态的研究.Proc Symp Wakan-yaku, 1978, 11:11-16.
7 Agarwal R, Wang ZY, Mukhtar H. Inhibition of mouse skin tumor-intiating activity of DMBA by chronic oral feeding of glycyrrhizin in drinking water. Nutr Cancer, 1991, 15:187-193.
8 Suzuki F, Schmitt DA, Utsunomiva T, et al. Stimulation of host resistance against tumors by glycyrrhizin, an aetive component of licorice roots. In Vivo, 1992, 6:589-596.
(收稿：1996-05-10 修回：1997-11-20), 百拇医药
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院口腔科(葛淑芬、兰行简)；日本金医科大学齿科口腔外科(盐田 觉)
关键词：甘草甜素；纤维肉瘤；抑制，肿瘤；细胞周期
中华口腔医学杂志980607 【摘要】 目的 探讨甘草甜素的抗肿瘤作用和机制。方法 利用小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞株，通过细胞生长状态检测、光电镜水平的形态学观察、细胞周期分析等方法，观察甘草甜素对纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用。结果 甘草甜素600mg/L以上浓度能抑制纤维肉瘤细胞的增殖，且随其浓度的增加，作用时间的延长，抑制效果越显著；甘草甜素可引起纤维肉瘤细胞形态学改变，可使纤维肉瘤细胞G1期向S期移行受阻。结论 甘草甜素抑制纤维肉瘤细胞增殖的最低有效浓度为600 mg/L以上；甘草甜素的抗肿瘤机制可能是通过干扰G1期细胞的某些代谢或/和阻碍DNA合成的启动来实现的。
, 百拇医药
The inhibiting effect of glycyrrhizin on proliferation of the mice submandibular gland fibrosarcoma cell line in vitro
Ge Shufen, Lan Xingjian, Satoru Shiota, Deptment of Oral Maxillofacial Surgery, The First Hospital, China Medical University, Shengyang 110001
【Abstract】 Objective To study the inhibiting effect of glycyrrhizin on proliferation of the cell line of mice submandibular gland fibrosarcome in vitro.Methods Light and electronic microscope examination, proliferative state of cells and cycle phase analysis were used.Results Administration of glycyrrhizin above 600 mg/L could inhibit cell proliferation, and the effect was dose and time dependent. The morphological change of the cell line affected by glycyrrhizin could be seen with light and electronic microscope. Cell cycle phase analysis showed gLycyrrhizin gould stop cells shifting from G1 to S phase.Conclusion The Lowest inhibition concentration of glycyrrhizin to the cell line was above 600 mg/L, The antineoplastic effect of glycyrrhizin was possibly accomplished by interfering metabolism of G1 phase cells or/and blocking initiation of DNA synthesis.
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【Key words】 Glycyrrhizin Fibrosarcoma Suppressor, tumor Antineoplastic cell cycle
甘草甜素(glycyrrhizin, GL)是中药甘草根茎中的主要成份，具有抗炎、抗过敏、抗病毒、解毒、调节机体的免疫功能等多种作用。有资料报道GL具有防癌、抑癌和防止癌转移的作用。我们就GL对小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用进行了观察研究，为开发新的抗肿瘤中草药提供实验基础和理论依据。
材料与方法
1.细胞株：应用20-甲基胆蒽诱发小鼠颌下腺纤维肉瘤分离培养[1]。
2.药物：实验组：(GL组：日本ミノファゲン药本铺生产)。取指数生长期的纤维肉瘤细胞，按7×103/ml接种于60 mm平皿内，37℃、5%CO2孵箱内培养，24 h后加药。以500～1000 mg/L的不同浓度添加，连续5天。计算细胞增减数：加药后逐日各剂量组取3个平皿计数，取其均值。观察细胞生长曲线：将加药后每天测得细胞数连成半对数曲线，即细胞生长曲线。计算不同时间、不同药物浓度下的细胞生长抑制率：
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细胞生长抑制率=1-(给药组细胞增长数)/(对照组细胞增长数)×100%
阳性对照组：(放线菌素D.日本万有药株式会社生产)以12.5～500 μg/L的不同浓度添加。其培养条件、药物添加方法及观察指标同实验组。空白对照组：纤维肉瘤细胞+培养液。上述每组实验均重复3次，取其均值。
3.细胞形态学观察：用相差显微镜、光镜、扫描电镜观察各给药组加药后不同时间的细胞形态变化。
4.细胞周期分析：用流式细胞术行细胞周期分析。即GL及放线菌素D添加24h后用胰蛋白酶+EDTA液消化，70%乙醇固定，用RNase(100 000 mg/L)，37℃处理20 min，吖啶染色(50 mg/L)，细胞周期时相分析。
结果
1.实验组与阳性对照组细胞生长曲线证明：GL 600mg/L以上、放线菌素D 12.5μg/L以上浓度时，随浓度的增加、时间的延长、对纤维肉瘤细胞的增殖抑制越显著，与空白对照组相比差异显著(表1，2)。各组药物添加后的细胞生长抑制率具有以上规律。GL不同浓度添加后细胞增减数的方差分析结果表明：GL 600 mg/L以上浓度抑制瘤细胞效果非常显著，且各组浓度间的差异有显著性(F>0.01，P<0.01)。我们认为600 mg/L为抑制瘤细胞生长的最低有效浓度。
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2.细胞形态学观察：相差显微镜观察可见，对照组的肿瘤细胞为圆形、椭圆形及纺锤形，细胞突起发达(图1)。GL添加后随浓度、作用时间变化，平皿内浮游细胞数增多，细胞突起变短并消失；细胞质内可见空泡变性，细胞核浓缩、变性、甚至崩解(图2)。放线菌素D添加后细胞大小及周围突起的改变不明显，但细胞核膨胀、结构不清、并有溶解，在胞质内亦可见到空泡变性(图3)。Giemsa染色光镜观察基本与相差显微镜所见一致。扫描电镜下空白对照组细胞核发达，细胞周围有细长的树枝状突起，细胞表面微绒毛发达，可见小球形结构(图4)。GL 1000mg/L添加24 h后细胞表面的小球形结构及微绒毛不发达，细长的细胞突起伸延也减弱，细胞核的膨隆减弱，细胞表面出现散在的1.0 μm小孔样凹陷(图5)。放线菌素D100μg/L添加24 h后观察结果与GL有相同之处(图6)。
3.细胞周期分析：GL 600mg/L及放线菌素D500μg/L添加后24h，将培养细胞通过流式细胞仪检测方法分析，结果：GL作用的瘤细胞在G1期显著蓄积，培养细胞从G1期向S期的移行受到阻碍。放线菌素D作用的瘤细胞G2期、M期细胞的相对比例增大。即G2期、M期细胞受到阻碍。
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讨论
1.GL的抗肿瘤作用：癌的发生与机体的免疫状态有关，调节免疫功能可消灭体内残留的恶性肿瘤细胞。近年来国内外关于GL调节机体免疫机能的报道不少[2～4]，我们认为，GL的免疫调节功能可间接对肿瘤细胞有抑制作用。GL可治疗皮肤癌、肝癌，并可抑制恶性肿瘤的转移[5，6]。动物实验证明GL对化学致癌剂致癌有阻断作用，因此可预防人类肿瘤[7，8]。本实验系统观察了GL对小鼠颌下腺纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用。结果证明：GL对小鼠纤维肉瘤细胞的增殖有抑制作用，GL 600mg/L以上浓度添加时能引起纤维肉瘤细胞的形态改变。
表1 甘草甜素添加后逐日的细胞增减数(
±s) 甘草甜素(mg/L)
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纤维肉瘤细胞数
1天
2天
3天
4天
5天
空白对照
3.25±0.25
11.55±0.30
53.44±3.56
*
*
500
, 百拇医药
2.75±0.25
2.94±0.18
7.00±0
10.60±0.13
14.57±0.18
600
1.94±0.60
0.63±0.13
0.25±0
-
-
700
, 百拇医药
1.88±0.13
0.50±0
0.13±0.13
-
-
800
1.44±0.19
0.25±0
-
-
-
900
1.13±0.13
, 百拇医药
0.19±0.06
-
-
-
1000
0.94±0.19
0.13±0
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-
注：接种细胞数7×106/L *培养皿细胞已满无法计数表2 放线菌素D添加后逐日的细胞增减数(
±s) 放线菌素D, 百拇医药
(μg/L)
纤维肉瘤细胞数
1天
2天
3天
4天
5天
空白对照
3.50±0.50
14.50±2.50
78.98±0.72
*
*
, 百拇医药
12.5
1.62±0.13
0.88±0.13
0.38±0.13
0.19±0.06
-
25
1.50±0
0.75±0
0.13±0.13
-
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50
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1.00±0
0.50±0
0.13±0
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100
0.63±0.13
0.25±0
0.07±0.06
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300
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0.19±0.06
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500
0.38±0.13
0.07±0.06
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注：接种细胞数7×106/L，*同表1
2.GL抗肿瘤的作用机制：本实验结果GL可使瘤细胞表面的微绒毛及细胞突起不发达、细胞核膨隆减弱，细胞表面出现散在的小孔样凹陷，说明细胞代谢受到抑制。根据细胞周期分析结果可见：GL可使纤维肉瘤细胞G1期向S期移行受阻，提示其抗肿瘤作用可能是通过干扰G1期细胞的某些代谢或(和)阻碍DNA合成来实现。阳性对照的放线菌素D为抗生素类抗肿瘤药物，已通过动物实验应用于临床，并且对肉瘤的治疗效果好。放线菌素D可使纤维肉瘤细胞G2期、M期均受到阻碍，提示其抗肿瘤作用可能是通过干扰DNA合成后期向有丝分裂期过渡或(和)干扰细胞有丝分裂来实现的。
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3.本实验利用小鼠诱发肉瘤瘤株，通过体外实验观察了GL对肉瘤细胞的直接杀伤作用。人类瘤株与小鼠诱发瘤株相比，在肿瘤形态学和免疫学特征上更为直接，但因肉瘤在口腔颌面部发病率较低、肿瘤来源受限，瘤株不易建立。诱发瘤株容易获得，可重复；在研究肿瘤移植和转移方面优于人类肿瘤。就药物实验而言，体外实验比体内实验更具直接性，弥补了体内实验的不足。但体外实验脱离机体的内环境，不能反映出药物对机体的毒性作用。故今后还将就GL的抗肿瘤作用进行动物实验研究；并且力争建立人的肉瘤细胞系，以使研究结论更准确、更完善。
中草药药源丰富、价格低廉、毒副作用小，对放疗和化疗有增效减毒作用，在恶性肿瘤的治疗上有其独到之处。GL不仅能够通过调节机体的免疫功能对肿瘤细胞有间接抑制作用，并且通过体外实验证明它对小鼠的纤维肉瘤细胞亦有直接杀伤能力。因此GL可望作为一种新的抗肿瘤中草药，将具有广泛的临床应用前景。
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图1 空白对照组纤维肉瘤细胞的相差显微镜像(高倍) 图2 GL 1 000 mg/L添加24小时后的相差显微镜像(高倍) 图3 放线菌素D 100μg/L添加24小时后的相差显微镜像(高倍) 图4 空白对照组纤维肉瘤细胞的扫描电镜像 图5 GL 1 000 mg/L 添加24小时后的扫描电镜像 图6 放线菌素D100μg/L添加24小时后的扫描电镜像
参考文献
1 葛淑芬，盐田 觉.20-三甲基胆蒽诱发小鼠颌下腺纤维肉瘤及其超微结构的研究.中国医科大学学报，1994，23：319-321.
2 熊谷 郎.甘草，特にグリチルリチンの药理作用と临床应用への问题点.Minophagen Medical Review, 1980, 25:185.
3 李铁民(综述).甘草甜素免疫调节作用研究进展.中草药，1993，24：553-556.
, 百拇医药
4 Abe N, Ebina T, Ishida N. Interferon induction by glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid in mice. Microbiol Immunol, 1982, 26:535-539.
5 玉井定美，原 仲一.グリチルリチンによる恶性肿の转移抑制现象.Minophagen Medical Review, 1968, 13:47.
6 渡 伸三，马良生.化学物质による肝がんの发生とその防御に关する超微形态的研究.Proc Symp Wakan-yaku, 1978, 11:11-16.
7 Agarwal R, Wang ZY, Mukhtar H. Inhibition of mouse skin tumor-intiating activity of DMBA by chronic oral feeding of glycyrrhizin in drinking water. Nutr Cancer, 1991, 15:187-193.
8 Suzuki F, Schmitt DA, Utsunomiva T, et al. Stimulation of host resistance against tumors by glycyrrhizin, an aetive component of licorice roots. In Vivo, 1992, 6:589-596.
(收稿：1996-05-10 修回：1997-11-20), 百拇医药