系统性红斑狼疮患者血清DNA酶测定的临床意义
作者：曾凡钦 陈宜芳 李伯有 林宝珠 许德清
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院皮肤科
关键词：红斑狼疮；系统性；脱氧核糖核酸酶类
中华皮肤科杂志980604 【摘要】 目的 研究血清DNA酶(DNase)浓度异常在系统性红斑狼疮(SLE)发生发展中所起的作用。方法 于国内首次用单相酶扩散法检测了63例SLE患者。结果 患者血清中DNase浓度明显低于正常人；活动期患者明显低于缓解期患者；SLE伴肾损害患者低于非肾损害患者。血清DNase的浓度下降与DNA含量升高呈负相关；与血沉、ANA呈负相关；与补体C3、C4呈正相关；与病情活动积分呈负相关。结论 SLE患者由于其DNase水平低下，使得血循环中含DNA的自身抗原长期滞留，发挥免疫原性，并与抗DNA抗体结合形成免疫复合物，造成免疫损伤。患者血清DNase水平低下在SLE的发病机制中起着一定作用。
, 百拇医药
The Measurement of Deoxyribonuclease and Its Clinical Significance in Patients with SLE Zeng Fanqin, Chen Yifang, Li Boyou, et al. Department of Dermatology, Sun Yatsen Memorial Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective To study the role of abnormal concentration of DNase in the development of SLE. Methods The concentration of DNase was measured by single radial enzyme diffusion method in the sera of 63 SLE patients. Results The concentration of DNase in the patients was significantly lower than that in healthy individuals, significantly lower in patients at active stage than that in remission, and lowest in patients with lupus nephritis. The decrease of serum DNase was negatively correlated with the increase of serum DNA. The level of DNase was negatively correlated with ANA and ESR, positively correlated with C3, C4, and negatively correlated with the severity of the disease. Conclusion The above data suggest that the decrease of serum DNase makes the persistence of DNA in the blood circulation which combines with antiDNA antibody to form immune complex, resulting in autoimmune lesions. The decrease of serum DNase may play an important role in the pathogenesis f SLE.
, 百拇医药
【Key words】 Lupus erythematosus, systemic Deoxyribonucleases
已经证实系统性红斑狼疮(SLE)患者血循环中DNA水平升高[1～3]，但其升高的原因尚不清楚，有可能是因为DNA清除机制的缺陷[4]。我们用单相酶扩散法检测SLE患者血清DNA酶(DNase)的浓度，并探讨血清DNase浓度异常与DNA升高的关系以及在SLE发生发展中所起的作用。
材料与方法
1.主要试剂：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、牛胸腺DNA、牛胰DNA酶Ⅰ(DNase)、RNA酶A(RNase)：Fluka公司和Sigma公司产品；溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)、琼脂糖：华美生物工程公司产品。
2.仪器：荧光分光光度计：F-2000型，日本Hitachi公司产品；紫外透射仪：WP-1型，永嘉上塘教学仪器厂。
, 百拇医药
3.检测对象：SLE患者63例，男6例，女57例，全部为我科1997年9月至1998年3月的住院及门诊患者。所有患者均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。参照文献[5]，患者按临床症状及实验室检查评定病情活动积分，并分类为活动期患者和缓解期患者、伴肾损患者和非肾损患者。
4.正常对照组：为我市中心血站的健康献血员38例，性别及年龄均与患者组相匹配。
5.DNase的测定(单相酶扩散法)：用pH7.2 0 05mol/L TrisHCl缓冲液配1%的琼脂糖凝胶20ml，其中含牛胸腺DNA和EB分别为6mg和0.5mg，灌制凝胶板，用直径为1.5mm的打孔器于凝胶板上打孔。加入4μl样本(标准DNA或待检血清)，37℃湿盒孵育16小时，0.1mol/L的EDTA终止反应，于紫外透射仪下观察并测量DNA水解环的大小。在一定范围内，水解环的大小与DNase的浓度成正比。
6.血清DNA含量的测定：取血清0.1ml，加pH7.2 0 2mol/L TrisHCl缓冲液0.7ml、RNase(1mg/ml)0.2ml，37℃水浴30分钟，加EB工作液(20μg/ml)1ml，用荧光分光光度计测定荧光强度。
, http://www.100md.com
7.其他观察指标：ANA：间接免疫荧光法，抗DNA抗体：金标免疫斑点法，补体C3及C4：免疫化学比浊法，Beckman Array 360蛋白分析仪。以上检查全部为我科的常规临床检验项目。
结 果
1.DNase标准品的测定：将牛胰DNase分别稀释成10、20、30、40、50、60ng/ml，测量DNA水解环的大小(图1)，以DNase的浓度为横坐标、水解环的直径为纵坐标绘制标准曲线，未知标本可根据其水解环的大小从标准曲线上查得其DNase的浓度。
1～6：DNase标准浓度：60、50、40、30、20、10ng/ml
图1 DNase的浓度测定(单相酶扩散法)
2.SLE患者血清中DNase浓度的测定：共检测了正常人血清38份，SLE患者血清63份，其中活动期患者35例，缓解期患者28例，伴肾损害患者21例。结果见附表。SLE患者血清中DNase浓度明显低于正常人；活动期患者明显低于缓解期患者；伴肾损害患者明显低于非肾损害患者。
, 百拇医药
附表 不同病期SLE患者与正常人血清DNase浓度的测定结果 受检对象
检测例数
血清DNase浓度(±s，ng/ml)
t值
P值
健康献血员
38
51.23±3.68
6.128
<0.01
SLE患者
63
, 百拇医药
28.52±8.25
活动期
35
18.68±5.97
6.454
<0.01
缓解期
28
40.81±4.28
伴肾损害
21
15.46±5.81
7.305
, 百拇医药
<0.01
不伴肾损害
42
35.04±4.78
3.SLE患者的血清DNase浓度与DNA含量的相关性：63份患者血清用荧光分光光度法检测其DNA含量，结果35例活动期患者的血清DNA含量为(33～150)μg/ml(92.06±20.32)，28例缓解期患者的血清DNA含量为31～90μg/ml(57.18±16.13)，相关分析发现，不论在活动期还是缓解期，血清DNase的浓度都与DNA含量呈负相关(活动期：r=-0.754，P< 0.01；缓解期：r=-0.827，P< 0.01)。
4.SLE患者的血清DNase与ANA、抗DNA抗体、补体、血沉等的相关性：将SLE患者的血清DNase浓度与ANA、抗DNA抗体、补体、血沉等作直线相关分析，结果为DNase的浓度与血沉、ANA呈负相关(r分别为-0.701、-0.416，P值均< 0.01)；与C3、C4呈正相关(r分别为0.469、0.438，P值均< 0.01)；与抗dsDNA抗体无相关性(r为0.217，P >0.05)。
, 百拇医药
5.SLE患者的血清DNase水平与病情积分的相关性：直线相关分析表明，患者的血清DNase水平与病情积分呈高度负相关(r为-0.884，P< 0.01)。
讨 论
SLE的发病机理尚不完全清楚，大量研究表明DNA抗DNA免疫复合物在SLE的发病以及器官损害中起着重要作用[1，2，6]，患者血中的DNA含量比正常人高，并随病情的活动与缓解而波动，说明患者的确存在DNA的代谢异常。机体清除DNA的途径主要是通过DNase的降解作用。我们同时检测了63例SLE患者的血清DNA与DNase，发现患者的DNase浓度低于正常人，活动期患者DNase浓度低下更为明显；DNase低下的程度与DNA水平升高的程度呈负相关，提示DNase活性不足是造成血中DNA升高以及SLE发病的重要因素之一。国外学者检测了NZB/WF1狼疮鼠血清中的DNase，发现其浓度明显低于同样性别和年龄的正常小鼠， 更有意义的是小鼠先有DNase的低下(5～10周)，然后才有抗DNA抗体的产生(12～16周)[4]。本文实验发现，伴有肾损害的患者DNase浓度明显低于非肾损害，在63例患者中，血清DNase浓度最低的5例(2～8ng/ml)患者全部为伴肾损害的活动期患者；提示DNase的低下在SLE肾损害中起着重要作用。
, 百拇医药
在正常机体中，因衰老或因发生感染、炎症等，都可释放DNA到血中，这些DNA可迅速被循环中的DNase降解[7]，其半衰期仅约4分钟。在SLE患者，因其血中DNase活性低于正常水平，不能有效地处理急剧增加的DNA，于是多量的DNA在体内滞留。总结本文结果并综合文献复习，我们得出以下推理：SLE患者体内DNase活性低下，不能充分行使其水解DNA的作用，使得血循环中含DNA的自身抗原长期滞留，于是发挥免疫原性，并与抗DNA抗体结合形成免疫复合物，随血循环沉积于肾脏等组织器官，造成多系统免疫损伤。测定患者DNase活性在研究SLE复杂的免疫发病机制上具有一定意义。
参考文献
1 McCoubreyHoyer A, Okarma TB, Holman HR. Partial purification and characterization of plasma DNA and its relation to disease activity in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 1984,77∶23-34.
, 百拇医药
2 Rumore PM, Steinman CR. Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus: occurrence as multimeric complexes bound to histone. Clin Invest, 1990,86∶69-74.
3 Morimoto C, Sano H, Abe T, et al. Correlation between clinical activity of SLE and the amounts of DNA in DNA/AntiDNA antibody immune complexes. J Immunol, 1982,139∶1960.
4 Macanovic M, Lachmann PJ. Measurement of deoxyribonuclease in the serum and urine of system lupus erythemoatosusprone NZB/W mice by a new radial enzyme diffusion assay. Clin Exp Immunol, 1997,108∶220-226.
, http://www.100md.com
5 许蓓红, 许德清, 谢彦博. SLE患者BPMC表面的DNA受体及其临床意义. 中华皮肤科杂志, 1991,24∶228-231.
6 Kalsi JK, Sutton B. Structural analysis of antiDNA antibodies. Lupus,1997,6∶317-320.
7 Emlen W, Mannik M. Kinetics and mechanisms for removal of circulating singlestranded DNA in mice. J Exp Med, 1978,147∶684-699.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-06-22), http://www.100md.com
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院皮肤科
关键词：红斑狼疮；系统性；脱氧核糖核酸酶类
中华皮肤科杂志980604 【摘要】 目的 研究血清DNA酶(DNase)浓度异常在系统性红斑狼疮(SLE)发生发展中所起的作用。方法 于国内首次用单相酶扩散法检测了63例SLE患者。结果 患者血清中DNase浓度明显低于正常人；活动期患者明显低于缓解期患者；SLE伴肾损害患者低于非肾损害患者。血清DNase的浓度下降与DNA含量升高呈负相关；与血沉、ANA呈负相关；与补体C3、C4呈正相关；与病情活动积分呈负相关。结论 SLE患者由于其DNase水平低下，使得血循环中含DNA的自身抗原长期滞留，发挥免疫原性，并与抗DNA抗体结合形成免疫复合物，造成免疫损伤。患者血清DNase水平低下在SLE的发病机制中起着一定作用。
, 百拇医药
The Measurement of Deoxyribonuclease and Its Clinical Significance in Patients with SLE Zeng Fanqin, Chen Yifang, Li Boyou, et al. Department of Dermatology, Sun Yatsen Memorial Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective To study the role of abnormal concentration of DNase in the development of SLE. Methods The concentration of DNase was measured by single radial enzyme diffusion method in the sera of 63 SLE patients. Results The concentration of DNase in the patients was significantly lower than that in healthy individuals, significantly lower in patients at active stage than that in remission, and lowest in patients with lupus nephritis. The decrease of serum DNase was negatively correlated with the increase of serum DNA. The level of DNase was negatively correlated with ANA and ESR, positively correlated with C3, C4, and negatively correlated with the severity of the disease. Conclusion The above data suggest that the decrease of serum DNase makes the persistence of DNA in the blood circulation which combines with antiDNA antibody to form immune complex, resulting in autoimmune lesions. The decrease of serum DNase may play an important role in the pathogenesis f SLE.
, 百拇医药
【Key words】 Lupus erythematosus, systemic Deoxyribonucleases
已经证实系统性红斑狼疮(SLE)患者血循环中DNA水平升高[1～3]，但其升高的原因尚不清楚，有可能是因为DNA清除机制的缺陷[4]。我们用单相酶扩散法检测SLE患者血清DNA酶(DNase)的浓度，并探讨血清DNase浓度异常与DNA升高的关系以及在SLE发生发展中所起的作用。
材料与方法
1.主要试剂：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、牛胸腺DNA、牛胰DNA酶Ⅰ(DNase)、RNA酶A(RNase)：Fluka公司和Sigma公司产品；溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)、琼脂糖：华美生物工程公司产品。
2.仪器：荧光分光光度计：F-2000型，日本Hitachi公司产品；紫外透射仪：WP-1型，永嘉上塘教学仪器厂。
, 百拇医药
3.检测对象：SLE患者63例，男6例，女57例，全部为我科1997年9月至1998年3月的住院及门诊患者。所有患者均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。参照文献[5]，患者按临床症状及实验室检查评定病情活动积分，并分类为活动期患者和缓解期患者、伴肾损患者和非肾损患者。
4.正常对照组：为我市中心血站的健康献血员38例，性别及年龄均与患者组相匹配。
5.DNase的测定(单相酶扩散法)：用pH7.2 0 05mol/L TrisHCl缓冲液配1%的琼脂糖凝胶20ml，其中含牛胸腺DNA和EB分别为6mg和0.5mg，灌制凝胶板，用直径为1.5mm的打孔器于凝胶板上打孔。加入4μl样本(标准DNA或待检血清)，37℃湿盒孵育16小时，0.1mol/L的EDTA终止反应，于紫外透射仪下观察并测量DNA水解环的大小。在一定范围内，水解环的大小与DNase的浓度成正比。
6.血清DNA含量的测定：取血清0.1ml，加pH7.2 0 2mol/L TrisHCl缓冲液0.7ml、RNase(1mg/ml)0.2ml，37℃水浴30分钟，加EB工作液(20μg/ml)1ml，用荧光分光光度计测定荧光强度。
, http://www.100md.com
7.其他观察指标：ANA：间接免疫荧光法，抗DNA抗体：金标免疫斑点法，补体C3及C4：免疫化学比浊法，Beckman Array 360蛋白分析仪。以上检查全部为我科的常规临床检验项目。
结 果
1.DNase标准品的测定：将牛胰DNase分别稀释成10、20、30、40、50、60ng/ml，测量DNA水解环的大小(图1)，以DNase的浓度为横坐标、水解环的直径为纵坐标绘制标准曲线，未知标本可根据其水解环的大小从标准曲线上查得其DNase的浓度。
1～6：DNase标准浓度：60、50、40、30、20、10ng/ml
图1 DNase的浓度测定(单相酶扩散法)
2.SLE患者血清中DNase浓度的测定：共检测了正常人血清38份，SLE患者血清63份，其中活动期患者35例，缓解期患者28例，伴肾损害患者21例。结果见附表。SLE患者血清中DNase浓度明显低于正常人；活动期患者明显低于缓解期患者；伴肾损害患者明显低于非肾损害患者。
, 百拇医药
附表 不同病期SLE患者与正常人血清DNase浓度的测定结果 受检对象
检测例数
血清DNase浓度(±s，ng/ml)
t值
P值
健康献血员
38
51.23±3.68
6.128
<0.01
SLE患者
63
, 百拇医药
28.52±8.25
活动期
35
18.68±5.97
6.454
<0.01
缓解期
28
40.81±4.28
伴肾损害
21
15.46±5.81
7.305
, 百拇医药
<0.01
不伴肾损害
42
35.04±4.78
3.SLE患者的血清DNase浓度与DNA含量的相关性：63份患者血清用荧光分光光度法检测其DNA含量，结果35例活动期患者的血清DNA含量为(33～150)μg/ml(92.06±20.32)，28例缓解期患者的血清DNA含量为31～90μg/ml(57.18±16.13)，相关分析发现，不论在活动期还是缓解期，血清DNase的浓度都与DNA含量呈负相关(活动期：r=-0.754，P< 0.01；缓解期：r=-0.827，P< 0.01)。
4.SLE患者的血清DNase与ANA、抗DNA抗体、补体、血沉等的相关性：将SLE患者的血清DNase浓度与ANA、抗DNA抗体、补体、血沉等作直线相关分析，结果为DNase的浓度与血沉、ANA呈负相关(r分别为-0.701、-0.416，P值均< 0.01)；与C3、C4呈正相关(r分别为0.469、0.438，P值均< 0.01)；与抗dsDNA抗体无相关性(r为0.217，P >0.05)。
, 百拇医药
5.SLE患者的血清DNase水平与病情积分的相关性：直线相关分析表明，患者的血清DNase水平与病情积分呈高度负相关(r为-0.884，P< 0.01)。
讨 论
SLE的发病机理尚不完全清楚，大量研究表明DNA抗DNA免疫复合物在SLE的发病以及器官损害中起着重要作用[1，2，6]，患者血中的DNA含量比正常人高，并随病情的活动与缓解而波动，说明患者的确存在DNA的代谢异常。机体清除DNA的途径主要是通过DNase的降解作用。我们同时检测了63例SLE患者的血清DNA与DNase，发现患者的DNase浓度低于正常人，活动期患者DNase浓度低下更为明显；DNase低下的程度与DNA水平升高的程度呈负相关，提示DNase活性不足是造成血中DNA升高以及SLE发病的重要因素之一。国外学者检测了NZB/WF1狼疮鼠血清中的DNase，发现其浓度明显低于同样性别和年龄的正常小鼠， 更有意义的是小鼠先有DNase的低下(5～10周)，然后才有抗DNA抗体的产生(12～16周)[4]。本文实验发现，伴有肾损害的患者DNase浓度明显低于非肾损害，在63例患者中，血清DNase浓度最低的5例(2～8ng/ml)患者全部为伴肾损害的活动期患者；提示DNase的低下在SLE肾损害中起着重要作用。
, 百拇医药
在正常机体中，因衰老或因发生感染、炎症等，都可释放DNA到血中，这些DNA可迅速被循环中的DNase降解[7]，其半衰期仅约4分钟。在SLE患者，因其血中DNase活性低于正常水平，不能有效地处理急剧增加的DNA，于是多量的DNA在体内滞留。总结本文结果并综合文献复习，我们得出以下推理：SLE患者体内DNase活性低下，不能充分行使其水解DNA的作用，使得血循环中含DNA的自身抗原长期滞留，于是发挥免疫原性，并与抗DNA抗体结合形成免疫复合物，随血循环沉积于肾脏等组织器官，造成多系统免疫损伤。测定患者DNase活性在研究SLE复杂的免疫发病机制上具有一定意义。
参考文献
1 McCoubreyHoyer A, Okarma TB, Holman HR. Partial purification and characterization of plasma DNA and its relation to disease activity in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 1984,77∶23-34.
, 百拇医药
2 Rumore PM, Steinman CR. Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus: occurrence as multimeric complexes bound to histone. Clin Invest, 1990,86∶69-74.
3 Morimoto C, Sano H, Abe T, et al. Correlation between clinical activity of SLE and the amounts of DNA in DNA/AntiDNA antibody immune complexes. J Immunol, 1982,139∶1960.
4 Macanovic M, Lachmann PJ. Measurement of deoxyribonuclease in the serum and urine of system lupus erythemoatosusprone NZB/W mice by a new radial enzyme diffusion assay. Clin Exp Immunol, 1997,108∶220-226.
, http://www.100md.com
5 许蓓红, 许德清, 谢彦博. SLE患者BPMC表面的DNA受体及其临床意义. 中华皮肤科杂志, 1991,24∶228-231.
6 Kalsi JK, Sutton B. Structural analysis of antiDNA antibodies. Lupus,1997,6∶317-320.
7 Emlen W, Mannik M. Kinetics and mechanisms for removal of circulating singlestranded DNA in mice. J Exp Med, 1978,147∶684-699.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-06-22), http://www.100md.com